全 文 ：基因组学与应用生物学，2014年，第 33卷，第 5期，第 1104-1109页
Genomics and Applied Biology, 2014, Vol.33, No.5, 1104-1109
技术专题
Technology Feature
亮菌多糖提取工艺优化及体外抗肿瘤活性研究
蔡凤 1,2 李铁军 1 解彦刚 1 黄纯 2 高向东 2*
1南通职业大学化学与生物工程学院,南通, 226007; 2中国药科大学,南京, 211100
*通讯作者, xdgao@cpu.edu.cn
摘 要 本研究进行了亮菌多糖水提、醇沉工艺条件优选并对其体外抗肿瘤活性进行了研究。以多糖含量
为指标，设计正交试验考察料液比、浸提温度、浸提时间、浸提次数对亮菌多糖提取工艺的影响；以多糖得
率为评价指标，选乙醇浓度、乙醇加入量、醇沉时间为考察因素，通过正交试验优选醇沉工艺；采用MTT法测
定多糖对 4种肿瘤细胞增殖的抑制作用。结果显示亮菌多糖最佳浸提工艺为料液比 1:10，提取次数为 2次，浸
提温度 100℃，时间 6 h；最佳醇沉条件为加 4倍量 95%乙醇沉淀 15 h；醇沉后多糖得率 11.768%。活性测
试结果显示 ATPS对人红白血病细胞和人肺癌细胞株的生长具有抑制作用。优选的提取工艺条件稳定，可
为 ATPS的生产提供实验依据；亮菌多糖对体外肿瘤细胞的生长具有抑制作用。
关键词 亮菌多糖,提取工艺,正交试验,抗肿瘤活性
Optimization of Extraction Process and Anti-Tumor Activity in vitro of
Polysaccharides from Armillariella tabescens
Cai Feng 1,2 Li Tiejun 1 Xie Yangang 1 Huang Chun 2 Gao Xiangdong 2*
1 School of Chemical and Biological Engineering, Nantong Vocational College, Nantong, 226007; 2 China Pharmaceutical University, Nanjing, 211100
* Corresponding author, xdgao@cpu.edu.cn
DOI: 10.13417/j.gab.033.001104
Abstract To study the optimization of technology conditions for Armillariella tabescens polysaccharide by water
extraction and alcohol precipitation, and their antitumor activities in vitro. With the content of polysaccharide as
index, orthogonal test was designed to investigate the influence of solid-liquid ratio, extraction temperature, extrac-
tion time and extraction times on extraction technology of Armillariella tabescens polysaccharide; With the yield
of polysaccharide as comprehensive evaluation index, the concentration of alcohol precipitation, the amount of
ethanol and the alcohol precipitation time were chosen as factors to optimize the technology of alcohol precipita-
tion by orthogonal test; The inhibitory effects of polysaccharide against proliferation of 4 kinds tumer cells were
measured by MTT assay. The results showed that the optimum extracting conditions are 1:10 solid liquid ratio,
100℃, twice and 6 h, and the optimum alcohol precipitation conditions were 4-fold 95% ethanol for 12 hours. Un-
der the optimum extracting conditions, the yield of polysaccharide was 11.768%. The anti-proliferative effect of
ATPS against the human leukemia cell and the lung cancer cell was effective. The optimized extraction conditions
in this study was proved to be stable, which could provide experimental basis for production of ATPS; ATPS has
obvious ant-itumor effects against tumor cell lines in vitro.
