全 文 ：第４６卷第５期 华中师范大学学报（自然科学版） Ｖｏｌ．４６ Ｎｏ．５
２０１２年１０月 ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＨＵＡＺＨＯＮＧ ＮＯＲＭＡＬ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．） Ｏｃｔ．２０１２
收稿日期：２０１２－０４－１１．
基金项目：２０１２年内江师范学院重点项目（１２ＮＪＺ０１）．
＊通讯联系人．Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｂｉ０５＠１２６．ｃｏｍ；ｌｉａｏｌｉｍｉｎ５２３＠１２６．ｃｏｍ．
文章编号：１０００－１１９０（２０１２）０５－０５６９－０４
响应曲面法用于微波提取柠檬皮渣总黄酮研究
廖立敏１，２＊，刘 月１，李建凤１，２，王 碧１，２＊
（１．内江师范学院 化学化工学院，四川 内江６４１１１２；
２．四川省高等学校“果类废弃物资源化”重点实验室，四川 内江６４１１１２）
摘 要：以６０℃下烘干的柠檬皮渣为原料，通过响应曲面法设计微波提取柠檬皮渣总黄酮试验
方案，考察了乙醇浓度、液料比和微波处理时间对提取率的影响，最终得出微波提取柠檬皮渣总
黄酮的最佳工艺条件，即乙醇浓度为６０％、液料比为３０、微波处理时间为４ｍｉｎ．在此条件下进行
３次平行试验，结果表明柠檬皮渣总黄酮的提取率高，而且试验的重现性好，此时平均提取率
为１．２０％．
关键词：柠檬皮；总黄酮；响应曲面；微波提取
中图分类号：Ｒ２８４；Ｑ９４６ 文献标识码：Ａ
柠檬、橙皮渣含有丰富的黄酮类化合物，黄酮
类化合物具有抗炎、抗动脉硬化、抗癌、抗氧化等多
重生理功效 ［１－３］．将柠檬、橙皮渣中的黄酮类化合
物进行提取并加以利用，不仅可以实现其应有的经
济价值，而且还能在一定程度上缓解其对当地环境
的压力．目前研究者们在提取天然产物中黄酮类化
合物方面已经做了许多有意义的工作，涉及到的提
取方法主要有有机溶剂回流提取法、酶法辅助提取
法、超声波萃取法、ＣＯ２ 超临界流体萃取法等［４－７］．
微波辐射过程是高频电磁波穿透萃取介质，到达物
料的内部维管束和腺胞系统．由于吸收微波能，细
胞内部温度迅速上升，使其细胞内部压力超过细胞
壁膨胀承受能力，细胞破裂加速有效成分的浸出．
响应面法是一种综合试验设计和数学建模的优化
方法，可以在小区域内采用多元二次回归方程来拟
合因素与响应值之间的函数关系，通过对回归方程
的分析来寻求最优工艺参数，计算方便［８］．本文以
乙醇为溶剂，采用微波提取柠檬皮渣中的黄酮类
物质．在前期研究的基础上，通过响应面法对工
艺条件进行优化，为进一步开发利用提供有价值
的工艺参数．
１ 实验部分
１．１ 实验材料
仪器：ＵＷａｖｅ－１０００型微波·紫外·超声波
三位一体合成萃取反应仪 （上海新仪微波化学
科技有限公司）；Ｔ６型新世纪紫外可见分光光
度计 （北 京 普 析 通 用 仪 器 有 限 责 任 公 司）；
ＢＴ２２４Ｓ电子分析天平（北京赛多利斯仪器系统有
限公司）．
试剂与原料：芦丁（国药集团化学试剂有限公
司，含量大于９５％）；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、
三氯化铝、三氯化铁、乙醇、镁粉及浓硫酸均为分析
纯（ＡＲ）；柠檬（购自四川安岳）．
１．２ 实验方法
１．２．１ 黄酮类化合物鉴定 盐酸－镁粉反应：在少
许样品液中加入少量镁粉，再滴加１～２滴浓盐酸，
