全 文 ：　＊【基金项目】海南省自然科学基金资助课题(30530)
【收稿日期】 2011-10-08【修回日期】 2012-05-11
　■【通讯作者】E-mai l:liukeyunqiqi@yahoo.com.cn
水黄皮根总黄酮对大鼠乙酸型胃溃疡胃黏膜 EGF及
TGF-α表达的影响＊
刘可云1■ , 朱　毅2 , 黄贤珍3
(1.湖北民族学院医学院生理学教研室 , 恩施 445000;2.海南省药品检验所 , 海口 570216;3.湖北省恩施州中心医院肾内科 ,恩施 445000)
【摘要】　目的:观察水黄皮根总黄酮(PRF)对胃溃疡大鼠乙酸型胃溃疡的作用 , 探讨该药促进溃疡愈合的可能机
制。方法:采用乙酸注射至大鼠浆膜下形成胃溃疡模型 ,观察水黄皮根总黄酮对胃溃疡大鼠乙酸型胃溃疡愈合质
量的影响 ,用放免法检测血清表皮生长因子(EGF)含量 ,用免疫组化法检测胃黏膜组织 EGF 、转化生长因子-α(TGF-
α)的表达。结果:PRF 能显著降低溃疡指数(P<0.05 , P<0.01), 提高血清中 EGF含量(P <0.05 , P <0.01),增强
溃疡边缘胃黏膜 EGF、TGF-α的表达(P <0.05 , P <0.01)。结论:PRF能提高溃疡愈合质量 ,增强溃疡瘢痕处 EGF、
TGF-α的表达可能是其作用机制之一。
【关键词】水黄皮;总黄酮;胃溃疡;表皮生长因子;转化生长因子-α
【中图分类号】R285.5　　　　【文献标识码】A　　　　【文章编号】1000-6834(2012)05-435-04
Effect of Pongamia pinnata root flavonoids on the quality of ulcer
healing and expression of EGF and TGF-αin the rat model of
gastric ulcer induced by acetic acid
LIU Ke-yun1■ , ZHU Yi2 , HUANG Xian-zhen3
(1.Department of Physiology , S chool of Medicine , Hubei Institute for Nationalities , Enshi 445000;2 .Department of Pharmacology , the Institute for Drug
Control of Hainan province , Haikou 570216;3.Department of Nephrology , the Central Hospital of Enshi Autonomous Prefecture , Enshi 445000 , China)
【ABSTRACT】Objective:To observe the effects and mechanisms of Pongamia pinnata root flavonoids(PRF)on the experimental gastric ul-
cer induced by acetic acid and to study the mechanism of PRF on the quality of ulcer healing.Methods:The models were established by acetic
acid erosion , the quality of ulcer healing of PRF on the model of gastric ulcer were observed.The contents of epidermal growth factor(EGF)in
serum were determined by radioimmunoassay.The expression of EGF and transforming growth factor-α(TGF-α)were detected by immunohisto-
chemistry (SP).Results:PRF significantly inhibited ulcerative formation induced by acetic acid(P<0.05 , P <0.01).PRF could signifi-
cantly increase the EGF and TGF-α(P <0.05 , P <0.01)expression of para-ulcer mucosa tissue and improve the EGF contents in blood
serum(P<0.05 , P<0.01).Conclusion:PRF increases the contents of EGF in serum and the expression of EGF and TGF-αin the tissue
around gastric ulcer which might be one of possible mechanisms that PRF improves quality of ulcer healing.
