全 文 ：第 28卷 ,第 3期 光　谱　实　验　室 Vol . 2 8 , No . 3
2 0 1 1年 5月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory May , 2 0 1 1
珙桐叶总黄酮提取工艺及体外抗氧化性①
① 国家自然科学基金资助项目 ( 30670209) ;四川省科技厅应用基础项目 ( 05 JY029-107)
② 联系人 ,手机: ( 0) 18980131978; E-mail: jialing jiangnz@ 126. com
作者简介:张悦 ( 1983— ) ,女 ,河南省南阳市人 ,硕士研究生 ,主要从事植物化学研究工作。
苏智先 ( 1950— ) ,男 ,四川省苍溪县人 ,教授 ,主要从事植物生态学研究工作。
收稿日期: 2010-07-10;接受日期: 2010-08-27
张 悦a ,b, c　苏智先② b　罗明华b　胡进耀b　杨 林d　钟小翠b
a(西华师范大学生命科学学院　四川省南充市师大路 1号　 637009)
b (四川省生态与环境保护技术重点实验室　四川省绵阳市仙人路一段 30号　 621000)
c(四川省遂宁市环境监测中心站　四川省遂宁市明月花园小区桂园　 629006)
d (绵竹市教师培训中心　四川省绵竹市　 618200)
摘　要　运用正交试验设计探讨了绵竹白云山珙桐叶黄酮的微波辅助提取工艺条件 ,并对提取液的
抗氧化性能进行了研究。 结果表明 ,珙桐叶总黄酮提取的最佳工艺参数: 微波功率 700W ,料液比 ( g /m L)
1∶ 40,乙醇质量分数浓度为 70% ,提取时间为 2min,测得每克干叶中总黄酮含量为 71. 03mg。对提取液的
抗氧化性研究表明 ,珙桐叶总黄酮对超氧阴离子自由基、羟基自由基的清除率较好 ,在实验所选浓度范围
内 ,总还原能力随浓度增加而增强。
关键词　珙桐叶 ;提取工艺 ;微波 ;总黄酮 ;抗氧化
中图分类号: O657. 32　　　文献标识码: A　　　文章编号: 1004-8138( 2011) 03-0987-05
1　引言
珙桐 (Davidia involucrata Baill)又名鸽子树 ,为我国特有的珙桐科 (Dav idiaceae)单型属植物。系
第三纪古热带植物区系的孑遗种 ,有“活化石”之称 ,具有极高的观赏价值和研究价值 ,被列为国家
一级珍稀濒危保护植物 [1 ]。 该植物叶中含槲皮素 ,山奈酚等黄酮类化合物 [2 ] ,它是植物的一种次级
代谢产物 ,具有抗肿瘤、抗衰老、增强免疫力等药理作用 [3, 4 ]。许多长寿树种的黄酮类化合物已在保
健品和药品方面取得很广泛的应用 [ 5] ,而珙桐作为千年孑遗的长寿植物 ,对其黄酮化合物的提取工
艺和抗氧化性能的研究迄今未见报道。目前组织培养的方法能够成功批量繁殖珙桐幼苗 ,且幼苗成
活率高达 80% [6 ] ,可以大量栽培 ,克服了珙桐作为保护植物无法大量取材的实际困难 ,为开发利用
珙桐提供了取材上的可行性。本实验以绵竹白云山珙桐叶为原料 ,探讨微波提取珙桐叶中总黄酮的
最佳工艺并采用体外实验来研究其提取液的抗氧化能力 ,希望为研究和开发珙桐的药用价值提供
理论基础 ,亦期望为天然抗氧化剂的开发人员和食品行业的技术人员提供一份参考资料。
2　实验部分
2. 1　主要仪器、材料与试剂
UV -2000型紫外 -可见分光光度计 (上海尤尼柯公司 ) ; BP211D型电子天平 (德国赛多利斯公
司 ) ; G7020IIYSL-V 2型微波炉 (广东佛山格兰仕公司 ) ; Milli-Q纯水系统 (美国 Millipore公司 ) ;
5810R离心机 (德国 Eppendorf公司 ) ; FW100型粉碎机 (北京市永光明医疗仪器厂 )。
2008年 10月于四川省绵竹市白云山 (海拔: 1452m , N31°26. 457′, E104°6. 404′)采集珙桐叶
片 ,将其置于烘箱中 30℃低温干燥 ,粉碎后密封备用。 芦丁对照品 ( CAS NO: 153-18-4):
纯度≥ 98%。 实验所用试剂均为分析纯。 实验用水为 Milli-Q制水机的超纯水。
2. 2　实验方法
2. 2. 1　黄酮测定方法原理
以芦丁为标准对照品 ,配制不同浓度梯度 ,采用硝酸铝显色法运用分光光度计在 510nm处测
吸光度 ,得线性回归方程 [ 7]。
