全 文 ：中国农业科学　 1999, 32( 2): 112
Scientia Ag ricultura Sinica
马桑根瘤内生菌纯培养物的分离、
回接及其生物学特性*
胡传炯 1　周平贞 2　周　启 1　陈华癸1
( 1华中农业大学生命科技学院 ,武汉　 430070; 2中国农业科学院油料作物研究所 )
提要　多次采用根瘤切片法直接从野生的马桑根瘤中分离内生菌纯培养物均未获成功 ;
但用同样方法从温室里人工接种形成的马桑根瘤中却分离到大量纯培养物。其中 273株经盆栽
回接后发现有 24株能侵染结瘤 ;少数菌株还通过半固体斜面和珍珠岩盆栽回接成功。对 10株纯
培养物表型特性的研究表明 ,它们均具有 Frankia的形态和培养特征 ;生理类型除有 A、 B两型
外 , 尚出现有一类 A、 B混合型 ,其中凡属 B型菌株均能侵染结瘤 , A型则不能 , 两株 A、 B混合
型中有 1株能结瘤 ,另 1株却不能 ; 碳、氮源利用特性和其它 Frank ia基本相似 ;细胞壁组分既有
Ⅲ型也有Ⅱ型 ;全细胞鉴别性糖大多为木糖和半乳糖 ,少数菌株只含有半乳糖或木糖 ,或含有半
乳糖、木糖和阿拉伯糖。DN A中 G+ C mol%为 65% ～ 74%。
关键词　尼泊尔马桑 ; 内生菌 ; 分离 ; 回接 ; 纯培养物特性
作为弗兰克氏菌 ( Frankia )类群之一 , 马桑 (Coriaria)根瘤内生菌的分离和回接仍是
个难题。迄今未有一例完全成功的报道。周平贞等早在 80年代初就开始研究尼泊尔马桑根瘤
的共生关系〔 1, 2〕。经过多年探索 ,从根瘤中累积分离到大量内生菌纯培养物。吴捷 ( 1988)曾将
其中 538株纯培养物通过水培和蛭石栽培方法分 5次进行回接试验 , 但只有 3株在 1次水培中
获得成功 (博士论文 )。Mirza等 ( 1992)从该植物根瘤中分离到 1株纯培养物 Cn7,但它不形
成泡囊 ( vesicle) ,也不能成功回接〔6〕。最近 , 作者将具有典型 Frankia形态特征的 273株纯培
养物再次进行回接 , 结果有 24株能够侵染原寄主并结瘤。其中有少数菌株还经过珍珠岩栽
培和半固体琼脂法回接也证明均能结瘤。此外 , 对一部分纯培养物 (包括回接成功和未成功
的菌株 )还系统地进行了生物学特性研究。本文就报道这些实验的部分结果。
1　材料与方法
1. 1　试验菌株及培养
Frankia参考菌株 AirI2分离自赤杨 ,由阮继生先生提供 ; Cc01、 Hr18、 Mg+ 、 CpI1分别分
离自细枝木麻黄、沙棘、杨梅和香蕨木 ,均由丁鉴先生惠赠。青铜小单孢菌 (Micromonospora
chalcea )和普通链孢囊菌 ( Streptosporangium vulgare )由中国科学院微生物研究所提供。
马桑根瘤分离菌株见表 1和表 2。 Frankia参考菌和马桑菌株一般培养于 S〔 7〕或 Bap〔8〕培养
液 , 28℃下静置或轻微振荡。用于形态观察和生理试验的菌株还培养于 S〔7〕 , Qmod〔9〕 , Bap-
N
〔 8〕培养基中。
　 收稿日期　 1998-01-05
* 国际科学基金 ( IFS, D2678-1)和国家自然科学基金 ( 39870037)资助课题。
1. 2　内生菌的分离
采集温室中形成的健旺根瘤 ,剔除表面泥土 ,用自来水冲洗干净后 , 在 0. 2% Hg Cl2中
表面灭菌 5～ 10min, 再用无菌水清洗 10次。用无菌解剖刀将根瘤切成 1～ 2mm薄片并将它
插入琼脂培养基上 , 28℃培养 ; 待瘤片长出菌丝体后 , 用接种针将它挑接到平板上进一步
纯化。然后在显微镜下观察并检测其纯度 , 进而转接到 S或 Bap培养液中待用。
1. 3　纯培养物的回接试验
将表面灭菌的种子在无菌条件下催苗 , 待长到 2～ 4片真叶时栽入装有紫色土 (采自重
庆 )或灭菌珍珠岩的盆钵中。每盆栽苗 5～ 10株 , 每菌 2个重复。半固体斜面上每管定苗 2株。
植物生长过程中用 25%的 Hoag land溶液补充养分和水分 , 回接后所用的 Hoagland稀释液
