全 文 ：一 32 一 中国食用菌 E D BI LE F U N GI O F C H IN 八 V lo .2 5 , N 。 -6
,rT C法在亮菌生物量测定中的应用
李 赓 , 沈业寿 ’ , 郑 媛
(安徽大学生化微生物研究所 , 安徽 合肥 23 0 3 9)
摘 要 : 采用 T T C 法测定亮菌的 生物量 , 通过对亮 菌
菌丝体和菌质体 的测定 , 研究发现T c 脱氢酶的 活性与菌体 生物量间成线性关系 , 可 以通过计算脱氢酶的活性来浏
定亮 菌的生物量 。 平菇 和香菇 2种 真菌的脸证性 实脸结果
也证明 了这一点 。 结论 : T T c 法适用亮菌的生物量测 定 。
关键词 : 亮菌 ; 生物量 ; 竹 c 法中图分类号 : 5 6 46乡 文献标识码 : A
文章编号 : 10 0 3一 ( 53 10 ) 20 0 6 ( 06 ) 一0 32 一0 3
目前真菌菌体生物量的测定尤其是固态生物量 的测定
常用方法主要是麦角固醇法和几丁质法 , 由于两种方法均
存在着提取 困难 、 提取条件难得一致和对实验仪器设备有
一定的要求等缺点 , 给研究者带来很多不便 。 我们运用生
物体组织细胞中的脱氢酶活性与细胞活力呈正相关性的
T I℃ 法原理 1 , 探讨此法在生长期的亮菌生物量测定中的
应用 。 亮菌在培养生长期 , 细胞均处于旺盛生长 , 由于
T T C 脱氢酶的活性与细胞活力呈正相关性 , 必然反映出酶
活力与菌体生物量间的关系 。 为确定亮菌液态发酵和固态
发酵菌丝体的 T r C 脱氢酶活性是否与生物量间呈相关性 ,
本实验设计在最佳反应体系 冈 , 研究最佳反应条件下的菌
体生物量与 TT C 脱氢酶活性的关系 。 为了确定其方法 的
可行性 , 我们还通过对平菇和香菇菌丝体生物量的测定来
加 以验证 。 研究证实 , 在我们所给定的反应体系和研究获
得的最佳反应条件下 , 菌休生物量与 .r l℃ 脱氢酶活力呈
现线性关系 。 采用 T T C 法测定真菌的生物量具有 简单 、
快速等优点 。 现报道如下 。
1 实验材料 -
1
.
1 供试菌株
亮菌 4石20 8 菌株 、 平菇 .4 11 43 菌株和香菇 .4 5 129 菌
株均由本实验室提供 。
1
.
2 供试试剂
T T C (上海化学试剂一广进 口分装 ) 、 乙酸乙醋 (上海
申博有 限公司 ) 、 连二亚硫酸钠 (中国医药公 司北京 采购
站 ) , 其它试剂均 为市购分析纯或化学纯 。
13 供试仪器
U V一2 0 可见一紫外分光光度计 ( 日本岛津公司 ) ,
ZH W Y
一 lZ lB 控温调速式摇床 (上海智城公 司 ) , D K一 S D
型电热恒温水槽 (上海精宏实验设备仪器有限公司 ) 。
1
.
4 供试培养基
.1 .4 1 固戮煽湛 玉米粉 2 0 9 、 山芋粉 5崛 , 蒸馏水 1侧刃 n l L 。
1.4 2 液态培养基 葡萄糖 1% 、 蔗糖 l % 、 酵母膏 1% 、 %
KH Z印月 .0l % 、 , .0 5%M 爵氏 .0 05 %
、 蒸馏水 1 仪刃面工 O
2 实验方法
.2 1 反应体系的建立 见我们先前的报道 阴 。
2 2 反应条件的确定 以不同菌株的液态发酵菌丝体为试
验材料 , 从温度 、 pH 值和反应时 间 3方面进行研究 同 ,
以亮菌丝体为例按招 , 进行正交实验 (见表 1 ) 。
.2 3 菌体生物量的测定方法
.2 3
.
