全 文 ：第 3 3卷第2期
2 0 1 6 年 2 月
精 细 化 工
FINE CHEMICALS
Vol ． 3 3，No ． 2
Feb． 2 0 1 6
中药现代化技术
收稿日期:2015 － 11 － 25;定用日期:2016 － 01 － 08;DOI:10． 13550 / j． jxhg． 2016． 02． 007
基金项目:农业部项目公益性行业(农业)科研专项(201203046) ;天津市大学生创新创业训练计划项目(201510058079)
作者简介:郭文娟(1980 －) ，女，副教授，博士，电话:13102150756，E － mail:wangxiaonadeshijie@ 163． com。
山楂核总黄酮的超声提取及抗氧化活性
郭文娟，王 娜，王娜娜，张瑞平，王 博，董利鹏
(天津工业大学 环境与化学工程学院 分离膜与膜过程省部共建国家重点实验室，天津 300387)
摘要:采用超声辅助乙醇提取山楂核总黄酮，通过单因素实验方法和正交实验方法确定了总黄酮的最优提取工艺
条件;与抗坏血酸、芦丁对比，利用羟基自由基(·OH)、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH·)、Fe3 +法测定山
楂核总黄酮的抗氧化活性。结果表明，山楂核总黄酮超声辅助提取的最佳提取工艺为:按料液比为 1∶25(每克山楂
核加入25 mL提取剂，下同) ，加入体积分数 50%的乙醇，在60 ℃下用250 W超声辅助提取40 min，山楂核中总黄酮
的提取率可达到 7. 89%。经过纯化的山楂核总黄酮提取物对·OH和 DPPH·具有明显的清除力且对 Fe3 +有较强
的还原能力;黄酮纯化物的抗氧化作用随质量浓度增大而增强，其抗氧化能力强于芦丁而弱于抗坏血酸。
关键词:山楂核;总黄酮;提取;抗氧化性;中药现代化技术
中图分类号:R284． 2 文献标识码:A 文章编号:1003 － 5214(2016)02 － 0152 － 05
Ultrasonic-assisted Ethanol Extraction of Flavonoids from
Hawthorn Seed and Their Antioxidant Activity
GUO Wen-juan，WANG Na，WANG Na-na，ZHANG Rui-ping，WANG Bo，DONG Li-peng
(School of Environmental and Chemical Engineering，State Key Laboratory of Separation Membranes and Membrane
Processes，Tianjin polytechnic University，Tianjin 300387，China)
Abstract:Flavonoids were extracted from Hawthorn seed under ultrasonic assistance，with ethanol as
extraction solvent． The technical conditions were investigated based on single factor and orthogonal
tests． Meanwhile，compared with ascorbic acid and rutin，the antioxidant activity of flavonoids was
evaluated by scavenging DPPH radical，hydroxyl radical and method of Fe3 + ． The results showed that
the optimal ultrasonic-assisted extraction condition of flavonoids from Hawthorn seed were shown as
follows:ethanol volume fraction of 50%，material-to-liquid ratio of 1 ∶ 25(25 mL liquid per gram
materials) ，ultrasonic power of 250 W，ultrasonic-assisted extracting time of about 40 min and
extraction temperature at 60 ℃ ． The extraction rate of flavonoids reached 7. 89% ． The flavonoid