不含有氮。纯培养物预先活化后用匀浆器匀浆 , 大量接种于无氮 Bap中培养 1～ 2周 , 制成
菌悬液即用于回接。每次每植株接种 1ml, 累计 3次。设不接种为对照 , 温室条件下培养和管
理。
1. 4　纯培养生物学特性测定
生理类型测定和碳、氮源利用试验 , 参照文献〔7〕和〔11〕。细胞化学组分检测 , 参照文
献〔3〕。G+ C mol%测定 , 参照文献〔12〕。
2　结果
2. 1　马桑根瘤内生菌的分离和纯培养物的回接
多次尝试从云南、四川、湖南、湖北等地采集的马桑野生根瘤中直接分离内生菌纯培养
物 , 均未获得成功。但采用从野生根瘤压碎汁接种马桑植株后形成的根瘤中 , 用同样分离
方法却得到大量纯培养物。选出 273株纯培养物 , 分两批进行回接试验 ,分别在 4个月后检查
结果 ,发现对照全部没有结瘤 ,处理中共有 24株纯培养物能够侵染原寄主结瘤 (表 1)。其中少
数结瘤菌株如 Cs030、 Cs103、 Cs150还能使生长在珍珠岩和半固体琼脂斜面上的植株结瘤。
2. 2　内生菌纯培养物的特性
2. 2. 1　形态和培养特征　 显微镜观察结果表明 , 在 S、 Bap、无氮 Bap和 Qmod等 4种培养
基中 , 所有菌株都形成椭圆形或不规则形孢囊 ( sporangium) , 它们也都能形成泡囊 , 其中
在无氮 Bap培养基中形成的泡囊最多。此外 , 菌株 Cs103在 Bap和无氮 Bap上还发现有串
珠状生殖菌丝 ( repoductiv e to rulo se hyphae, RTH)〔4〕。
纯培养物和参考菌株除能在液体培养基中生长外 , 还能在琼脂培养基上形成菌落。在
液体培养基中所有菌株的菌丝体都生长在试管或三角瓶的底部 , 呈絮状或颗粒状沉淀。它
们在培养基中的生长量、菌丝体颜色和可溶性色素等特征 , 不仅因菌株不同而异 , 而且还
受培养基成分和培养方式的影响。和液体培养或与其他放线菌相比 , 纯培养物在琼脂上生
长是很缓慢的 , 所有菌株在 S、 Bap、 Qmod 3种琼脂培养基上均能形成菌落。除在每种培养
基上不同菌株的生长速度 ( 1周到 2个月以上不等 )有明显差别外 , 而且菌落的表面性状 , 颜
色和可溶性色素等方面也有一定差异。根据菌落的表面性状可将它们划分成 4种类型 , 即
菌落呈放射形生长 , 质地坚韧者为 IH型 ; 菌落呈放射形生长而质地松软者为 IS型 ; 菌落
凸起 ,质地坚韧者为Ⅱ H型以及菌落凸起而质地松软者为Ⅱ S型。结果凡是菌落质地松软的
试验菌株 ,大多均能产生可溶性色素 ;相反 , 凡是菌落质地坚韧的菌株 , 大多均不产生可溶
732期 胡传炯等:马桑根瘤内生菌纯培养物的分离、回接及其生物学特性
性色素。
表 1　纯培养物回接试验结果
Table 1　 Results of nodula tion with pure cultures
菌株
St rains
结瘤率 (% )
Nodulation
rate
每结瘤植株
根瘤数
Nodules per
nodu lated
plant
每根瘤
裂片数
Lobes per
nodule
菌株
St rains
结瘤率 (% )
Nodulation
rate
每结瘤植株
根瘤数
Nodules per
nodulated
plant
每根瘤
裂片数
Lobes per
nodule
Cs013 14. 21) 1 3 Cs431 6. 3 1 7
Cs030 5. 9 1 5 Cs459 14. 3 1 4
Cs44-2 5. 9 1 5 Cs472 6. 7 1 4
Cs103 5. 0 1 6 Cs481 5. 6 1 4
Cs108 3. 1 1 4 Cs501 13. 3 1 5
Cs136 4. 8 1 1 Cs505 7. 7 1 6
Cs150 5. 3 2 4. 5 Cs521 7. 8 1 1
Cs157 4. 8 1 3 Cs537 14. 3 1 8
Cs213 11. 1 3 3. 3 Cs613 2. 9 1 6
Cs383 14. 3 1 7. 0 Cs620 2. 9 2 4. 5
