全 文 :紫外分光光度法测定醉鱼草果实中总黄酮含量
肖龙泉1,任亚硕2,3,吴德玲2,3,汪天明2,3
(1.安徽省亳州市人民医院,安徽 亳州 236804;2.安徽中医药大学,安徽 合肥 230038;
3.安徽省现代中药重点实验室,安徽 合肥 230038)
摘要:目的 建立醉鱼草果实中总黄酮的含量测定方法。方法 采用紫外分光光度法,以芦丁为对照品,通过亚硝酸钠 -硝
酸铝 -氢氧化钠系统显色法测定醉鱼草果实中总黄酮的含量。结果 芦丁在 8. 56 ~ 51. 36 mg·L -1范围内吸光度与浓度呈
良好的线性关系(A = 0. 012 0 C - 0. 007 1,r = 0. 999 8) ,平均加样回收率为 98. 76%,相对标准偏差为 1. 74%(n = 6) ,所测得
醉鱼草果实中总黄酮含量为 5. 29%。结论 该方法操作快速、简便,结果准确可靠,可用于醉鱼草果实中总黄酮成分的含量
测定。
关键词:醉鱼草果实;总黄酮;紫外分光光度法;含量测定
doi:10. 3969 / j. issn. 1009 - 6469. 2015. 02. 017
Determination of flavonoids in the fruits of
Buddleja lindleyana Fort. by ultraviolet spectrophotometry
XIAO Long-quan1,3,REN Ya-shuo2,3,WU De-ling2,3,et al
(1. The People’s Hospital of Bozhou,Anhui 236804,China;2. School of Pharmacy,Anhui University of
Traditional Chinese Medicine,Anhui,Hefei 230038,China;3. Anhui Key Laboratory of Modernized
Chinese Material,Hefei,Anhui 230038,China)
Abstract:Objective To establish a method for determining total flavonoids in the fruit of Buddleja lindleyana Fort. Methods The
content of total flavonoids was detected by ultraviolet spectrophotometry (US). It was performed on rutin (as a control)and a sample
with sodium nitrite-aluminum nitrate and sodium hydroxide as color-developing agent. Results The good linearity between concentra-
tions and absorbance of rutin was found within the range of 8. 56 to 51. 36 mg·L -1(A = 0. 012 0 C - 0. 007 1,r = 0. 999 8). The aver-
age recovery was 98. 76% and relative standard deviation was 1. 74% (n = 6). The fruit of Buddleja lindleyana Fort. contained 5. 29%
of total flavonoids. Conclusions This method can be used for determining flavonoids in the fruit of Buddleja lindleyana Fort. because of
its rapidness,simplicity,accurateness and reliability.
Key words:fruits of Buddleja lindleyana Fort.;total flavonoids;ultraviolet spectrophotometry;content determination
基金项目:国家自然科学基金(No 81373841) ;安徽省教育厅自然科学研究重点项目(No KJ2013A170)