2. 2. 2　珙桐叶黄酮的提取工艺流程设计及主要影响因子确定
提取工艺流程设计为: 干燥珙桐叶粉末 ( 1. 0000g )→浸泡 ( 70%乙醇溶液 , 12h )→微波提取
( 2min)→离心 ( 5000r /min, 10min)→定容 ( 100mL容量瓶 )→吸取 ( 1. 0mL)→定容 ( 10mL容量瓶 )
→测定吸光度。
通过预实验与单因素实验确定考察的影响因子与取值范围 ,见表 1所示 ,采用正交试验设计方
法对影响因素进行 L 9 ( 34 )研究。
2. 2. 3　珙桐叶总黄酮的体外抗氧化性研究 [8 ]
2. 2. 3. 1　超氧阴离子自由基清除能力测定
取 6支试管分别加入 Tris-HCl缓冲液 ( 50mmol /L, pH8. 2) 4. 5mL、超纯水 2. 2mL,置于 25℃
水浴中保温 20min; 1号为空白管加入 10mmol /L HCl 0. 3mL、超纯水 2mL,其余 5支试管分别加入
25mmol /L的邻苯三酚溶液 0. 3mL(以 10mmol /L HCl配制 )、不同浓度的提取液 2mL,混匀后于
25℃水浴中反应 5min。每支试管总体积为 9mL。以 Tris-HCl缓冲液作参比 ,在 320nm处测定吸光
度 ,计算清除率。 每个处理均做 3次重复。
清除率 (% )= ( A0- A1 ) /A0× 100%
式中: A0——空白的平均吸光度 ; A1——试样的平均吸光度。
2. 2. 3. 2　羟基自由基清除能力测定
羟基自由基由 Fenton反应产生。 取 11支 10mL比色管编号 ,分别加入 9mmol /L的 FeSO4
1. 0mL、 9mmol /L的水杨酸溶液 1. 0mL、已知浓度的提取液 0. 5, 1. 0, 1. 5, 2. 0, 2. 5, 0. 5, 1. 0, 1. 5,
2. 0, 2. 5, 0mL,加超纯水定容至 10mL, 1— 5号试管为对照分别加 1. 0mL蒸馏水 , 6— 11号试管分
别加 8. 8mmol /L H2O2 1. 0mL, 30℃水浴恒温反应 30min。以超纯水为参比 ,在 510nm处测吸光度 ,
每个处理重复 3次。
清除率 (% )= [A0- ( Ax - Ax 0 ) ] /A0× 100%
式中: A0——空白对照液吸光度 ; Ax——样品液吸光度 ; Ax 0—— 不加 H2O2的样品液的吸光度。
2. 2. 3. 3　总还原力的测定
取不同浓度的黄酮溶液各 2mL,分别加入离心管内 ,加入 2. 0mL磷酸缓冲溶液 ( 0. 2mol /L ,
pH6. 8)及 1%铁氰化钾溶液 2. 0mL, 50℃水浴上加热 20min后急速冷却 ,加入 10%三氯乙酸溶液
2. 0mL,于 3000r /min的条件下离心 10min,取上清液 5mL于 10mL比色管中 ,加 0. 1%三氯化铁
1. 0mL,加超纯水定容 ,混合均匀 ,静置 10min后于 700nm处测定吸光度 ,每个处理重复 3次 ,吸光
度越大则还原能力越强。
988 光谱实验室 第 28卷
3　结果与讨论
3. 1　校准曲线绘制
按照芦丁对照品浓度梯度与对应的吸光度绘制校准曲线 ,得回归方程: y= 11. 67x - 0. 0039,
r
2= 0. 9996( y为吸光度 ; x为芦丁质量浓度 mg /mL)。
3. 2　珙桐叶总黄酮提取最佳条件
以提取液中黄酮的吸光度为指标 , 4个影响因子为研究对象 ,进行 L9 ( 34 )正交试验 ,实验数据
输入正交设计助手 ( 3. 1版本 ) ,结果见表 1。实验结果表明 , 4种考察因素对珙桐叶总黄酮提取效果
影响的主次顺序依次:微波功率> 料液比> 乙醇浓度> 微波时间。由表知最佳组合为 A1B3C2D1 ,即
微波功率 700W,料液比 1∶ 40,乙醇浓度为 70% ,提取时间为 2min,按此方案重复 3次 ,吸光度均
值为 0. 825,测得珙桐叶中总黄酮含量为 71. 03mg /g。
表 1　正交试验结果 L9 ( 34 )
序号 A微波功率
( W )
B料液比
( g /m L)
C乙醇浓度
(% )
D微波时间
( min)
吸光度 A
1 1( 700) 1( 1∶ 20) 1( 60) 1( 2) 0. 681
2 1( 700) 2( 1∶ 30) 2( 70) 2( 4) 0. 760