Keywords Armillariella tabescens polysaccharide, Extraction technology, Orthogonal design, Antitumor ex-
periment
基金项目：本研究由江苏省高等职业院校国内高级访问学者计划资助项目(2014)资助
亮菌(Armillariella tabescens)又称假蜜环菌，分类
上是真菌界担子菌门假蜜环菌属，生长于较湿润的阔
叶树基或树桩，因菌丝体在暗处能发出浅蓝色荧光而
得名，在我国江苏、浙江、安徽和河北等地分布广泛，
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
是一种价值很高的食用兼药用大型真菌，含有多
种氨基酸、多糖、多肽和亮菌甲素等生物活性成
分(蔡凤等, 2013)。亮菌多糖(Armillariella tabescens
polysaccharides,ATPS)是亮菌中重要的天然有效成分，
具有抗肿瘤防辐射、增强免疫力、清除自由基和抗衰
老、加速造血而起到升白等作用(高婷等, 2005;马金
宝等, 2008)。亮菌多糖作为一类低毒高活性、来源广
的生物大分子物质，日益受到人们的注意和重视(沈
业寿和马金宝, 2007)。但是传统亮菌多糖的提取工艺
得到的多糖粗品的收率低，加上提取成本较高，使得
亮菌多糖的开发利用受到限制。
本文针对亮菌多糖的提取条件，采用四因素三
水平正交实验对亮菌多糖提取工艺进行优化；采用
乙醇沉淀法设计三因素三水平正交实验对其最佳分
离工艺进行研究，旨在确定亮菌多糖最佳提取工艺；
至今尚未见有文献报道亮菌多糖对体外培养的肿瘤
细胞的抑制作用研究，笔者应用 MTT法对粗提的
ATPS进行体外抗肿瘤活性初步筛选，以期为进一步
探讨其抗肿瘤作用的机制奠定基础实验依据。
1结果与分析
1.1葡萄糖标准曲线的绘制
以吸光度A值为纵坐标，标准葡萄糖浓度C为横
坐标绘制标准曲线，拟合回归方程A=0.0179C-0.034 1，
试验号
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
k1
k2
k3
R
优水平
Optimum level
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
40.855
37.502
38.844
13.618
12.501
12.948
1.117
A1
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
35.436
36.888
44.877
11.812
12.296
14.959
3.147
B3
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
38.899
38.006
40.296
12.966
12.669
13.432
0.763
C3
D
1
2
3
3
1
2
2
3
1
35.212
41.358
40.631
11.737
13.786
13.544
2.049
D2
吸光度
Absorbance
0.164
0.204
0.261
0.171
0.161
0.237
0.197
0.193
0.203
多糖含量(%)
The content of polysaccharide (%)
11.067
13.302
16.486
11.458
10.899
15.145
12.911
12.687
13.246
表 1浸提条件正交试验
Table 1 The results of the extracting conditions by orthogonal experiment
相关系数 R2=0.995 0，葡萄糖浓度在 0~140 滋g /mL
范围内服从朗伯 -比耳定律。
1.2亮菌多糖浸提条件正交试验
对表 1正交结果进行分析，可以看出 RB>RD>
RA>RC，即四因素中温度对亮菌多糖的提取影响最
大。从K值得出理论上四因素三水平最佳浸提工艺为
A1B3C3D2，但从正交试验结果中的多糖得率可看出最
佳条件是 A1B3C3D3 (多糖得率为 16.486)，对 A1B3C3D2
组合进一步验证结果表明，其多糖得率为 16.627%，
由此确定亮菌多糖最优提取条件分别是料液比
1:10，浸提温度为 100℃，时间 6 h，提取次数为 2次。
1.3亮菌多糖醇沉条件优化的正交试验
由表 2正交实验结果分析得出：乙醇浓度、乙醇
加入量以及沉淀时间三个因素对分离亮菌多糖的影
响大小顺序为乙醇浓度 A>沉淀时间 C>乙醇加入量
B，即乙醇浓度对分离亮菌多糖的影响最大，三因素
三水平最佳分离组合为 A3B1C3，即乙醇沉淀法分离
亮菌多糖以乙醇浓度为 95%，4倍体积的乙醇加入
量，沉淀时间 15 h为最优水平。
1.4验证实验