通信作者:吴德玲,男,教授,研究方向:中药活性成分研究,E-mail:dlwu7375@ sina. com
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(收稿日期:2014 - 03 - 11,修回稿:2014 - 07 - 09)
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醉鱼草果实药材是马钱科植物醉鱼草(Buddle-
ja lindleyana Fort.)的果实,具有祛风除湿、止咳化
痰、散瘀之功效[1]。文献报道醉鱼草属植物中含有
丰富的化合物种类,包括黄酮类,三萜类及苯乙醇
苷类等[2 - 5],其中黄酮类成分,具有多种药理活
性[6 - 7]。经前期研究发现,醉鱼草果实中同样含有
丰富的黄酮类化合物[8],主要为芦丁、槲皮素、木犀
草素等,是其主要药理活性成分,其中芦丁是一种
脱氢黄素酮的糖苷,在各类植物中普遍存在,且含
量较高。醉鱼草果实中黄酮类含量的测定方法未
见报道,为了进一步研究醉鱼草果实中的黄酮类成
分,本研究选用芦丁作为对照品,通过经典的亚硝
酸钠 -硝酸铝 -氢氧化钠显色法[9 - 10],建立了醉鱼
草果实中黄酮类成分的含量测定方法。
1 仪器与试剂
紫外 -可见分光光度计(UV-757CRT 型,上海
精科) ;电子分析天平(AB135-S,瑞士 METTLER
TOLEDO) ;HH-S恒温水浴锅(江苏金坛市国胜实验
仪器厂) ;高速中药粉碎机(FZ-02,浙江省温岭市百
乐粉碎设备厂)。芦丁对照品(批号:100080 -
200306:中国药品生物制品检定所) ;醉鱼草果实
(于 2008 年 12 月采自安徽舒城万佛山,经安徽中
医药大学药学院刘守金教授鉴定为马钱科植物醉
鱼草的果实) ;亚硝酸钠,硝酸铝,氢氧化钠,甲醇等
均为分析纯;水(实验室自制超纯水)。
2 方法及结果
2. 1 对照品及供试品溶液的制备 精密称取在五
氧化二磷减压干燥器中干燥 36 h 芦丁对照品 10. 7
mg,置 50 mL容量瓶中,甲醇溶解后定容至刻度即
得;芦丁对照品溶液浓度为 0. 214 g·mL -1。精密
称取醉鱼草果实粗粉 1 g,置 50 mL 圆底烧瓶中,加
甲醇 20 mL回流提取提取 3 次,每次 1 h,合并滤液,
并定容至 100 mL,即得供试品溶液。
2. 2 检测吸收波长的确定 分别精密吸取上述对
照品溶液 6. 0 mL、供试品溶液 3. 0 mL,置 25 mL 容
量瓶中,加蒸馏水至 6 mL,再加入 5%的 NaNO2 溶
液 1 mL,摇匀后静置 6 min;加 10% Al(NO3)3 溶液
1 mL,摇匀后静置 6 min;加 4% NaOH 溶液 10 mL,
加水定容至刻度,摇匀后静置 15 min。紫外—可见
分光光度仪全波长扫描的结果显示,对照品及供试
品溶液在 510 nm 波长处显示有较强吸收峰,因此
选定 510 nm作为检测波长,见图 1。
图 1 芦丁对照品溶液
注:(a)和供试品溶液(b)紫外扫描图。
2. 3 标准曲线的建立 分别精密吸取芦丁对照品
溶液 0. 0、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0 mL 于 25 mL
容量瓶中,均加入蒸馏水至 6 mL,按“2. 2”项下步骤
操作,以第一份作为空白对照,在 510 nm 处测定各
对照品溶液的吸光度值。吸光度值分别为 0. 099,
0. 195,0. 301,0. 404,0. 505,0. 612。以吸光度值
(A)为纵坐标,芦丁对照品溶液浓度(C)为横坐标,
绘制标准曲线,得线性回归方程为:A = 0. 012 0 C
- 0. 007 1 (r = 0. 999 8) ,结果表明芦丁在 8. 56 ~
51. 36 mg·L -1浓度范围内呈良好的线性关系。
2. 4 精密度考察 精密吸取同一供试品溶液 1
mL,置 25 mL 容量瓶中,按“2. 2”步骤中的方法显
色,重复测定 6 次,吸光度值分别为:0. 247,0. 246,
0. 246,0. 245,0. 248,0. 247。计算其吸光度值的相
对标准偏差(relative standard deviation,RSD)=
0. 43%。结果表明仪器精密度良好。