在沸水溶液中加热２～３ｍｉｎ，观察结果［９］．铝盐反
应：在少许样品液中滴加１％ＡｌＣｌ３ 溶液２～３滴，
观察结果［１０］．浓硫酸反应：在少许样品液中加入少
量浓硫酸观察结果［１１］．
１．２．２ 黄酮类化合物提取与测定 标准溶液的配
制：准确称取芦丁对照品１２．５０ｍｇ于５０ｍＬ容量
瓶中，加入７５％乙醇溶解，定容摇匀得芦丁标准
液，浓度为０．２５０ ０ｍｇ／ｍＬ．
测定波长选择：精密量取芦丁对照液１．００ｍＬ
于比色管中，加５％ＮａＮＯ２ 溶液０．４ｍＬ，摇匀，放
置５ｍｉｎ，加１０％Ａｌ（ＮＯ３）３ 溶液０．４ｍＬ，摇匀，放
置５ｍｉｎ，加４％ＮａＯＨ溶液４ｍＬ，再用蒸馏水稀释
至１０ｍＬ，摇匀，放置１５ｍｉｎ，在波长３００～６００ｎｍ
５７０ 华中师范大学学报（自然科学版） 第４６卷
之间扫描，确定测定波长为５１０ｎｍ．
标准曲线的绘制：精确量取芦丁对照品溶液
０、０．５０、１．００、１．５０、２．００ｍＬ分别于１０ｍＬ比色
管，７５％乙醇定容，在５１０ｎｍ处测吸光度，以吸光
度为纵坐标，浓度为横坐标，得到标准曲线的回归
方程为：Ａ＝１１．８１１０Ｃ－０．０１０８，Ｒ２＝０．９９９５．
总黄酮的提取与测定：柠檬皮洗净后６０℃下
干燥，粉碎，过６０目筛，称取３．０００ｇ于一圆底烧
瓶中，按设定的液固比加入一定浓度的乙醇，微波
功率为４００ Ｗ 下处理一段时间后过滤，定容至
１００ｍＬ，吸取１ｍＬ显色后蒸馏水定容至１０ｍＬ，
测定吸光度值．根据标准曲线回归方程，得到提取
液浓度，总黄酮提取率按下式计算：Ｅｔ％＝（Ｃ×Ｖ
×ｎ）／Ｗ，式中Ｅｔ％为提取率；Ｃ为测得的提取液
浓度；Ｖ 为提取液体积；ｎ为稀释倍数；Ｗ 为原料的
质量．
２ 结果与讨论
２．１ 黄酮类化合物的鉴定
黄酮类化合物鉴定试验结果见表１，各现象说
明提取液中有黄酮类化合物的存在．
表１ 黄酮类化合物鉴定结果
Ｔａｂ．１ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄ
试剂 盐酸 －镁粉 １％ＡｌＣｌ３ 浓硫酸
现象 浅红色 黄色 黄色
２．２ 黄酮类化合物提取与测定
２．２．１ 提取试验方案设计及结果 应用 Ｄｅｓｉｇｎ
Ｅｘｐｅｒｔ ７．０．０软件，采用Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ Ｄｅｓｉｇｎ设
计试验方案，以乙醇浓度（Ａ）、液料比（Ｂ）、提取时
间（Ｃ）为自变量，黄酮提取率（Ｙ）为因变量共设立
了１７个处理组（共５组全“０”水平处理组）．因子编
码及水平见表２，由Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ Ｄｅｓｉｇｎ设计方案
所得的试验结果见表３（全“０”水平处理两组，共进
行１４组试验）．
表２ 试验因素与水平
Ｔａｂ．２ Ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
因素
编码值
－１ ０ １
乙醇浓度（Ａ）／％ ４０ ６０ ８０
液料比（Ｂ）／（ｍＬ·ｇ－１） １０ ２０ ３０
提取时间（Ｃ）／ｍｉｎ ２ ４ ６
表３ Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ设计方案及响应值
Ｔａｂ．３ Ｔａｂｌｅ ２Ｂｏｘ－Ｂｅｈｎｋｅｎ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｖａｌｕｅｓ
处理号 乙醇浓度（Ａ） 液料比（Ｂ） 提取时间（Ｃ） 吸光度 黄酮得率／％ 模型值