1 .0 5%竹 C 液的配置 称取 19竹 C , 加少量乙醇溶解 ,
表 1 亮菌菌丝体反应最佳条件的正交实验因素
水平 p H 温度 ( ℃ ) 时间 拓 )
1 8 35 6
2 7 5 30 4
3 7 25 2
在加 p 7H ) (实验获得的最佳声 值 ) 的磷酸钠缓冲液至
Zo
l ll L (现配现用 ) ; 磷酸钠缓冲液 ( p l l7 5) , 分别配制
田 M 的 N a Z HpO4, N a H Zp o月溶液 , 以 8暇 6的比例混合县阿 。
.2 3 .2 标准 曲线的制作 在小烧杯中加人 .0 4 m L p 7H .5 的
.0 5% 的 T T C 溶液 , 2 0t l止 的乙酸乙酷 和少量还原剂连二亚
硫酸钠 , 然后混合摇动使生成红色的 FT , 用移液管分别
吸取红色溶液 .0 25 、 .0 5 、 L O 、 l j 和 Z o n l L , 加人 乙酸乙
醋定容至 smL , 在 4 85 lun 处测相应的光密度值 , 制作标
准曲线 。
.2 .3 3 菌体生物量的测定 分别称取一定量的菌丝体 (或
菌质体 ) , 放置于 S l l l L E P管中 , 各空 白组预先于沸水浴
中加热 10 1 111 1 1 以灭活细胞 。 然后加人各自重量 2 倍体积
叫 .7 5 的 了T℃ 溶液 , 每组设 3 个重复 。 均放置于实验获
得 的最佳温度的水浴锅中水浴 h2 , 取 出组织 , 用滤纸 吸
干 T r C 液 , 放人研钵中 , 加入 3 j〕 IL 乙酸 乙酷进行研磨 ,
4 0( 犯中m 离心收集上清红色液体 , 沉淀物再加少量乙酸
乙醋洗提 , 反复 5 次 , 至不再出现红色液为止 。 合并洗提
液并定容至 巧m L , 混匀后吸取各洗提液 s mL , 4 85 ~ 处测吸光值 , 对照标准曲线 , 计算 T T C 脱氢酶活性 , 作 图
以考察菌体生物量与 竹C 脱氢酶活性的关系 。
脱氢酶活性的定义 : 一定量的鲜菌体 , 在一定温度和
p H 下 , 与竹c 溶液反应单位时间内还原所生成的吓量
( 1二 l林盯别丫 r ) 。
3 实验结果
.3 1 最佳反应条件
作者简介 : 李赓 ( 19 81 一 ) 安徽人 硕士研究生 , 现从事生物化学与分子生物学研究
食通讯作者 : 硕士生导师 , 教授 。 E月朋让 hs ys h @ ha .u ed .u cn elT : 05 51 一51 07 57 4
收稿 日期 : 2以拓一四一 21
第 2 5卷 第 6期 李赓 , 等 : 叨℃ 法在亮菌生物量测定中的应用 一 3 3 一
由表 2 可知 , 在给定的反应体系条件下 , 亮菌的最佳
反应条件为 叫 的极差 >温度 的极差 > 时间的极差 , 即 p H
和温度影响显著 , 反应时间次之 , 适宜条件为 p 7H .5 , 温
度30 ℃ , 反应时 间 h2 。 平菇和香菇 的最佳反应条件 , 除
p H 和时 间与亮菌 的实验结果较为一致外 , 影响最大 的是
反应温度 。 平菇的最佳温度在 40 ℃ 、 香菇在 35 ℃ 。
表 2 亮菌菌 丝体 T丁C 反应最佳条件的正交实验结果
序号 p H 温度 ( ℃ ) 时间 ( h)
l l
2 l
3 1
4 2
5 2
6 2
7 3
8 3
9 3
K I 1 0 8 6
一
3 3 3
KZ 156 .6 3 3
3K 63 6
.肠 7
R二 _ 夕2 9 .肠 6
1
2
3
10 4 7 6 6 7
13 5 3
.
33
8 8 8 3 3 3
_ 了月〔15 . 0以 )
l
2
3
3
l
2
2
3
l
1 1 3 4
一
3 3 3
1 1 2 5 3 3
1 0 2 9
.肠 7
1《协石仅i
吓生成量 ( 卜 g )
10 7 5
13 87
797
15 32
17 5 6
14 1 1
5 3 6
:;:
K 为均值 , R 为极差
.3 2 亮菌菌体重量与 T T C脱氮酶活性的关系
从图 1 的 结果可 以 看出 , 亮菌菌丝体或 菌质体
( .0 25 动 .5 9 ,.0 75 5,1 . 05, 1一 25 9 ) 测得的 叨℃ 脱氢酶活性与其重量之 间呈直线性关系 。 所不同 的只是由于菌质体中的
菌丝体生物量偏少 , 其斜率必然偏大 , 相 同重量 的菌质
体所测得的 T T〔: 脱氢酶活性偏低 。 因此 , 拢们完全可以
通过制作液态发酵菌体的 T r C 酶活标准曲线 , 再测 出固
态发酵菌质体的酶活 , 通过查标准曲线 , 计算出菌质体中菌
丝体的真正生物量 。 也可以通过下列计算公式计算获得 。
计算公式 : 菌质体中菌丝体生物量 (鲜重 g ) =脱氢酶活
力 ( u) xA ( A 为菌丝体钾 c 脱氢酶活性标准曲线的斜率 )
3 3 菌龄对叨℃法测定结果 的影响