【KEY WORDS】　Pongamia pinnata;　total flavonoids;　gastric ulcer;　EGF;　TGF-α
　　水黄皮 Pongamia pinnata(L.)Merr.(异名
Pongamia glabra)为豆科(Leguminosae)水黄皮属
(Pongamia Vent.)的半红树植物 ,别名水流豆 ,广泛
分布于印度 、马来西亚及我国南部的广东 、广西 、海
南。在印度 ,其种子和种子油用来治疗白斑病 、麻风
病 、腰部风湿痛 、关节风湿病 ,叶子用于治疗痔疮 、肿
瘤 、伤口消炎等病症[ 1] 。前期动物研究证实水黄皮
根总黄酮(pongamia pinnata root flavonoids , PRF)具有
明显的抗大鼠实验性胃溃疡作用[ 2] 。本实验拟通过
研究水黄皮根总黄酮对乙酸型胃溃疡大鼠表皮生长
因子(epidermal growth factor-α,EGF)及转化生长因子
-α(transforming growth factor-α, TGF-α)表达的影响 ,从
分子水平探讨该药促进溃疡愈合的可能机制。
1　材料与方法
1.1　材料
1.1.1　实验动物　SPF级 SD 大鼠 ,雌雄兼用 ,体重
180 ～ 200 g ,由广东省实验动物中心提供 ,合格证号:
SCXK(粤)2002-0002。在SPF级动物房内 ,恒温(20
±2)℃,湿度 55%～ 65%,光照 、黑暗各 12 h 交替 ,
中央空调集中通风每小时 8 ～ 15次条件下饲养 。喂
养标准饲料 ,饮用水为过滤除菌后的城市自来水 。
1.1.2　药物与试剂　水黄皮根 ,2006年3月采于海
南省海口市 ,由海南省药品检验所中药室陈国彪主
435中国应用生理学杂志 , 2012 ,28(5)
DOI :10.13459/j.cnki.cjap.2012.05.007
任药师鉴定为 Pongamia pinnata(L.)Merr 的根茎 。
水黄皮根总黄酮由海南省药品检验所中药室提供 ,
通过成分鉴定和含量分析 ,总黄酮纯度 >65%。西
咪替丁片剂(Cimetiding , Cim),购自海南制药厂有限
公司 ,批号:050701。以上药品均用 0.5%羧甲基纤
维素钠(CMC-Na)溶液配制为混悬液。大鼠 EGF 放
免试剂盒 ,由中国原子能科学研究所提供 ,批号:
200611。兔抗大鼠 EGF 、TGF-α均由武汉博士德生物
工程公司提供。SP 试剂盒和 DAB显色试剂盒由北
京中杉金桥公司提供 , 批号分别为:52282108 和
66286185。
1.1.3　主要仪器　K15低温离心机 ,美国 Sigma 公
司;SN-69T 放免γ计数器 ,上海原子核研究所日环
仪器厂;HM340石蜡切片机 ,德国莱卡公司;BX50显
微镜 ,日本奥林巴斯;HMIAS-2000 医学病理分析系
统 ,同济医科大学千屏影像工程公司。
1.2　动物模型制备
参照文献[ 3]方法 ,除正常组外各组大鼠禁食
24 h , 用3%戊巴比妥钠(0.1 ml/100 g)腹腔注射麻
醉 ,常规消毒 ,自剑突向下沿腹中线剪开约 2 cm ,自
肝脏后找出胃 ,将胃移出腹腔 ,用微量注射器将 0.
02 ml 30%的乙酸(假手术组注射等体积生理盐水)
注射至胃窦部前壁浆膜下近肌层处 ,待出现直径约
3 mm 半透明的白斑后 ,将胃送还腹腔 ,以大网膜包
裹 ,缝合腹膜 、肌层和皮肤 。
1.3　动物分组和给药
大鼠随机分为6组 ,即正常组 、模型组 、PRF(50 、
150和 450 mg/kg)组 、西咪替丁组 140 mg/kg 组 ,每
组8只 。造模 3 d 后 , PRF 组和西咪替丁组按照剂
量灌胃给药 ,灌胃体积为 10 ml/kg , 正常组和模型
组均灌胃等体积的 0.5%CMC-Na 溶液 ,每日一次 ,
共14 d。
1.4　标本采集和处理
治疗 14 d后 ,大鼠禁食不禁水 24 h ,用 3%戊巴
比妥钠腹腔注射麻醉 ,摘眼球取血 2 ～ 3 ml ,3 000 r/
min离心 10 min ,分离血清 ,置于 EP 管中 ,-20℃冰箱
保存 ,待测 EGF。破腹 ,在距贲门和幽门 1.5 cm 处
结扎 、离断 ,取出全胃。胃内注射 8 ml含 0.1%DE-
PC的 4%多聚甲醛 ,并全胃置于 0.1%DEPC的 4%
多聚甲醛中固定 20 min后 ,沿胃大弯剪开 ,冰生理
盐水冲洗 ,滤纸吸干后铺开 ,以游标卡尺测定溃疡最