extraction exhibited obviously ability of scavenging DPPH free radical and OH free radical，and showed
a higher reducing capacity to Fe3 + ． The antioxidant activity increased with the increase of the
concentration of purified flavonoids，which was superior to rutin but inferior to ascorbic acid．
Key words:Hawthorn seed;flavonoids;extraction;antioxidant activity;modernization technology of
traditional Chinese medicines
Foundation items:Supported by Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest
(201203046) ;Tianjin Undergraduate Training Programs for Innovation and Entrepreneurship Training
Program (201510058079)
山楂(Crataegus pinnatifida Bunge) ，又名红果、
山里红等，为蔷薇科山楂属(Crataegus L．)落叶乔
木，全球大约 250 多种，在中国种植资源丰富［1 － 2］。
山楂味道甘酸，温和滋补，具有消食行健、行气化瘀
的功效，临床主要用来治疗食物积滞、腹痛泻痢、胸
痛腹痛、痛经、吐血、便血等［3 － 4］。早期对于山楂的
研究，主要集中在蛋白质、维生素、碳水化合物、无机
盐、脂肪等成分;近 30 年来，很多学者发现黄酮类成
分对心脑血管等疾病具有明显的药理学作用，因而
将研究重点转向山楂中的黄酮成分［5 － 6］。黄酮是山
楂中的主要成分。大量药理学研究发现，山楂中的
黄酮具有改善心肌功能、抗氧化［7］、抗肿瘤、降血
压、降血脂、增加冠脉流量等作用［8］。目前，已有很
多学者研究过山楂果肉及山楂叶中的黄酮类化合
物，但由于山楂去核条件的限制，山楂核中的黄酮类
化合物及其提取方法鲜有报道。研究提取山楂核中
的黄酮类化合物的方法和工艺，对提高山楂资源的
综合利用率具有重要意义。本实验采用超声法提取
山楂核中黄酮，研究其提取工艺条件，并采用·OH、
DPPH·和 Fe3 + 3 种方法测定山楂核中总黄酮的抗
氧化活性，以实现更好地利用山楂资源的目的。
1 实验部分
1． 1 原料、试剂与仪器
山楂核，购于河北兴隆县。
芦丁标准品，生物制品检验所;AB －8 型大孔吸
附树脂，天津市海光化工有限公司;DPPH，北京索莱
宝科技有限公司;体积分数为 95%的乙醇、亚硝酸
钠、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸、铁氰化钾、过氧化氢、三
氯化铁、三氯乙酸、抗坏血酸、1，10-邻氮二杂菲等均
为市售 AR。
KQ －100B型超声波清洗器，昆山市超声仪器
有限公司;TU － 1901 双光束紫外可见分光光度计，
北京普析通用仪器有限责任公司。
1． 1． 1 原料的预处理
将山楂核置于 70 ℃烘箱中烘干，然后用粉碎机
粉碎，并过 60 目网筛，密封保存备用。
1． 1． 2 山楂核总黄酮的提取
取适量的经过预处理的山楂核粉末，用一定体积
分数的乙醇按一定的料液比、提取温度、超声功率、超
声时间，用超声提取，然后减压抽滤，除去滤渣，取滤
液，滤液用相应体积分数的乙醇定容至 100 mL。
1． 1． 3 山楂核总黄酮含量的测定
用芦丁标准品作为对照品，按照 NaNO2-Al
(NO3)3-NaOH法
［9］绘制芦丁标准曲线，在 510 nm
的紫外吸收波长下，测定吸光值 A，并计算提取液中
总黄酮的含量。回归方程为:
A = 6. 7303ρ － 0. 0263(R2 = 0. 999 1)
质量浓度在 0 ～ 0. 05 g /L内，黄酮质量浓度 ρ(g /L)
和吸光值 A有很好的线性关系。
按照下式计算总黄酮提取率:
提取率(黄酮)/% = ρ × Vm × 100
式中:ρ为提取液中黄酮质量浓度，g /L;V 为滤液定
容的体积，L;m为山楂核粉末质量，g。
1． 1． 4 山楂核总黄酮的纯化
将 120 mL经过处理的 AB － 8 大孔树脂装于色