亮菌的液态发酵 , 在我们的实验条件下 培养周期一般
为 7 一 s d , 为 了考察培养菌龄对 T I℃ 法测定结果的影 响 ,
我们对不同菌龄 的亮菌菌丝体进行了 T 八二脱氢酶活性的
测定 , 结果见表 3 。
从表 3 的结果可 以看出 , 在亮菌菌 丝体的旺盛生长
期 , 其 T r C 脱氢酶的活性变化不大 , 但随着菌丝体的老
化和 自溶 ( 9一 l o d) 厂】T C 脱氢酶活性明显下降 。
3 .4 验证实验
平菇及香菇的菌丝体生物量测定是在各 自正交实验取
得的最佳反应条件基础上进行 的 。 从图 2 的结果可以看
出 , 测得 的 T T C 脱氢酶活性与两供试菌株的菌丝体鲜重
之间同样呈直线关系 , 不同菌种间的差异只表现在斜率的
大小 。 证明竹 c 法用来测定生长期菌丝体的生物量是完
全可行的 。
4 讨论
通过亮菌 、 平菇和香菇 3 种真菌 的菌丝体生物量与
竹C 脱氢酶活性的关系研究 , 结果表明厂 IT 〔:脱氢酶活性
与菌丝体的鲜重 间呈正 比例线性关系 。 我们可以 用亮菌或
其它丝状真菌生长期 的菌丝体的生物量与 竹C 脱氢酶活性之间的这种正相关性 , 通过制作液态发酵菌丝体的生物
量与 T T ( : 脱氢酶活性的关系曲线 , 或根据关系曲线得到
的斜率 , 可较准确的测定出该菌固态发酵生长期的菌质体
中的菌丝体生物量 (鲜重 ) 。 采用竹C 法测定真菌菌体生
物量比麦角固醇法和几丁质法简单 、 快速 、 经济 、 准确 。
在使用本方法时 , 由于供试菌株的生物学特性间的差
异 , 除通过我们 的实验证实其最适合于 口仃C 脱氢酶反应
的 p H 均为 .7 5 外 , 其影响因素最大的是温度 , 因此 , 对
于不 同菌株 , 必需通过研究确定酶反应最佳作用温度后 ,
方可进行实验 。
本方法只适用于真菌长期的菌体生物量的测定 , 不适
y 二 0 0O l l x
RZ = 0
.
9 9 7
. 菌丝体 A 菌质体
y = 0
.
0 0 0 8盆
2R
二 0 . 9 9 6
今平菇
盛香菇
蕊2 = 0 . 0 0 0 6 x竺 0 。 9 9 6 7
y 二 0 . 00 0 5 x
扩 二 0 . 习97 6
ǎJ翻逗攀劝粗
TTC脱氢醉活性 ( u )
. J . . ~ ~~ . ` . . . . ~ . `
5 0 0 10 0 0 1 5 0 0 2 0 0 0 2 5 0 0
图 1 竹 C脱氢酶活性与亮菌菌体质量的关系 一 T C脱氢菊活性 (u)50 0 10 0 0 1 5 00 2 0 0 0 2 50 0 3 0 00
4,` 1工864几乙0L仪.0.0氏
图2 T C脱氢酶活性与两种真菌菌丝体质量的关系
培养菌龄与亮菌菌丝体 丁丁 C 脱氢酶活性的关 系
r.l|
r
l
.
|仪落0招州一8创4201 .表
0onó
ǎ理暇俱教妞钮根
菌 龄 ( d)
脱氢酶活性 ( u ) 175 5 17 53 17 49 17 56 17 6 0 l 69()
塑
14 , 5
注 : 测 定的菌丝体鲜重为 19
合于衰老期的菌体生物量的测定 , 有无其它影响因素 , 有
待进一步研究 。
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(下转第 3 5 页 )
第 25 卷 第 6期 刘鸿高 , 等 : 不同培养基对 巨大 口蘑菌丝生长的影响 一 3 5 一
者之间差异不显著 。 3 2 巨大 口蘑菌丝体生长培养基有特别的要求 和选择性 ,
3 结论 培养基 中加人不同营养成分 , 改变了原来的营养环境 , 有
31 巨大口蘑培养基以 PD A +0 1 效果最佳 。 利于该菌丝体的生长 。 如何使 巨大 口蘑菌丝体生长周期缩
表 3 5 种培养基上巨大口蘑菌丝长势分析
培养基 X 一 E X 一 B X 一 A X 一 D
P D A + 0 1
P D A + 9 2 0
P O A + V B
PD A + V C
P D A
* 为差异极其显著
2名2 8
2 3 7 8
2 3 18
1 7 97
1
一
7 03
1
.
1 25 * *
0石 75 * 习`
0石 15 * *
a O94
1 0 3 1* *
0
.
5 8 1
* *
0
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52 1*
*
0石10 出 *
0
一
0 6 0
0
.
4 50 * *CDBEA
注
短 , 开发利用这一珍稀物种 , 走规模化道路 , 将近一步探讨 。
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(上接第 3 页 )
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