全 文 ：Science of Sericulture 蚕业科学
收稿日期:2015 － 05 － 24 接受日期:2015 － 07 － 18
资助项目:“十二五”国家科技支撑计划项目(No． 2012-BAD36B07) ，
现代农业产业技术体系建设专项(No． CAＲS-22) ，公益性
行业(农业)科研专项(No． 201403064) ，广州市珠江科技
新星专项(No． 2013J2200085) ，广东省自然科学基金项目
(No． 2014A030313569) ，广东省社会发展攻关项目(No．
2013B022000085)。
第一作者信息:翁旭东(1991 －) ，男，硕士研究生。
E-mail:laoweng16@ 163． com
通信作者信息:温露，博士，副教授。
E-mail:gdpuwen@ 126． com
刘凡，博士，助理研究员。
Tel:020-87236897，E-mail:liufan1234@ 126． com
* Corresponding author． E-mail:gdpuwen@ 126． com
2015，41(6) :1071 － 1076
ISSN 0257 － 4799;CN 32 － 1115 /S
DOI:10． 13441 / j． cnki． cykx． 2015． 06． 016
应用响应面法优化超声波辅助乙醇提取桑根皮总黄酮的工艺
条件
翁旭东1，2 刘 凡2 刘 翀3 温 露1 邹宇晓2 廖森泰2 肖更生2
(1广东药学院，广州 510006; 2广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，农业部功能食品重点实验室，广东省农产品加工重点实验室，
广州 510610; 3广东省农业科学院农业经济与农村发展研究所，广州 510640)
摘 要 黄酮是桑根皮中的重要活性成分，建立高效、便捷提取桑根皮总黄酮的工艺技术，有利于对桑根皮药用活性成分的
深度开发。基于超声波辅助乙醇提取桑根皮总黄酮的单因素试验结果，进一步采用 Box-Behnken中心组合设计结合响应面分
析法优化提取工艺参数，选择提取时间、原料质量浓度和乙醇体积分数作为考察因子，以桑根皮总黄酮得率作为响应值，利用
Design Expert软件对数据进行回归分析并结合验证试验结果，确定桑根皮总黄酮的最佳提取工艺条件为提取时间 1. 6 h、乙醇
体积分数 80%、原料质量浓度 0. 04 g /mL。在此工艺条件下提取总黄酮的得率为 3. 63%，与预测总黄酮得率(3. 71%)的相对
误差为 2. 16%，说明优化的工艺条件具有一定的实用价值。
关键词 桑根皮;总黄酮;乙醇浸提;超声波;Box-Behnken中心组合设计;响应面法
中图分类号 Ｒ284. 2;S886. 9 文献标识码 B 文章编号 0257 － 4799(2015)06 － 1071 － 06
Process Optimization for Ultrasonic-assisted Ethanol Extraction of To-
tal Flavonoids from Mulberry Ｒoot Barks by Ｒesponse Surface Meth-
odology
Weng Xudong1，2 Liu Fan2* Liu Chong3 Wen Lu1* Zou Yuxiao2 Liao Sentai2 Xiao Gengsheng2
(1 Guangdong Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China;2Sericultural ＆ Agri-food Ｒesearch Institute，
Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Functional Foods，Ministry of Agriculture，Guangdong
Key Laboratory of Agricultural Products Processing，Guangzhou 510610，China;3 Institute of Agricultural Economic and
Ｒural Development，Guangdong Academy of Agricultural Sciences，Guangzhou 510640，China)
Abstract Flavonoids are important active components of the mulberry root barks． Establishing an efficient and conven-
ient extraction technology of total flavonoids from the root barks of mulberry will facilitate in-depth development of the me-
dicinal active ingredients in mulberry root barks． Based
on the single-factor experiment results from ultrasound-
assisted ethanol extraction of total flavonoids from the root
barks of mulberry，Box-Behnken central composite de-
sign combined with response surface analysis methodolo-
gy (ＲSM)was further used to optimize the extraction
technological parameters． By selecting extraction time，
mass concentration of raw material and volume fraction of
ethanol as the evaluation indexes，and the yield of total
flavonoids from mulberry root barks as response value，
Design Expert software was applied to conduct regression
analysis． Combined with validation tests，the optimized
1072 蚕 业 科 学 2015;41 (6)
extraction process was determined as follows:extraction time 1. 6 h，volume fraction of ethanol 80%，and mass concen-
tration of raw material 0. 04 g /mL． Under this optimal condition，the yield of total flavonoids was 3. 63%，having a relative
error of 2. 16% with the predicted value (3. 71%)． The result indicated that the optimized extraction process condition
has certain practical value.