大长径及垂直于最大长径的最大宽径。然后将胃置
于含 0.1%DEPC 的4%多聚甲醛继续固定 12 h ,以
平行与胃溃疡长轴方向的最长径为中心取材 ,按常
规脱水 ,石蜡包埋 ,并以溃疡灶或溃疡疤痕的最长径
为中心 5μm厚度连续切片 ,行 HE染色和 EFF 、TGF-
α的免疫组化显色 。
1.5　观察指标
1.5.1　胃粘膜大体观察　观察胃窦部溃疡的大小 、
深浅 、基底清洁度 ,有无覆白苔 ,周围粘膜色泽及充
血水肿等情况。同时按照文献[ 4]方法计算溃疡指数
(Ulcer Index ,UI)=溃疡最大长径 垂直于最大长径
的最大宽径 。并按公式(1-实验各组溃疡指数均值/
模型组溃疡指数均值)100%计算溃疡抑制率。
1.5.2　血清 EGF 水平测定 　自-20℃冰箱取出血
清 ,按照试剂盒说明书以放免法测定血清 EGF ,以
pg/ml表示。
1.5.3　免疫组化及原位杂交显色　应用免疫组化
SP法检测大鼠胃黏膜 EGF 、 TGF-α表达水平。以
PBS替代一抗作为阴性对照 ,以人乳腺癌标本作为
阳性对照。以胞膜或胞浆内出现棕黄色颗粒为显色
阳性。具体操作参照说明书进行 。应用计算机图像
分析系统 ,在光学显微镜 ×400 倍下 , 选取 5 个视
野 ,以象素点长 0.389 μm , 154.6 μm×115.5μm 测
量窗下测量阳性细胞面积百分比及其平均积分光密
度 ,取均值。
1.6　统计学方法
采用 SPSS 12.0统计软件 ,所有实验数据以均
值±标准差( x ±s)表示 ,不同组间比较采用单因素
方差分析 ,与对照组比较采用 dunnet-t检验。
2　结果
2.1　PRF对大鼠乙酸型胃溃疡胃黏膜溃疡指数的
影响
除正常组外各组大鼠腺胃小弯侧黏膜均可见一
溃疡。模型组的大鼠溃疡面积大 ,其上被覆白苔 ,溃
疡底较污秽 ,周围黏膜环堤样水肿隆起;PRF 中 、高
剂量组及Cim组的大鼠溃疡面积较小且较表浅 ,溃
疡基底普遍色红 ,覆浅白苔 ,周边黏膜轻度水肿 。计
算溃疡UI和溃疡抑制率发现 ,PRF 中 、高剂量组及
Cim 组UI明显低于模型组(P<0.01),低剂量组 UI
也低于模型组但没有统计学意义(P >0.05)。与西
咪替丁组相比 , PRF 大剂量组 UI 明显降低(P <
0.05),而中剂量没有明显差异(P>0.05),但是 PRF
低剂量组UI明显大于Cim组(P<0.05 ,表 1)。
2.2　PRF对乙酸型胃溃疡大鼠血清 EGF水平的影响
与正常组比较 ,模型组血清 EGF 含量显著增高
(P<0.05);与模型组比较 ,PRF中 、高剂量组和Cim
组血清 EGF 含量明显增高(P <0.05 , P <0.01);与
西咪替丁组比较 , PFR高剂量组 EGF 含量明显增高
436 Chin J Appl Physiol , 2012 ,28(5)
(P <0.05),而中剂量组 EGF 未见明显变化(P >
0.05),但西咪替丁组明显高于 PRF 低剂量组(P <
0.05 ,表 1)。
Tab.1　Effects of PRF on Ulcer Index and contents of EGF in blood serum in rats( x±s , n=8)
Group
Dose
(mg/ kg) Ulcer Index
The ulcer
inhibition rate/ %
The contents of EGF in
blood serum (pg/ml)
Normal - - - 552.21±76.91
Model - 27.32±5.27＊ - 623.72±81.10＊
PRF 50 20.13±3.76 26.32 629.56±89.04
150 15.86±3.19＊＊## 41.98.56 711.07±80.15＊＊#
450 5.83±2.46＊＊##■ 78.66 728.94±106.55＊＊#■
Cim 140 12.33±4.05＊＊## 54.87 656.25±87.17＊＊#
　　PRF:Pongamia pinnata root flavonids;Cim:Cimetiding
　　＊＊P<0.01 vs normal group;#P<0.05 , ##P<0.01 vs model group;■P<0.05 vs Cim group
2.3　PRF对大鼠乙酸型胃溃疡胃黏膜 EGF表达的
影响