3 1( 700) 3( 1∶ 40) 3( 80) 3( 6) 0. 729
4 2( 560) 1( 1∶ 20) 2( 70) 3( 6) 0. 577
5 2( 560) 2( 1∶ 30) 3( 80) 1( 2) 0. 683
6 2( 560) 3( 1∶ 40) 1( 60) 2( 4) 0. 600
7 3( 420) 1( 1∶ 20) 3( 80) 2( 4) 0. 551
8 3( 420) 2( 1∶ 30) 1( 60) 3( 6) 0. 550
9 3( 420) 3( 1∶ 40) 2( 70) 1( 2) 0. 685
K 1 0. 723 0. 603 0. 610 0. 683
K 2 0. 620 0. 664 0. 674 0. 637
K 3 0. 595 0. 671 0. 654 0. 619
R 0. 128 0. 068 0. 064 0. 063
3. 3　珙桐叶总黄酮粗提物对超氧阴离子自由基的清除作用
超氧阴离子自由基是细胞在代谢过程中产生的一种重要的自由基 ,具有很强的氧化能力 ,当其
超出一定量时会引起许多种疾病 [9 ]。 由图 1可知 ,随着黄酮加入量的增多 ,清除率逐渐增加 ,在
35. 52— 142. 06μg质量范围内 ,提取液对超氧阴离子自由基的清除具有较好的量效关系。在加入量
为 177. 58μg时清除率基本保持不变。
图 1　提取液对超氧阴离子自由基的
清除效果
图 2　提取液对羟基自由基的清除效果
989第 3期 张 悦等:珙桐叶总黄酮提取工艺及体外抗氧化性
3. 4　珙桐叶总黄酮粗提物对羟基自由基的清除作用
羟基自由基是代谢过程中产生的非常活泼的自由基 ,毒性很大 ,能够造成蛋白质、核酸、脂类等
生物大分子的损伤 ,其在细胞里的积累被认为是机体老化的主要原因 [ 10]。由图 2可知 ,随着黄酮加
入量的增加 ,对羟基自由基的清除率也在增加。 当加入量达到 1. 42mg时清除率达到最大值
75. 35% ,当加入量为 1. 78mg时清除率略微下降。
3. 5　珙桐叶总黄酮粗提物总还原能力
还原能力是表示抗氧化物质提供电子能力的重要指标 ,抗氧化物质通过提供电子可使自由基
变成稳定的分子 ,从而失去活性。许多研究证实抗氧化活性同还原能力是密切相关的。因此可通过
测定还原能力来说明抗氧化活性的大小 [11 ]。 黄酮类物质具有供氢能力 , H+ 与自由基结合 ,使之还
原为惰性化合物或是稳定的自由基 ,从而可以清除机体内过多的有害自由基。从图 3可以看出 ,提
取液在所选的浓度范围内 ,随着浓度的增加吸光度越来越大 ,说明还原能力是越来越强的 ,呈现出
量效关系。
图 3　提取液中总还原能力的测定
4　结论
本实验测得珙桐叶总黄酮含量为 71. 03mg /g。
本研究尝试利用微波技术进行珙桐叶总黄酮提取 ,既
可缩短提取时间 ,又可节约成本 ,适合实验室小批量研究
黄酮。 实验获得珙桐叶总黄酮最佳提取工艺流程: 70%的
乙醇按料液比 1∶ 40浸泡 12h之后在 700W的微波条件
下处理 2min,转移至离心管离心 20min,将上清液定容并
测吸光度。在此条件下得到黄酮含量为 71. 03mg /g。
对珙桐叶总黄酮粗提液抗氧化性研究表明 ,提取液对超氧阴离子、羟基自由基有较好的清除作
用 ,清除效果随浓度的不同而变化。此外 ,粗提液也表现出一定的还原能力 ,随浓度的增加还原能力
增强。 结果表明珙桐叶总黄酮具有较好的综合抗氧化能力 ,具有开发潜力 ,是一种有开发价值的天
然抗氧化剂。
参考文献
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990 光谱实验室 第 28卷
Extraction Technology and Antioxidant Activity of Flavonoids
fromDavidia Involucrata Baill
ZHAN G Yue
a,b ,c　 SU Zhi-Xianb　 LUO Ming-Huab　 HU Jin-Yaob　 YANG Lind　 ZHONG Xiao-Cuib
a (Col lege of Life Science,China West Normal University ,N anchong , Sichuan 637009, P. R. China )