Keywords Mulberry root bark;Total flavonoids;Ethanol extraction;Ultrasonic;Box-Behnken central composite design;
Ｒesponse surface methodology
桑根皮是传统中药材，《中国药典》记载其具有泻肺
平喘、利水消肿之功效，常用于消炎、利尿、解热、
祛痰镇咳等［1］。桑根皮中含有黄酮、甾醇、生物碱、挥
发油等成分［2］，其中黄酮类化合物的含量较高，且大
多数桑根皮黄酮的结构中都具有异戊烯基单元，常见
的有桑皮根素、桑酮醇、桑根酮醇、桑根醇等［3］，药理
试验表明此类黄酮类化合物在降血糖、降血压、抗病
毒、抑菌等方面都表现出良好的生理活性［4 － 6］。
在天然产物有效成分的提取方面，超声波辅助
提取技术已被广泛应用，由于超声波所具有的机械
效应、空化效应及热效应，使得植物细胞内物质的释
放、扩散和溶解速度加快，药效活性成分浸出量增
加。徐应淑等［7］通过比较微波、超声波及传统加热
回流等辅助乙醇提取方法对桑白皮总黄酮得率的影
响，发现超声波辅助提取法和加热回流法效果相近，
二者的提取效果均优于微波辅助提取法，而且采用
超声波辅助提取桑根皮总黄酮的工艺技术操作更为
简便，无需对样品进行加热，可缩短提取时间，提高
提取效率。
响应面分析方法作为一种结合数学与统计学的
渐进近似的优化方法，主要通过考察多个变量对响应
值的综合影响进行建模和分析，最终优化该响应值。
近年来，响应面法在食品科学、工程学、生态学等领域
得到了广泛的应用［8 － 9］。本试验采用超声波辅助乙
醇提取的方法提取桑根皮总黄酮，通过响应面法优化
提取工艺条件，研究多种因素之间的交互作用，解决
传统优化方法试验较繁琐、影响因素相互关系不明确
以及数据变化规律难以确定等问题，为建立桑根皮中
药用活性成分的高效、快速提取工艺奠定试验基础。
1 材料与方法
1. 1 材料及主要试剂和仪器
桑根皮采自国家桑树种质资源华南分圃(广
州) ，桑品种为塘 10。将采集的桑根皮用鼓风干燥
箱干燥后粉碎成粉末(过 60 目) ，备用。
芦丁标准品(分析纯)购自广州市齐云生物技
术有限公司。UV-1800 紫外-可见分光光度计(日本
岛津公司) ，SB25-12DTD 超声波清洗机(宁波新芝
生物科技股份有限公司)。
1. 2 桑根皮总黄酮的提取
参照文献［10］的方法。精密称取干燥的桑根
皮粉末 1. 00 g，置于 50 mL离心管中，加入一定浓度
的乙醇溶液经超声波辅助提取，超声波功率设定为
450 W。将提取液 6 000 r /min离心 15 min后，取上
清液，定容于 25 mL容量瓶中备用。
1. 3 桑根皮总黄酮得率的测算方法
1. 3. 1 芦丁标准工作曲线的绘制 参照文献［11 －
12］的 Al(NO3)3-NaNO2络合分光光度法。精密称取
50 mg芦丁标准品溶于体积分数为 60%的乙醇中，定
容至 50 mL，40 ℃水浴溶解，摇匀，配制成质量浓度为
1 mg /mL 的芦丁标准液。分别吸取 0. 4、0. 6、0. 8、
1. 0、1. 2、1. 4、1. 6 mL芦丁标准液于 25 mL容量瓶中，
加入 30%乙醇 10 mL，摇匀，静置 6 min，继续加入 50
g /L NaNO2溶液 1 mL，摇匀，静置 6 min 后加入 1 mL
质量浓度为 100 g /L 的 Al(NO3)3溶液，摇匀，静置 6
min后加入 10 mL浓度为 1 mol /L的 NaOH溶液，再
加蒸馏水定容，摇匀后静置 15 min。以不加样品组作
为空白对照，测定 D(510 nm)值，以芦丁标准液的质
量浓度(mg /mL)为横坐标，以溶液的吸光度值为纵坐
标绘制标准曲线，得到线性回归方程为 Y = 11. 612 0X