称取亮菌粗粉 10 g，按照料液比 1:10，浸提温度
100℃，浸提时间 6 h，提取次数 2次，
1105
取得的上清液浓缩后经 Sevag试剂脱蛋白、蒸
馏水除杂后，按照醇沉最优工艺参数，乙醇浓度为
95%，4倍体积的乙醇加入量，沉淀时间 15 h，收集沉
淀并用无水乙醇、丙酮淋洗，真空干燥后得 ATPS粉
末，称重。以上步骤重复 3次，计算出多糖的平均得
率为 11.768%。由此可见，在最佳工艺条件下提取亮
菌多糖，多糖得率较高，具有良好的重复性。
1.5 ATPS对肿瘤细胞生长的抑制作用
在浓度为 62.5~2 000 滋g/mL范围内，ATPS对体
表 2醇沉条件正交试验
Table 2 The results of the alcohol precipitation conditions by orthogonal experiment
试验号
No.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
K1
K2
K3
k1
k2
k3
R
优水平
Optimum level
A
1
1
1
2
2
2
3
3
3
23.176
24.308
31.854
7.725
8.103
10.618
2.893
A3
B
1
2
3
1
2
3
1
2
3
27.208
25.669
26.461
9.069
8.556
8.820
0.513
B1
C
1
2
3
2
3
1
3
1
2
24.253
26.819
28.266
8.084
8.940
9.422
1.338
C3
多糖质量(g )
Quality (g)
0.733 9
0.786 2
0.797 5
0.811 9
0.854 1
0.764 8
1.175 0
0.926 6
1.083 8
多糖得率(%)
Yield (%)
7.339
7.862
7.975
8.119
8.541
7.648
11.750
9.266
10.838
表 3 ATPS对 Hela, K562, A549, HepG2细胞生长的抑制作用(n=6, x依s)
Table 3 The inhibitions of ATPS against the growth of cells Hela, K562, A549, HepG2 (n=6, x依s)
组别
Group
阴性对照组
The negative control group
亮菌多糖(滋g/mL)
ATPS (滋g/mL)
62.5
125
250
500
1000
2000
Hela
A 490抑制率(%)
A 490 inhibition rate (%)
0.675依0.017 -
0.671依0.021 0.59
0.677依0.043 -0.30
0.673依0.026 0.30
0.669依0.005 0.89
0.675依0.013 0
0.659依0.022 2.4
K562
A 490抑制率(%)
A 490 inhibition rate (%)
0.631依0.022 -
0.436依0.034 a 30.90
0.403依0.017 a 36.13
0.365依0.008 b 42.16
0.311依0.026 b 50.71
0.284依0.041 b 54.99
0.210依0.013 b 66.72
A549
A 490抑制率(%)
A 490 inhibition rate (%)
0.592依0.027 -
0.440依0.009 b 25.68
0.413依0.015 b 30.24
0.375依0.016 b 36.66
0.316依0.027 b 46.62
0.287依0.021 a 51.52
0.211依0.004 b 64.36
HepG2
A 490抑制率(%)
A 490 inhibition rate (%)
0.714依0.007 -
0.711依0.013 0.42
0.714依0.041 0
0.714依0.011 0
0.702依0.032 1.68
0.695依0.006 2.66
0.673依0.024 5.74
注:与阴性对照组比较; a: p<0.05; b: p<0.01
Note: Compared with the negative contol group; a: p<0.05; b: p<0.01
外培养的人 Hela细胞、HepG2细胞无明显的抑制作
用，但对 K562和 A549肿瘤细胞的生长具有一定的
抑制作用，随着浓度的增大而增强，呈现良好的剂量-
效应关系(表 3)。
2讨论
多糖是一类由单糖分子经脱水以苷键缩合而成
的天然高分子化合物，一般为非晶形，是一类可以调
控细胞分裂分化、调节细胞生长和抗衰老的活性多
糖，是当今医药和食品工业共同研究和关注的焦点
亮菌多糖提取工艺优化及体外抗肿瘤活性研究