Cs396 20. 0 1 2 Cs641 8. 0 1 3
Cs414 5. 9 1 1 CK 02) 0 0
Cs421 5. 3 1 4 平均 8. 3 1. 2 4. 2
Averag e
　 1) 2个重复的平均结果　 Av erage values f rom 2 replications; 2) 20个重复作总对照 20 replications u sed for total cont rols
2. 2. 2　生理类型　根据 Lechevalier( 1983)的方法进行生理类型的测定结果见表 2和图。有
5株纯培养物在含有 Tween-80培养基中的菌丝体干重均高于生长在不含 Tw een-80培养基
中的菌丝体量。说明 Tw een-80能促进它们对葡萄糖的利用 , 而且这种促进作用是与葡萄糖
浓度和培养时间呈正相关的 (图 ) ; 相反 , 另有 5株则在有 Tw een-80时 , 葡萄糖利用和菌体
生长均受到明显抑制。显然 , 前面 5株应属生理 B型 , 后面 5株则属生理 A型。此外 , 尚有 2
株不论有无 Tw een-80都能很好生长 ,它们的菌丝体干重均很接近。这种生理类型由于同时
包含 A、 B两型的特性 ,我们称之为 A、 B混合型。
表 2　纯培养物的生理类型
Table 2　 Physio lo gica l g roups of pure cultures
回接成功的菌株 Effectiv e st rains
菌株 St rains 生理型
Ph ysiological g roup
回接未成功的菌株 Inef fective s t rains
菌株 St rains 生理型
Ph ysiological group
Cs150 B Cs642 A
Cs641 B Cs205 A
Cs521 B Cs120 A
Cs103 B Cs470 A
Cs146 A, B Cs155 A, B
参考 菌株 Reference St rains
Cc01 B AirI2 A
74 中　国　农　业　科　学 32卷
图 　吐温 -80和葡萄糖对纯培养物生长的影响
Fig.　 Influence o f Tween-80 and g luco se on g row th o f Coriaria iso la tes Cs146, Cs470 and Cs103 in S
medium
2. 2. 3　碳、氮源利用　试验测定了纯培养物对 4种有机酸盐 , 8种糖和 5种氮源的利用。结果
表明 ,大多数菌株均能利用乙酸钠、丙酸钠和丙酮酸钠 ,只有 2个菌株能利用柠檬酸钠。所有
菌株都不能利用阿拉伯糖、半乳糖、木糖和甘露醇。回接成功的菌株大多还不能利用其它的
单、双糖。在氮源方面 ,所有菌株均能较好利用氯化铵和酪蛋白水解物 ( casein) ,但都不能用
硝酸钾作为唯一氮源。此外 ,两种供试氨基酸也都能被大多数菌株利用。
2. 2. 4　细胞化学组分　分别利用薄层层析 ( TLC)和氨基酸分析仪测定了 10株试验菌株细
胞壁的氨基酸组分。氨基酸分析仪测得所有菌株的细胞壁均含有谷氨酸 ( Glu)、甘氨酸
( Gly )、丙氨酸 ( Ala)和二氨基庚二酸 ( DAP)。根据它们的氨基酸分子比 ,有 8株试验菌株与
文献〔5〕中的青铜小单孢菌相似 ,其特点都是甘氨酸含量显著高于丙氨酸 ,因而符合胞壁Ⅱ
型的特征。
另外 2株的分子比则与普通链孢囊菌相似 , 都是甘氨酸含量低 , 而丙氨酸含量高 ,这与
胞壁Ⅲ型的氨基酸分子比特征相一致 , 明显区别于上述 8株菌。此外 , 利用薄层层析测得所
有菌株的二氨基庚二酸均为 meso-DAP。结果显然表明 10株纯培养物既有属胞壁Ⅱ型 , 也
有属胞壁Ⅲ型 (表 3)。
表 3还列出了用薄层层析法测定纯培养物全细胞鉴别性糖组分的结果。有 5株含有半乳
糖和木糖 ; 2株含有半乳糖、木糖和阿拉伯糖 ; 2株只含有半乳糖 ; 1株只含有木糖。
2. 2. 5　 DN A中 G+ C mol%　用高压液相色谱法 ( HPLC)检测 10株纯培养物的 G+ C mol