－0. 008 6，Ｒ2 =0. 999 6。
1. 3. 2 总黄酮得率的测算 参照文献［13］的方
法。准确吸取适量样品液于 25 mL 容量瓶中，按照
“1. 3. 1”的方法测定吸光度值，将测得的吸光度值
代入回归方程，求出样品溶液中总黄酮质量浓度
(mg /mL) ，再依据以下公式计算桑根皮总黄酮得
率。桑根皮总黄酮得率 =(c × V × N)/M × 100%。
式中:c为样品溶液中总黄酮质量浓度(mg /mL) ;V
为测定时定容的总体积(mL) ;N 为样品的稀释倍
数;M为原料桑根皮粉的质量(mg)。
第 6 期 翁旭东等:应用响应面法优化超声波辅助乙醇提取桑根皮总黄酮的工艺条件 1073
1. 4 提取工艺条件的单因素试验
参考文献［14］的方法。以桑根皮总黄酮得率
为考察指标，设定乙醇体积分数 60%、提取时间 1. 5
h、原料质量浓度 0. 04 g /mL 作为基本条件，分别对
上述 3 个因素进行单因素试验，考察各单因素对桑
根皮总黄酮得率的影响。每组试验设 3 个重复。
1. 5 提取工艺条件的响应面优化试验
根据中心组合设计原理，结合响应面分析方
法［15］，以提取时间、原料质量浓度、乙醇体积分数作
为自变量，以总黄酮得率为响应值，利用 Design Ex-
pert 8. 0. 6 软件，根据 Box-Benhnken 中心组合设计
原理进行三因素三水平试验设计，并对数据进行拟
合。试验因素和水平设计见表 1。
表 1 桑根皮总黄酮提取工艺条件响应面试验的因素和水
平设计
Table 1 Design of factors and levels of response surface experi-
ment on extraction technological conditions of total flavonoids
from the root barks of mulberry
水平
Level
因素 Factor
提取时间
/ h
Extraction
time
(A)
原料质量浓度
/ (g·mL －1)
Mass concentration
of raw material
(B)
乙醇体积分数
/ %
Volume fraction
of ethanol
(C)
－ 1 1. 0 0. 03 60
0 1. 5 0. 04 80
1 2. 0 0. 05 100
1. 6 数据统计分析
运用 Design Expert 8. 0. 6 和 SPSS v20. 0 软件对
试验所得数据进行统计分析，组间差异显著性分析
采用 LSD法，显著性水平 P ＜ 0. 05。
2 结果与分析
2. 1 提取工艺条件对桑根皮总黄酮得率的影响
2. 1. 1 原料质量浓度 在乙醇体积分数为 60%、
提取时间 1. 5 h 的条件下，分别设置原料质量浓度
为 0. 02、0. 03、0. 04、0. 05、0. 06 g /mL 进行提取试
验，考察原料质量浓度变化对桑根皮总黄酮得率的
影响。由图 1 可见，随着原料质量浓度的增大，总黄
酮得率先缓慢增大后减小，在原料质量浓度为 0. 04
g /mL 时达到最大值。因此，选择原料质量浓度为
0. 04 g /mL。
乙醇体积分数 60%，提取时间 1. 5 h。柱图中字母不同，
表示组间差异显著(P ＜ 0. 05)。图 2 ～ 3 同。
Volume fraction of ethanol was 60%，extraction time was 1. 5 h．
Different letters above the bar indicate significant difference
between treatment groups (P ＜ 0. 05)． The same in Fig． 2 and 3.