b( Sich uan Provincial Key Laborator y of Ecolog y and Environmental Technolog y ,Mianyang , Sichuan 621000, P. R. China )
c( Sichuan Provincial Center Suining of Environmental Monitoring , Suining , Sichuan 629006,P . R.Ch ina )
d ( Training Center o f Teachers in Mianzhu , Mianzhu , Sichuan 618200,P . R.China )
Abstract　 The ex traction condi tions of flavonoids f rom Davidia involucrata Baill w ere
investigated by o rthogonal tests wi th assistant microwave process, and i ts antioxidant activi ty w as
analyzed as w ell. The results showed that the optimal technological parameters of flav onoids were as
follow s: microw ave pow er of 700W, mass /v olume ratio of 1∶ 40, ethanol concentration of 70% ,
ex traction time of 2min. The highest concentration of to tal flavonoids w as 71. 03mg per g ram dry
leaves. The results of antioxidant activi ty for ex traction solution show ed that Davidia involucrata Baill
had better clearance for superoxide anion and hydroxyl free radicals, and the reduction ability increased
w ith the concentration in experimental selecting concert ration range.
Key words　 Davidia Involucrata Baill; Ext raction Technolog y; Microw ave; Flavonoid;
Antioxidant
2011年《光谱实验室》
征订启事
《光谱实验室》 ,双月刊 , 16开 ,每
册 496页 ,发表论文约 115篇 ,单月
25 日出版。 单价: 60元 /册 ; 年价:
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福建分析测试 双月 大 16 64 5 18 0. 27 1
理化检验 (化学分册 ) 月 大 16 144 15 48 0. 31 2
分析科学学报 双月 大 16 124 10 30 0. 33 3
分析化学 月 大 16 160 15 40 0. 38 4
岩矿测试 双月 大 16 100 10 25 0. 40 5
分析测试学报 月 大 16 124 12 28 0. 42 6
光谱实验室 双月 16 496 60 115 0. 56 7
分析试验室 月 大 16 124 18 30 0. 60 8
中国激光 月 大 16 320 35 58 0. 60 8
高等学校化学学报 月 大 16 188 30 40 0. 75 9
冶金分析 月 大 16 80 15 19 0. 79 10
质谱学报 双月 大 16 64 15 17 0. 88 11
光学学报 月 大 16 216 40 40 1. 00 12
化学通报 月 大 16 96 20 18 1. 11 13
化学学报 半月 大 16 120 20 18 1. 11 13
量子电子学报 双月 大 16 128 30 25 1. 20 14
钢铁研究学报 月 大 16 64 20 15 1. 33 15
　①排序越前者 ,售价越低。
991第 3期 张 悦等:珙桐叶总黄酮提取工艺及体外抗氧化性