Optimization of Extraction Process and Anti-Tumor Activity in vitro of Polysaccharides from A. tabescens 1106
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
(葛文漪等, 2012)。
亮菌多糖是极性大分子化合物，主要采用水提
醇沉的方法进行分离提取，目前工业生产中需要解
决的首要难题是提取工艺的优化以及多糖中蛋白
质、色素、低聚糖等杂质的去除。本研究以水作为溶
媒，将亮菌粗粉先用热水浸提，通过正交设计，考察
了料液比、浸提温度、浸提时间以及浸提次数对提
取多糖含量的影响；利用多糖难溶于一定体积分数
乙醇的性质，考察了乙醇浓度、乙醇加入量(倍)和醇
沉时间等因素对多糖提取得率的影响，对水提醇沉
工艺进行优化。试验结果表明，温度以及乙醇浓度
对亮菌多糖的提取影响最大。在得到最佳提取条件
后，我们进行了验证实验，表明该工艺条件合理、多
糖得率高。
目前国内外对亮菌多糖在防辐射、抗肿瘤、增强
人体免疫力等功能方面虽有研究，但还不够透彻和
全面，至今尚未见有文献报道亮菌多糖在临床上用
于肿瘤治疗。本实验采用MTT法对亮菌多糖粗提物
的体外抗肿瘤活性进行了初步测定，结果显示该多
糖在浓度为 62.5~2 000 滋g/mL范围内，对体外培养
的人 Hela 细胞、HepG2细胞无明显的抑制作用，但
对 K562和 A549肿瘤细胞的生长具有一定的抑制
作用，随着浓度的增大而增强，呈现良好的剂量 -效
应关系。结合本实验室前期对分离提纯后亮菌多糖
进行的体内抗肿瘤研究，结果表明提纯后的亮菌多
糖对小鼠移植性实体型肉瘤 S180具有较好的抗肿
瘤活性，提示亮菌多糖对肿瘤细胞的抑制机制有待
于进一步研究。
3材料与方法
3.1亮菌多糖
亮菌发酵菌粉由南京林通生物技术公司提供，
亮菌多糖由本实验室制备。
3.2细胞株
人宫颈癌细胞(Hela)、人红白血病细胞(K562)、
人肺癌细胞株(A549)、人肝癌细胞(HepG2)，中国药
科大学新药中心提供。
3.3主要试剂
RPMI1640培养基(GIBCO公司)；胎牛血清(杭
州四季青生物工程研究所)；四甲基偶氮唑盐(MTT，
上海生工生物工程技术服务有限公司)；其它试剂均
为国产分析纯。
3.4主要仪器
Primo R高速冷冻离心机(Heraeus Biofuge, Ger-
man)；722 分光光度计 (上海精密科学仪器有限公
司)；FD-1B-50冷冻干燥机(常州锐品精密仪器有限
公司 )；二氧化碳培养箱 (Forma Scientific 公司 )；
DG3022A型酶联免疫检测仪(国营华东电子管厂)。
3.5方法
3.5.1标准曲线的绘制
精密称取葡萄糖标准品配制成浓度为 0.1 mg/mL
的标准溶液。分别吸取标准液 0、0.2 mL、0.4 mL、
0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、1.2 mL、1.4 mL加入 10 mL
具塞刻度试管中，加去离子水至 2 mL。各管分别加
入 5%苯酚溶液 1 mL、浓硫酸 5 mL，40℃水浴中恒温
30 min后，取出室温放置 15 min。以 2 mL蒸馏水按
上述操作做空白，紫外分光光度计在 490 nm处测定
吸光度值。以吸光度(A)为纵坐标、葡萄糖含量 C (滋g)
为横坐标，得线性回归方程。
3.5.2亮菌多糖含量计算
苯酚 - 硫酸法(Dubois et al., 1956)，将各级得
到的亮菌多糖溶解并稀释至适当浓度，移取 1 mL
按 3.5.1项下方法测定吸光度，按下列公式计算多
糖含量(%)：
多糖含量(%)=(C伊D伊n伊10-6)/(W伊V)伊100
式中：C为供试样品经回归方程计算出的葡萄
糖含量(滋g)；D为供试样品液的总体积(mL)；n为稀
释倍数；W为供试样品的质量(g)；V为样品测定液的
体积(mL)。
3.5.3亮菌多糖浸提条件的优化
采用 L9(34)正交试验设计对亮菌多糖的浸提条
件进行优选。选取料液比、浸提温度、浸提时间、浸提
次数 4个因素，每个因素选取 3个水平，试验因素水
平设计见表 4。
称取亮菌粗粉 5 g分装在 9个三角瓶中，按表 1
正交设计方案浸提。每个三角瓶的浸提液均按下列
过程操作：取上清液并浓缩，向浓缩液中加入 Sevag
试剂 4:1混合，振摇 30 min，离心取上清液，重复多
次。将收集的上清液用蒸馏水透析以除去里面的小
分子杂质，经离心分离后收集上层多糖。将收集的多
糖用蒸馏水定容至 500 mL，吸取 1 mL至 100 mL容
量瓶中进行定容稀释，取稀释后的样品液 1.0 mL，按
照 3.5.1项下处理样品，490 nm处测定其吸光度，按
照 3.5.2项下计算多糖含量。
1107
3.5.4亮菌多糖醇沉条件的优化
采用乙醇沉淀法对浸提后的亮菌多糖进行分