图 1 原料质量浓度对桑根皮总黄酮得率的影响
Fig. 1 Effect of mass concentration of raw material on the yield
of total flavonoids from the root barks of mulberry
2. 1. 2 提取时间 在乙醇体积分数 60%、原料质
量浓度 0. 04 g /mL的条件下，调整提取时间为 0. 5、
1. 0、1. 5、2. 0、2. 5 h分别进行提取试验，考察提取时
间对桑根皮总黄酮得率的影响。由图 2 可见，在提
取时间低于 1. 5 h 时，随着提取时间的延长，桑根皮
总黄酮得率增加较明显，在提取时间超过 1. 5 h，桑
根皮总黄酮的得率变化不大。综合考虑生产成本及
实用性等因素，选择提取时间为 1. 5 h。
乙醇体积分数 60%，原料质量浓度 0. 04 g·mL －1。
Volume fraction of ethanol was 60%，the mass concentration
of raw material was 0. 04 g·mL －1 ．
图 2 提取时间对桑根皮总黄酮得率的影响
Fig. 2 Effect of extraction time on the yield of total
flavonoids from the root barks of mulberry
1074 蚕 业 科 学 2015;41 (6)
2. 1. 3 乙醇体积分数 在原料质量浓度 0. 04 g /mL、
提取时间 1. 5 h的条件下，分别以体积分数为 20%、
40%、60%、80%、100%的乙醇进行提取试验，考察
提取溶剂中的乙醇含量对桑根皮总黄酮得率的影
响。由图 3 可知，桑根皮总黄酮得率随着乙醇体积
分数的增加呈现先增大后减小的趋势，在乙醇体积
分数为 80%时达到最大值，说明乙醇体积分数过大
或过小都不利于桑根皮总黄酮的提取，因此选择乙
醇体积分数为 80%。
原料质量浓度 0. 04 g·mL －1，提取时间 1. 5 h。
Mass concentration of raw material was 0. 04 g·mL －1，
and extraction time was 1. 5 h．
图 3 乙醇体积分数对桑根皮总黄酮得率的影响
Fig. 3 Effect of ethanol concentration on the yield of total
flavonoids from the root barks of mulberry
2. 2 响应面试验优化的提取工艺条件
在单因素试验的基础上，以提取时间(A)、原料
质量浓度(B)、乙醇体积分数(C)作为考察因子，采
用 Box-Behnken 中心组合设计结合响应面分析法，
以桑根皮总黄酮得率作为响应值(Y) ，得出的试验
结果见表 2。运用 Design Expert 8. 0. 6 软件对各因
素进行回归拟合，得二次多项回归方程:Y = 3. 260
+ 0. 300A + 0. 150B － 0. 036C － 0. 020AB － 0. 028AC
+ 0. 035BC － 0. 430A2 + 0. 260B2 － 0. 340C2。由方
差分析结果(表 3)可知，建立的回归模型 P ＜ 0. 000
1，达到极显著水平，同时失拟项不显著(P =
0. 288 7) ，表明该模型有较高的可信度。建立的模
型回归系数 Ｒ2 = 0. 997 6，说明该回归模型预测值与
试验值相接近，拟合度好，自变量与响应值之间线性
关系显著，可用该模型预测桑根皮总黄酮得率。
由表 3 中的方差分析结果还可知，一次项提取
时间(A)、原料质量浓度(B)、乙醇体积分数(C)以
及二次项 A2、B2和 C2均为极显著项(P ＜ 0. 01) ;交
互项中 BC为显著项(P ＜ 0. 05)。结合图 4 与图 5
中的响应面等高线分布，可发现交互项 BC 的等高
线密集，且呈现交互性的明显椭圆形。以上分析都表
明交互项 BC达到显著水平，即原料质量浓度和乙醇体
积分数的交互作用对桑根皮总黄酮得率具有显著影
响，而交互项 AB与 AC对桑根皮总黄酮得率的影响未
达到显著水平，与前面的方差分析结果相符。
根据建立的回归模型，得到超声波辅助乙醇提
取桑根皮总黄酮的最佳工艺条件为提取时间 1. 66
h、原料质量浓度 0. 04 g /mL、乙醇体积分数
79. 70%，预测桑根皮总黄酮得率为 3. 71%。通过
验证试验对实际操作便利性的考察，最终将提取工
艺条件修正为:提取时间 1. 6 h，原料质量浓度 0. 04
g /mL，乙醇体积分数 80%。采用此工艺条件进行 6
次平行试验，得出桑根皮总黄酮得率的平均值为
3. 63%，与模型理论预测值(3. 71%)十分接近(相
对误差 2. 16%) ，所建回归模型与实际情况拟合良
好，说明本试验优化的工艺条件结果可靠。
表 2 桑根皮总黄酮提取工艺条件的 Box-Benhken 中心组
合设计及试验结果
Table 2 The experimental results of extraction technological
conditions of total flavonoids by Box-Benhken central composite
design method
序号
No.