正常组的大鼠 EGF 的表达为弱阳性 ,定位于胞
浆 ,主要集中在胃腺颈部 ,阳性表达细胞以胃黏膜壁
细胞 、颈部细胞为主 。与正常组比较 ,模型组 、Cim
组和PRF 各剂量组溃疡边缘组织阳性表达明显增
强(P<0.01)。与模型组比较 ,PRF 中 、高剂量组和
Cim组表达均显著增加(P <0.05 , P <0.01)。与
Cim组比较 , PRF 低剂量组 EGF 表达明显低于 Cim
组(P <0.05),PRF 中剂量组 EGF 表达与 Cim 组没
有显著性差异(P >0.05),而 PRF 高剂量组溃疡边
缘胃黏膜 EGF 表达则显著强于 Cim组(P <0.05 ,图
1 ,表 2)。
Tab.2　Effects of PRF on EGF expression of gastric ulcer induced
by acetic acid( x±s , n=8)
Group Dose(mg/kg) Percentage of
acreage(%)
Integral optic
density
Normal - 5.82±1.30 0.59±0.21
Model - 13.01±4.03＊＊ 1.47±0.34＊＊
PRF 50 17.57±3.69＊＊ 1.92±0.63＊＊
150 24.68±4.11＊＊## 3.25±0.84＊＊##
450 27.98±4.30＊＊##■ 3.73±1.23＊＊##■
Cim 140 20.45±5.24＊＊# 2.48±0.81＊＊##
　　PRF:Pongamia pinnata root flauonoids;Cim:Cimetiding
　　＊＊P <0.01 vs normal group;#P <0.05 , ##P <0.01 vs
control group;■P<0.05 vs Cim group
Fig.1　Effects of PRF on EGF expression of gastric ulcer induced
by acetic acid in rats(DAB ×400)
Normal:Normal group;Model:Model group;PRF50:PRF
50 mg/ kg group;PRF150:PRF 150 mg/kg group;PRF450:
PRF 450 mg/kg group;Cim:Cim group
2.4　PRF对大鼠乙酸型胃溃疡胃黏膜 TGF-α表达
的影响
正常组的大鼠 TGF-α的表达为弱阳性 ,定位于
胞浆 ,主要集中在胃腺颈部 、基底部 ,阳性表达细胞
以胃黏膜壁细胞 、颈部细胞为主 。与正常组比较 ,模
型组 、Cim组和 PRF 各剂量组溃疡边缘组织阳性细
胞表达积分光密度明显增强和阳性细胞面积百分比
明显增多(P<0.01)。与模型组比较 ,PRF 中 、高剂
量组和 Cim 组阳性细胞表达积分光密度和阳性细胞
面积百分比表达均显著升高(P <0.01),PRF 低剂
量组阳性细胞表达积分光密度显著增强阳性细胞表
达积分光密度 ,而阳性细胞面积百分比没有明显差
异(P >0.05)。与Cim 组比较 ,PRF低剂量组 TGF-α
表达明显低于 Cim 组(P <0.05), PRF 中剂量组
TGF-α表达与 Cim 组没有显著性差异(P>0.05),而
PRF 高剂量组溃疡边缘胃黏膜 TGF-α表达则显著高
于 Cim 组(P<0.05 ,表 3)。
Tab.3　Effects of PRF on TGF-αexpression of gastric ulcer in-
duced by acetic acid in rats( x±s , n =8)
Group Dose(mg/ kg) Percentage of
acreage(%)
Integral optic
density
Normal - 8.73±2.81 0.71±0.22
Model - 15.13±3.94＊＊ 1.59±0.26＊＊
PRF 50 18.65±4.67＊＊# 1.85±0.43＊＊
150 25.52±5.02＊＊## 2.51±0.65＊＊##
450 28.68±6.07＊＊##■■3.09±0.95＊＊##■
Cim 140 24.79±4.98＊＊## 2.61±0.78＊＊#
　　PRF:Pongamia pinnata root flavonoids;Cim:Cimetiding