2. 5 稳定性考察 分别精密吸取供试品溶液和对
照品溶液各 1 mL于 25 mL容量瓶中,按“2. 2”步骤
操作,测定吸光度,每隔 5 min 测定一次,连续 25
min,考察其显色稳定性。吸光度值分别为:0. 247,
0. 245,0. 245,0. 241,0. 243,0. 242。结果表明,供试
品及对照品溶液在显色系统完全反应后 25 min 内,
具有良好稳定性。
2. 6 重复性考察 分别精密称取醉鱼草果实粗粉 1
g,共 6份,按“2. 2”步骤制备供试品溶液并测定其吸
光度,吸光度值分别为:0. 251,0. 242,0. 249,0. 255,
0. 245,0. 243。计算得药材中总黄酮含量平均值为
5. 29%,RSD =1. 83%。结果表明重复性良好。
2. 7 加样回收率试验 分别精密吸取含量已知的
醉鱼草果实供试品溶液 1 mL,6 份,置于 25 mL 容
量瓶中,各加入芦丁对照品溶液 2. 5 mL,按“2. 2”步
骤,测定吸光度,计算加样回收率及 RSD,结果见表
1,表明本方法结果准确可靠。
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表 1 加样回收率试验
序号 原含量 /mg 加样量 /mg 吸光度 测得量 /mg 回收率 /% 平均回收率 /% RSD /%
1 0. 5315 0. 5350 0. 501 1. 058 98. 41
2 0. 5263 0. 5350 0. 496 1. 047 97. 33
3 0. 5310 0. 5350 0. 499 1. 053 97. 57
4 0. 5319 0. 5350 0. 511 1. 078 102. 07
5 0. 5270 0. 5350 0. 500 1. 056 98. 88
6 0. 5341 0. 5350 0. 502 1. 060 98. 30
98. 76 1. 74
2. 8 样品含量测定 精密称取醉鱼草果实粗粉 1
g,甲醇回流提取 3 次,每次 1 h,滤液合并后,用甲醇
定容至 100 mL容量瓶,平行测定 3 组,按“2. 2”步
骤显色并测定吸光度,计算得供试品中总黄酮含量
分别为 5. 28%、5. 32%、5. 41%,平均含量为
5. 34%。
3 讨论
3. 1 供试品的提取 醉鱼草果实含多种黄酮类化
合物,黄酮类化合物的提取实验前期分别采用纯
水、不同浓度的乙醇及甲醇作为提取溶媒,考察醉
鱼草果实中总黄酮含量,结果发现甲醇回流提取
时,所测得药材中总黄酮含量最高[11],进而选定甲
醇为醉鱼草果实药材的提取溶剂。
3. 2 测定方法的确定 黄酮成分的分析测定方法
主要包括薄层扫描法、HPLC 法、紫外分光光度法
等。波层扫描法测定醉鱼草果实中总黄酮的影响
因素太多,测定结果不理想。总黄酮中成分种类较
多,通过 HPLC法测定每个黄酮成分的含量,来测定
总黄酮的含量也并不现实。醉鱼草果实中黄酮类
化合物的紫外区间的吸光度值虽不一致,但其黄酮
母核能与亚硝酸钠—硝酸铝—氢氧化钠系统反应,
通过被亚硝酸钠还原,再加硝酸铝络合,在碱性条
件下显红色,在 510 nm 处有较强吸收,吸收峰稳定
无干扰,根据显色后吸光度的不同,可实现对其黄
酮类成分的测定,既能有效避开其他成分对黄酮测
定的影响,又能保证结果的准确性[12]。在实验中还
发现,显色反应会随着显色温度和显色时间的变化
而变化,25 min 内变化较缓,25 min 后其吸光度值
会下降,因此实验过程中应严格控制条件,尽量排
除干扰。
本文以芦丁为对照品,采用亚硝酸钠—硝酸
铝—氢氧化钠法,测定醉鱼草果实中黄酮类成分的
总含量,结果显示该法操作快速、简便,结果准确可
靠,可作为醉鱼草果实总黄酮的含量测定方法。
3. 3 应用前景 醉鱼草作为中医的传统药材,但
其果实的研究较少,这不利用醉鱼草资源的综合开
发,本研究通过紫外分光光度法测定醉鱼草果实中
总黄酮含量,建立了醉鱼草果实总黄酮的含量测定
方法,为醉鱼草这一传统药用资源的综合利用提供
了参考依据。
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(收稿日期:2014 - 02 - 11,修回日期:2014 - 05 - 27)
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