谱柱中，将 500 mL pH =4. 5、总黄酮含量为 2 g /L的
山楂核提取液，以 1. 5 mL /min 的流速通过树脂柱，
先用去离子水洗脱至无色，然后用体积分数 70%的
乙醇洗脱液以 1. 5 mL /min的流速进行洗脱，直到流
出的洗脱液用紫外检测吸光度基本为 0 后停止，将
洗脱液收集，得到纯化后的提取液。纯化后的山楂
核黄酮用来做抗氧化性实验。
1． 2 山楂核总黄酮抗氧化活性测定
1． 2． 1 DPPH自由基(DPPH·)清除能力
按照文献［10］的方法，准确称取 0. 01 g DPPH
自由基(DPPH·) ，用无水乙醇将其溶解，并于
250 mL容量瓶中定容至刻度，配制成 0. 04 g /L 的
DPPH·乙醇溶液，置于暗处保存。将纯化后的山楂
核总黄酮用无水乙醇配制成一系列浓度的溶液。取
0. 5 mL各浓度的待测液，分别加入 5 mL 至已经配
好的 DPPH·乙醇溶液，混合均匀后，置于黑暗环境
中，在 30 ℃下反应 30 min，在 517 nm的紫外吸收波
长下进行吸光度的测定。以无水乙醇代替样品测得
吸光度为 A0。以抗坏血酸和芦丁做对照，每个浓度
测 3 组平行数据，取其平均值。按下式计算 DPPH
自由基(DPPH·)的清除率:
P /% =
A0 － A1
A0
× 100
式中:A0 为 DPPH 与乙醇混合液的吸光度;A1 为加
入样品后 DPPH与乙醇混合液的吸光度。
1． 2． 2 羟基自由基(·OH)清除能力
利用 Fenton 反应法测定山楂核总黄酮清除羟
基自由基(·OH)的能力［11］。将纯化后的山楂核总
黄酮用无水乙醇配制成一系列浓度的溶液。取
1. 0 mL 各 浓 度 的 待 测 液，分 别 加 入 2. 0 mL
0. 75 mmol /L pH = 7. 4 的磷酸盐缓冲液，1. 5 mL
5. 0 mmol /L的邻二氮菲无水乙醇溶液，1. 0 mL
7. 5 mmol /L的硫酸亚铁溶液，将上述混合液混合均
匀后，再加入 1. 0 mL 质量分数为 0. 05%的 H2O2。
在 37 ℃水浴环境中反应 1 h 后，在 536 nm 的紫外
吸收波长下进行吸光度测定。以抗坏血酸和芦丁做
对照，每个浓度测 3 组平行数据，取其平均值。按下
式计算 OH自由基(·OH)的清除率:
S /% =
A1 － A0
A2 － A0
× 100
式中:A0 为 1，10-邻氮二杂菲-亚铁离子-过氧化氢体
系吸光度;A1 为样品-1，10-邻氮二杂菲-亚铁离子-过
氧化氢体系吸光度;A2 为 1，10-邻氮二杂菲-亚铁离
子体系吸光度。
1． 2． 3 还原性的测定
采用铁氰化钾法测定还原能力［12］。取 1. 0 mL
各个浓度的纯化后的黄酮提取液，分别加入 1. 0 mL
0. 2 mol /L、pH =6. 6的磷酸盐缓冲液和 1. 0 mL 质量
分数为 1%的 K3Fe(CN)6 溶液，在 50 ℃的条件下反
·351·第 2 期 郭文娟，等:山楂核总黄酮的超声提取及抗氧化活性
应 20 min，然后加入 1. 0 mL质量分数为 10%的三氯
乙酸溶液，3 000 r /min 离心 10 min 后，取 2. 5 mL 上
清液，加入 2. 5 mL 蒸馏水和 1. 0 mL 质量分数为
0. 1%的 FeCl3 溶液，混合均匀，静置 10 min，在 700 nm
的紫外吸收波长下进行吸光度测定。考虑到样品液自
身的吸光度，以 1. 0 mL蒸馏水代替质量分数为 1%的
K3Fe(CN)6 溶液，其他药品的用法用量同上，测得吸光
度 A1。以抗坏血酸和芦丁做对照，每个浓度测 3 组平
行数据，取其平均值。总还原能力(D)计算公式为:
D = A － A1
式中:A是加入样品后的吸光度值;A1 是溶剂本身的
吸光度值。
2 结果与讨论
2． 1 单因素实验
2． 1． 1 乙醇体积分数对山楂核总黄酮提取率的影响
称取山楂核粉末 1. 0 g，分别加入 15 mL体积分
数为 30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇，在
超声功率 300 W，提取温度 50 ℃下超声 30 min，抽
滤，定容，测吸光度并计算提取率，结果见图 1。
图 1 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响
Fig． 1 Effect of ethanol concentration on the extraction rate of
flavonoids
由图 1可知，随乙醇体积分数的升高，山楂核总
黄酮提取率逐渐增大。用体积分数为 60%的乙醇提