　　＊＊P <0.01 vs normal group;#P <0.05 , ##P <0.01 vs
control group;■P<0.05 , ■■P<0.01 vs Cim group
3　讨论
由于乙酸型大鼠胃溃疡模型具有形态类似于临
床胃溃疡 ,病变持续时间长 ,其修复过程与人的胃溃
疡类似[ 5] , 因此比较适合于药物治疗胃溃疡的疗效
评价 ,以及药理作用机制的研究。对实验性溃疡愈
合过程的研究表明[ 6] ,不管溃疡成因如何 ,一旦溃疡
437中国应用生理学杂志 , 2012 ,28(5)
形成 ,其修复及愈合都经历共同相似的过程。坏死
物的清除 ,溃疡底部的肉芽组织形成 ,进而形成纤维
组织和瘢痕组织。溃疡边缘的粘膜结构发生改变 ,
腺体呈囊状扩张且顶端向溃疡底部凹陷 ,形成一“过
渡带” 。在生长因子的作用下 ,溃疡边缘的粘膜上皮
增生 、分化并向溃疡中心移行 ,逐渐以单层上皮覆盖
溃疡底部;扩张的腺体及再生的上皮细胞逐渐形成
管状结构 ,分化腺体 ,最终形成正常成熟的腺体。胃
溃疡的愈合是一个非常复杂的过程 ,包括细胞移行 、
分化 、增殖和细胞基质形成及新生血管生成等 ,多个
细胞因子参与了这一过程 。
EGF 是主要存在于颌下腺 、十二指肠 Brunner 腺
颌胰腺中 ,是一种含有 53个氨基酸的单链多肽[ 7] 。
现已证实 EGF 是一种具有抑制胃酸分泌 、促进上皮
细胞增殖 ,组织修复及细胞保护作用的内源性物质 ,
在保护胃粘膜免受损伤因子破坏 、维持胃肠粘膜完
整性方面起到非常重要的作用 。在小鼠实验性胃溃
疡模型中 ,在溃疡发生的第 2 ～ 4天 ,即有 EGFRmR-
NA表达 ,4天后有 EGF过度表达。大鼠乙酸胃溃疡
自愈过程中 , EGF 、TGF-α、EGFR的表达发生规律性
的变化 ,溃疡边缘组织表达比正常组明显增高 ,坏死
组织无表达 ,肉芽组织 、瘢痕组织少有表达 ,溃疡的
早期表达不明显 ,溃疡的愈合期则表达明显[ 8] 。
EGFR是一具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白 ,
分子量为 170 000 ,主要分布在胃壁 、十二指肠和小
肠粘膜上 , 有 EGF 、TGF-α两种配体 ,对 EGF 、TGF-α
有高度亲和力 ,对其诱导产生变构 ,形成受体二聚
体 ,激活受体膜内区域的酪氨酸蛋白激酶 ,使自身的
一系列酪氨酸被磷酸化 ,通过Grb2和 Sos最终激活
P21ras而传导信号 ,调节细胞生长与分化[ 9] 。
TGF-α是 EGF家族中的另一参与胃粘膜损伤后
修复的主要调节肽 ,产生于整个胃肠道 ,尤以胃窦部
粘膜表达量高 , TGF-α具有对多种细胞促有丝分裂
作用 ,如上皮细胞 、内皮细胞 、纤维组织和粘膜组织
等。在胃肠道 TGF-α参与调节粘膜上皮的更新和粘
膜损伤后的修复 ,是维持粘膜完整性的重要介质 ,被
称为“粘膜完整肽”[ 7] 。壁细胞膜表面有其受体 ,提
示TGF-α通过自分泌的形式调节壁细胞的泌酸功
能[ 10] 。
本研究通过放免法 、免疫组化法 ,探讨了 PRF
对大鼠乙酸烧灼型胃溃疡胃粘膜组织 EGF 、TGF-α
表达的影响 。在治疗 14 d 后 , 模型组大鼠 EGF 、
TGF-α的表达较正常组强 ,EGF 、TGF-α、定位于胞浆 ,
主要集中在溃疡边缘组织的胃腺颈部及基底部的壁
细胞 、颈部细胞 。与文献报道一致[ 7] 。胃腺颈部及
基底部是胃粘膜上皮细胞增殖的部位 。因此提示 ,
PRF 组能显著增加溃疡边缘组织 EGF 、TGF-α表达。
提示 PRF可能通过促进溃疡边缘粘膜组织细胞的
分化 、增殖来促进溃疡的修复和愈合。EGFR的增
加除了介导粘膜上皮的分裂 、增殖外 ,还介导抑制胃
酸的分泌 ,是胃溃疡组织修复过程中的主要环节。
据报道[ 10]当血液循环中的 EGF 与该受体结合后 ,可
抑制胃酸的分泌。本研究发现 PRF 能明显抑制胃
酸的分泌;能显著提高血清中 EGF 的含量 。提示
PRF 可能通过增加血液中 EGF 含量 ,提高胃粘膜组
织 EGF 表达 ,抑制胃酸的分泌 、促进溃疡的愈合 。
由此推测 PRF 促进乙酸烧灼型溃疡愈合可能
与促进溃疡边缘组织 EGF 、TGF-α的表达 ,刺激溃疡
边缘“愈合带”上皮细胞增殖 、分化和移行 ,增加胃粘
膜的血流量 ,改善微循环 ,抑制胃酸的分泌有关 。
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