%含量为 65% ～ 74% , 2株参考菌 ( M g+ 和 AirI2 )分别为 69%和 75%。这一结果与文献记载
的弗兰克氏菌 G+ C mol%为 66%～ 72% 〔 11〕、 68%～ 72% 〔12〕和 66%～ 76% 〔13〕相比较都没有
很大差异。
752期 胡传炯等:马桑根瘤内生菌纯培养物的分离、回接及其生物学特性
表 3　纯培养物的细胞化学组分
Table 3　 Cell chemical composition o f pur e cultures
回接成功的菌株 Effectiv e st rains
菌株 St rains 胞壁类型
CWT1)
全细胞糖型
W CSP2)
回接未成功的菌株 Inef fective s t rains
菌株 St rains 胞壁类型
CW T
全细胞糖型
WCSP
Cs150 Ⅱ g+ x+ a Cs642 Ⅱ g
Cs641 Ⅱ g+ x Cs205 Ⅱ g+ x
Cs521 Ⅱ g+ x Cs120 Ⅱ g+ x
Cs103 Ⅲ g Cs470 Ⅱ x
Cs146 Ⅱ g+ x+ a Cs155 Ⅲ g+ x
　 1) CW T: Cell w all t ype; 2) W CSP: Whole cell s ugar pat tern; g: 半乳糖 Galactos e; x: 木糖 Xylos e; a: 阿拉伯糖 Ara-
binos e
3　讨论
3. 1　根瘤内生放线菌一般并无特别的营养需求。但是它生长很缓慢 , 菌体倍增时间为 2～
5d或更长。所以在分离培养过程中 ,只要始终保持培养物不被污染 ,获得纯培养物一般是有
保障的。本实验采用温室中人工接种形成的马桑根瘤进行分离 , 较之用野生根瘤直接分离 ,
更容易得到纯培养物 , 其主要原因在于温室中采集的根瘤不易破损 , 使表面灭菌彻底。野
生根瘤则不然 ,由于瘤龄大 , 裂片多 ,采集时易于破损 ,分离也不及时。这样就很难进行适度
的表面灭菌 ,结果不是灭菌不彻底而造成污染 ,就是灭菌过度杀灭内生菌而不能生长。
3. 2　回接试验发现 24株纯培养物能够侵染原寄主并结瘤。其中有少数菌株还用其它回接
方法也证明能结瘤 , 表明回接试验是成功的。然而结瘤植株的百分率 ( 8. 3% )和每棵结瘤植
株的根瘤数 (平均 1. 2个 )也都很低。说明纯培养物回接的适宜条件和技术还有待于进一步
探明和改进。
3. 3　马桑内生菌纯培养物在表型特征上有的与已知 Frank ia菌相同 , 而有的则差异明显。
纯培养物的形态和液体培养特征 ; 生理 B型菌株能侵染原寄主而 A型却不能 ; B型菌株大
多不利用单、双糖而 A型则能利用等特征均与其它 Frankia相同。但在以下特征上不同于
其它 Frankia : ( 1)生理类型除 A、 B两型外 ,尚出现一种 A、 B混合型 ; ( 2)胞壁类型既有Ⅲ
型的 (含 meso-DAP) ,也有Ⅱ型的 (含 meso-DAP和甘氨酸 ) , 而目前普遍认为 Frankia胞
壁类型仅为Ⅲ型〔 10, 11〕 ; ( 3) 纯培养物的全细胞糖型更加多样化 , 出现了诸如木糖和半乳糖
以及木糖、半乳糖和阿拉伯糖等新组合。这些结果既揭示了 Frankia菌的多样性 , 又为
Frankia菌的进一步分群积累了丰富资料。
参　考　文　献
1　 周平贞 ,吴　捷 , 陈华癸 . 马桑共生固氮根瘤及其内生放线菌 . 微生物学报 . 1986, 26( 3): 277～ 281
2　 吴　捷 , 陈华癸 ,周平贞 . 尼泊尔马桑放线菌共生固氮根瘤的感染和发育过程 . 武汉植物学研究 . 1991, 9( 1): 1～ 4
3　 梁蓉芳 ,袁德军 ,夏　涛 ,等 . 放线菌细胞壁化学组分分析方法的研究 . 微生物学通报 . 1990, 17( 4): 247～ 249
4　 胡传炯 , 周平贞 ,周　启 . 马桑菌株生物学特性 . 微生物学报 . 1996, 32( 2): 132～ 137
5　 白林泉 , 袁德军 ,胡传炯 ,等 . 利用氨基酸分子比鉴别放线菌细胞壁类型的研究 . 微生物学通报 . 1997, 24 (1) : 9～