离，选取乙醇浓度、乙醇加入量、醇沉时间三个因素，
每个因素选取 3个水平，以多糖得率为指标，对醇沉
工艺进行优选。试验因素水平设计见表 5。
准确称取亮菌粗粉 90 g，以 1.2项下得到的最佳
浸提条件进行提取，取得的上清液浓缩后经 Sevag试
剂脱蛋白、蒸馏水除杂后，将所得上清液分成 9份，每
份相当于含有亮菌粗粉 10 g，均按表 4设计的 L9(34)
正交试验方案进行醇沉分离，收集沉淀，沉淀用无水
乙醇、丙酮淋洗，真空干燥后得淡棕色 ATPS粉末。
称取干燥至恒重的 9份样品，并按下式计算亮菌多
糖的得率：
多糖得率=提取的多糖质量 /样品质量伊100%
3.5.5验证实验
为验证上述水提、醇沉正交试验所确定工艺的优
劣和稳定性，按照筛选的最佳工艺条件，进行重复验
证试验。称取亮菌粗粉 10 g，按照最优工艺参数提取
其中的多糖，计算多糖得率。
3.5.6亮菌多糖体外抗肿瘤活性实验
3.5.6.1冻存细胞的复苏与传代
将冻存在液氮中的人宫颈癌细胞(Hela)、人红白
血病细胞(K562)、人肺癌细胞株(A549)和人肝癌细胞
(HepG2)复苏，选取鲜活的处于对数生长期的细胞备
用。加入浓度为 0.25%的胰蛋白酶溶液作为消化液，
37℃消化 2 min后镜检，当细胞浓缩变圆，相互之间
不再连接成片时停止消化，加入含 10%胎牛血清的
RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，用培养液调整
细胞浓度至 4~6伊104/mL备用。
3.5.6.2 MTT法测定药效
取 3.5.6.1项下浓度已调至 4~6伊104/mL的细胞
接种于 96孔板中，每孔 100 滋L，在 37℃5% CO2饱
和水汽二氧化碳培养箱中培养。培养 24 h后吸去原
培养基，每孔加入以无血清培养液配制的不同浓度
药物(取 3.5.4项下得到的淡棕色亮菌多糖粉末ATPS,
将 ATPS按实验设计所需由高浓度到低浓度稀释)
100 滋L，每个浓度设 6个复孔。同时设空白对照组
(培养液)、阴性对照组(培养液+细胞)各 100 滋L，每
组设 6个复孔。37℃培养 48 h后，每孔加入 5 mg/mL
MTT溶液 10 滋L，在 37℃继续孵育 4 h 后终止培
养，小心吸弃孔内上清液。每孔加入二甲基亚砜
150 滋L，微量震荡器震荡 10 min，酶联免疫检测仪
波长 490nm处测定 OD值。每次实验重复 3次，按
下式计算细胞增殖抑制率(鄂征, 1988,人民卫生出版
社, pp.87)：
细胞增殖抑制剂=(1- 给药组平均 OD/阴性对照
组平均 OD)伊100%
作者贡献
蔡凤是本研究的实验设计和实验研究的执行
人；李铁军和解彦刚参与具体实验和结果分析；黄纯
完成论文的写作与修改。全体作者都阅读并同意最
终的论文文本。
表 4浸提条件正交试验因素与水平
Table 4 The factors and levels of the extracting conditions by orthogonal experiment
水平
Levels
1
2
3
A料液比
A solid liquid ratio
1:10
1:15
1:20
B浸提温度(℃)
B extraction temperature (℃)
80
90
100
C浸提时间(h)
C extraction time (h)
4
5
6
D浸提次数
D extraction times
1
2
3
因素
Factors
表 5醇沉条件正交试验因素与水平
Table 5 The factors and levels of the alcohol precipitation conditions by orthogonal experiment
水平
Levels
1
2
3
A乙醇浓度(%)
A concentration of ethanol(%)
80
90
95
B乙醇加入量(倍)
B ethanol quantity (times)
4
5
6
C醇沉时间(h)
C time of alcohol precipitation (h)
5
10
15
因素
Factors
亮菌多糖提取工艺优化及体外抗肿瘤活性研究
Optimization of Extraction Process and Anti-Tumor Activity in vitro of Polysaccharides from A. tabescens 1108
基因组学与应用生物学
Genomics and Applied Biology
致谢
本研究由江苏省高等职业院校国内高级访问学
者计划资助项目。感谢中国药科大学生命科学院的高
向东教授在本实验过程中的技术支持和有益的建议。
参考文献
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