取，提取率达到最大，此后，随着乙醇体积分数升高，
提取率逐渐减小。是因为“相似相溶”原理，即山楂核
总黄酮的极性与体积分数为 60%的乙醇最为相近，
因此可很好地溶于体积分数为 60%的乙醇［13］。因
此，选用乙醇体积分数为 60%的溶液做提取剂。
2． 1． 2 温度对山楂核总黄酮提取率的影响
称取山楂核粉末 1. 0 g，加入 15 mL体积分数为
60%的乙醇，分别在提取温度为 30、40、50、60、70 ℃
的条件下超声提取 30 min，功率为 300 W，抽滤，定
容，测定吸光度并计算提取率，结果见图 2。由图 2
可知，总黄酮的提取率随温度升高而逐渐增大，在
60 ℃总黄酮提取率最大，此后随温度继续升高而逐
渐减小。这可能是因为温度升高，提取剂中的乙醇
会有部分挥发，提取剂中乙醇的体积分数发生变化，
造成提取剂极性增大，使得提取率减小［14］。而且随
着温度的升高，很多杂质也会大量溶出。因此，60
℃为最适宜的提取温度。
图 2 提取温度对总黄酮提取率的影响
Fig． 2 Effect of extraction temperature on the extraction rate of
flavonoids
2． 1． 3 料液比对山楂核总黄酮提取率的影响
称取 1. 0 g 山楂核粗粉，分别加入体积分数为
60%的乙醇 10、15、20、25、30 mL，在超声功率 300
W，60 ℃提取温度下超声提取 30 min，抽滤，定容，
测吸光度并计算提取率，结果见图 3。
图 3 料液比对总黄酮提取率的影响
Fig． 3 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of
flavonoids
由图 3 可看出，料液比对山楂核总黄酮提取率
的影响非常明显。提取率随着料液比的增大而逐渐
增大，当料液比为 1 ∶25 时，提取率达到最大，此后，
提取剂用量继续增加，提取率反而减小。因此，最佳
料液比为 1∶25。
2． 1． 4 超声时间对山楂核总黄酮提取率的影响
称取 1. 0 g 山楂核粗粉，加入 25 mL 体积分数
为 60%的乙醇，在超声功率 300 W，60 ℃提取温度
下分别超声提取 20、30、40、50、60 min，抽滤，定容，
测吸光度并计算提取率，结果见图 4。由图 4 可以
看出，总黄酮提取率随着超声时间延长而增大，当超
声时间为 40 min 时，提取率最大，此后随着超声时
间的延长，总黄酮提取率反而略有减小。这是因为
在提取时间较短时，提取剂中总黄酮含量较低，延长
·451· 精 细 化 工 FINE CHEMICALS 第 33 卷
提取时间，总黄酮大量溶出，提取剂中总黄酮的含量
逐渐增加，提取时间为 40 min 时，总黄酮含量已经
达到最大;之后再延长提取时间，其他杂质也会溶
出，造成总黄酮提取率减小。因此，40 min为较适宜
的提取时间。
图 4 超声时间对总黄酮提取率的影响
Fig． 4 Effect of ultrasonic time on the extraction rate of
flavonoids
2． 1． 5 超声功率对山楂核总黄酮提取率的影响
称取 1. 0 g 山楂核粗粉，加入 25 mL 体积分数
为 60%的乙醇，分别设定超声功率为 100、150、200、
250、300 W，在提取温度为 60 ℃下提取 40 min，抽
滤，定容，测吸光度并计算提取率，结果见图 5。
图 5 超声功率对总黄酮提取率的影响
Fig． 5 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of
flavonoids
由图 5 可看出，当超声功率小于 250 W 时，总
黄酮提取率随着超声功率的增大而明显增大，当超
声功率超过 250 W，随着超声功率的增大，提取率变
化并不明显。因而，250 W为最佳超声提取功率。
2． 2 正交实验及验证
2． 2． 1 正交实验设计及结果
根据单因素实验的结果，选用 L9(3
4)正交表，以
山楂核总黄酮提取率为指标，以料液比(A)、提取温
度(B)、乙醇体积分数(C)、超声时间(D)4 种因素进
行正交实验设计，因素水平见表 1，实验结果见表 2。
表 1 正交实验的因素及水平
Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
水平
A料液比
/(g /mL)
B提取温度
/℃
C乙醇体积分数
/%
D超声时间
/min
1 20 40 50 30
2 25 50 60 40
3 30 60 70 50