13
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Isolation , Nodulation and Characterization of Nodular
Endophytes of Coriaria nepalensis
Hu Chuanjiong
1　 Zhou Ping zhen2　 Zhou Qi1　 Chen Huakui1
(1College of L ife Science and Technology , Huazhong Agricultural University , Wuhan　430070;
　2Oil Crops Institute ,Chinese Academy of Agricultural Sciences)
Abstract　 273 actinomycete isola tes w ere obtained from nodules that w ere induced in
g reenhouse by the crushed field nodules collected f rom various loca tions in Southw est Chi-
na. 24 isola tes w ere show n to nodulate the plants th rough po t experiments. Pheno typic
cha racteriza tion o f ten isolates w as studied and revealed that they w ere of typical mo rpho-
logical and cul tural characteristics of Frankia . These strains w ere divided into physio logi-
cal g roup A and B, as w ell as group A /B which w as an intermedia te g roup between the A
and B strains. It w as evident that strains f rom physio logical B but A w ere able to nodulate
the ho st plant. How ever, one of the tw o iso la tes belonging to g roup A /B nodulated the
host. The ulti li zation o f carbon and ni t rog en source fo r the st rains was simi lar to o ther
Frankia st rains. Some st rains were of typeⅢ cell wall , some o thers w ere of typeⅡ .
Whole cell sugar pat terns w ere diverse. Besides the common non-diagnostic sugars, most
st rains contain xylo se and galacto se, some contain xylo se, galacto se and arabinose and
o thers contain galacto se only. The G+ C mol % o f st rains w ere determined ranging f rom
69 to 74.
Key words　 Coriaria nepalensis; Endophy tes; Iso lation; Back-inocula tion; Pheno-
typic characterization
772期 胡传炯等:马桑根瘤内生菌纯培养物的分离、回接及其生物学特性