提取时间
Extraction
time
(A)
原料质量浓度
Mass concentration
of raw material
(B)
乙醇体积分数
Volume fraction
of ethanol
(C)
总黄酮得率
/ %
Yield of total
flavonoids
(Y)
1 0 0 0 3. 28
2 1 1 0 3. 52
3 0 0 0 3. 28
4 0 1 － 1 3. 35
5 0 0 0 3. 22
6 0 0 0 3. 27
7 0 1 1 3. 31
8 0 0 0 3. 26
9 0 － 1 1 2. 93
10 1 0 － 1 2. 83
11 － 1 0 － 1 2. 19
12 － 1 1 0 2. 95
13 － 1 0 1 2. 21
14 1 0 1 2. 74
15 1 － 1 0 3. 27
16 － 1 － 1 0 2. 62
17 0 － 1 － 1 3. 11
第 6 期 翁旭东等:应用响应面法优化超声波辅助乙醇提取桑根皮总黄酮的工艺条件 1075
表 3 桑根皮总黄酮得率预测回归模型的方差分析
Table 3 Variance analysis of regression model for prediction of the yield of total flavonoids from the root barks of mulberry
变异来源
Source of variation
总方差
Sum of square
自由度
ν
均方
Mean square
F值
F value
P值
P value
模型 Model 2. 44 9 0. 27 326. 33 ＜ 0. 000 1
A 0. 71 1 0. 71 861. 00 ＜ 0. 000 1
B 0. 18 1 0. 18 217. 05 ＜ 0. 000 1
C 0. 01 1 0. 01 12. 68 0. 009 2
AB 1. 60 × 10 －3 1 1. 60 × 10 －3 1. 93 0. 207 4
AC 3. 03 × 10 －3 1 3. 03 × 10 －3 3. 65 0. 097 8
BC 4. 90 × 10 －3 1 4. 90 × 10 －3 5. 91 0. 045 4
A2 0. 77 1 0. 77 926. 82 ＜ 0. 000 1
B2 0. 27 1 0. 27 330. 80 ＜ 0. 000 1
C2 0. 49 1 0. 49 594. 73 ＜ 0. 000 1
残差 Ｒesidual 5. 81 × 10 －3 7 8. 29 × 10 －4
失拟项 Lack of fit 3. 33 × 10 －3 3 1. 11 × 10 －3 1. 79 0. 288 7
纯误差 Pure error 2. 48 × 10 －3 4 6. 20 × 10 －4
总离差 Cor total 2. 44 16
Ｒ2 = 0. 997 6，Adeq precision = 60. 387，Ｒ2adj = 0. 994 6，CV = 0. 95%
图 4 提取工艺中的 3 个因素对桑根皮总黄酮得率影响的三维响应曲面图
Fig. 4 Three-dimensional response surface of the effect of three factors in extraction process on the yield of
total flavonoids from the root barks of mulberry
1076 蚕 业 科 学 2015;41 (6)
图 5 提取工艺中的 3 个因素对桑根皮总黄酮得率
影响的二维等高线图
Fig. 5 2D contour line figure of the effect of three factors
in extraction process on the yield of total flavonoids
from the root barks of mulberry
3 结论
本试验采用响应面分析法优化超声波辅助乙醇
提取桑根皮总黄酮的最佳提取工艺条件为:提取时
间 1. 6 h，原料质量浓度 0. 04 g /mL，乙醇体积分数
80%。采用此优化的工艺条件提取桑根皮总黄酮的
得率达到 3. 63%。结果表明，采用响应面分析法优
化的桑根皮总黄酮提取工艺条件具有较好的实际应
用价值，为桑根皮药用活性成分的深度开发利用奠
定了一定的试验基础。
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