表 2 L9(3
4)正交实验结果
Table 2 Results and analysis of the orthogonal test
实验号 A B C D 提取率/%
1 1 1 1 1 7． 34
2 1 2 2 2 7． 26
3 1 3 3 3 7． 39
4 2 1 2 3 7． 52
5 2 2 3 1 7． 63
6 2 3 1 2 7． 89
7 3 1 3 2 7． 55
8 3 2 1 3 7． 71
9 3 3 2 1 7． 46
k1 7． 33 7． 47 7． 65 7． 48
k2 7． 68 7． 53 7． 41 7． 57
k3 7． 57 7． 58 7． 52 7． 54
R 0． 35 0． 11 0． 24 0． 09
由表 2 可以看出，山楂核总黄酮最佳提取工艺
组合为 A2B3C1D2，即料液比为 1 ∶ 25，提取温度为
60 ℃，乙醇体积分数为 50%，提取时间为 40 min。
由极差分析可知，4 种因素对总黄酮提取率影响的
主次顺序为 A ＞ C ＞ B ＞ D，即:料液比 ＞乙醇体积分
数 ＞提取温度 ＞超声时间。
2． 2． 2 最佳工艺条件验证
准确称取山楂核粉末 3 份，每份 1. 0 g，采用正
交实验中的最佳工艺条件进行提取，总黄酮提取率
分别为 7. 93%、7. 91%、7. 88%。结果表明，通过正
交试验得到的最佳提取工艺条件具有很好的稳定性
和重现性。
2． 3 山楂核总黄酮的抗氧化性
2． 3． 1 山楂核总黄酮对 DPPH 自由基(DPPH·)
的清除能力
图 6 为山楂核总黄酮、抗坏血酸和芦丁对
DPPH·的清除能力。
图 6 DPPH自由基清除能力
Fig． 6 Scavenging efficiency of DPPH radical(%)
·551·第 2 期 郭文娟，等:山楂核总黄酮的超声提取及抗氧化活性
由图 6 可知，3 种物质对DPPH·都具有很好的
清除能力，在 0. 05 ～ 0. 5 g /L内，随着质量浓度的增
大，DPPH·清除能力也逐渐增强。在相同条件下，
山楂核总黄酮对 DPPH·的清除能力稍强于芦丁，
但弱于抗坏血酸。当浓度达到0. 4 g /L时，抗坏血
酸、山楂核黄酮、芦丁 3 种物质对 DPPH·的清除率
分别为 93. 6%、86. 2%、81. 2%。
2． 3． 2 山楂核总黄酮对 OH自由基(·OH)的清除
能力
图 7 为山楂核总黄酮、抗坏血酸和芦丁对·OH
的清除能力。
图 7 羟基自由基清除能力
Fig． 7 Scavenging efficiency of OH radical(%)
由图 7可知，3种物质对·OH均具有清除能力，
随着质量浓度的增大，对·OH的清除能力均明显增
强。在相同条件下，山楂核总黄酮对·OH的清除能
力明显强于芦丁，但稍弱于抗坏血酸。当质量浓度达
到 0. 4 g /L时，抗坏血酸、山楂核黄酮、芦丁对·OH
的清除率分别为 88. 9%、84. 7%、73. 8%，山楂核总黄
酮的清除能力接近抗坏血酸水平。
2． 3． 3 山楂核总黄酮对 Fe3 +的还原能力
图 8 为山楂核总黄酮、抗坏血酸和芦丁对 Fe3 +
的清除能力。
图 8 对 Fe3 +的还原能力
Fig． 8 Reducing ability of Fe3 +
由图 8 可知，3 种物质均表现出了良好的还原
能力，在 0. 05 ～ 0. 5 g /L的浓度范围内，还原能力随
质量浓度增大而增强。在相同条件下，山楂核总黄
酮对 Fe3 +的还原能力稍强于芦丁，但弱于抗坏血
酸。当质量浓度达到 0. 4 g /L 时，再增大山楂核总
黄酮质量浓度，对还原能力影响不大。
3 结论
(1)采用超声辅助法提取山楂核中黄酮，通过
单因素实验和正交实验进行实验条件的优化，得出
最佳工艺条件为:料液比为 1∶25，提取温度为 60 ℃、
乙醇体积分数 50%、超声时间 40 min，该条件下总
黄酮提取率可达 7. 89%。4 种因素对总黄酮提取率
影响的主次顺序为:料液比﹥乙醇体积分数﹥提取
温度﹥超声时间。
(2)山楂核总黄酮对 DPPH·和·OH均有一定
的清除力，并对 Fe3 +有较强的还原能力。黄酮纯化
物清除自由基的能力和还原性随着浓度的增大而不
断增强;在相同浓度下，其对两种自由基的清除能力
和对 Fe3 +的还原能力强于芦丁，弱于抗坏血酸。
(3)山楂核中含有的黄酮具有较强的抗氧化活
性，是一种活性较好的抗氧化剂。研究提取山楂核
中总黄酮，可以更好地利用山楂资源。
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