１ ０ ０ ０ ０．４０５ １．１７ １．１７
２ １ －１ ０ ０．３５８ １．０４ １．１０
３ ０ －１ １ ０．３９５ １．１５ １．１１
４ ０ ０ ０ ０．４０５ １．１７ １．１７
５ １ １ ０ ０．４０８ １．１８ １．１５
６ －１ ０ １ ０．３１４ ０．９２ ０．９６
７ ０ １ １ ０．３９１ １．１３ １．１７
８ ０ －１ －１ ０．３３１ ０．９６ ０．９５
９ １ ０ －１ ０．３５４ １．０３ ０．９８
１０ －１ ０ －１ ０．３３４ ０．９７ １．００
１１ １ ０ １ ０．４０７ １．１８ １．１５
１２ －１ －１ ０ ０．３３７ ０．９８ ０．９７
１３ －１ １ ０ ０．４１７ １．２１ １．１４
１４ ０ １ －１ ０．３８９ １．１３ １．１７
用Ｄｅｓｉｇｎ Ｅｘｐｅｒｔ ７．０．０软件将表３中试验数
据进行多元回归拟合，得到提取率对乙醇浓度
（Ａ）、液料比（Ｂ）、提取时间（Ｃ）的二次多项式回归
模型．对所建立的响应模型进行方差分析，结果见
表４．由表４可知，试验选用的模型显著（Ｐ＜
０．０５）；相关系数Ｒ＝０．９１８，说明该模型拟合程度
良好，试验误差较小，可以用此模型来分析以乙醇
为溶剂采用微波对柠檬皮渣黄酮的提取．
第５期 廖立敏等：响应曲面法用于微波提取柠檬皮渣总黄酮研究 ５７１
表４ 回归模型方差分析
Ｔａｂ．４ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｖａｒｉａｎｃｅ ｆｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｍｏｄｅｌ
变异来源 平方和 自由度ｄｆ 均方 Ｆ值 Ｐ值 是否显著
模型 ０．１３０ ９ ０．０１４ ５．８７ ０．０１４６ 显著（Ｐ≦０．０５）
残差 ０．０１７ ７ ２．４２３Ｅ－００３ － － －
失拟项 ０．０１７ ３ ５．６５３Ｅ－００３ － － －
纯误差 ０．０００ ４ ０．０００ － － －
总和 ０．１５０ １６ － － － －
回归模型系数显著性检验结果见表５．由表５
可知，模型一次项Ａ显著（Ｐ＜０．０５）、Ｂ高度显著（Ｐ
＜０．０１）、Ｃ较显著（Ｐ＜０．１）；二次项Ａ２ 显著、Ｂ２ 较
显著、Ｃ２ 显著；交互项ＡＣ较显著，其他不显著．
表５ 回归模型系数显著性检验
Ｔａｂ．５ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ
因子项 回归系数 自由度 Ｆ值 Ｐ值 是否显著
Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ １．１７０ １ － － －
Ａ ０．０４４ １ ６．４３ ０．０３８ ９ 显著
Ｂ ０．０６５ １ １３．８４ ０．００７ ４ 高度显著
Ｃ ０．０３５ １ ４．０２ ０．０８５ １ 较显著
ＡＢ －０．０２１ １ ０．７３ ０．４２１ ７ 不显著
ＡＣ ０．０５１ １ ４．３４ ０．０７５ ８ 较显著
ＢＣ －０．０４３ １ ３．１２ ０．１２０ ５ 不显著
Ａ２ －０．０６９ １ ８．３０ ０．０２３ ６ 显著
Ｂ２ －８．７５０Ｅ－００４ １ １．３３１Ｅ－００３ ０．９７１ ９ 较显著
Ｃ２ －０．０７９ １ １０．８８ ０．０１３ １ 显著
２．２．２ 响应面分析 响应面图形是响应值对各因
素所构成的三维空间的曲面图，图１、图２和图３
为乙醇浓度（Ａ）、液料比（Ｂ）、微波处理时间（Ｃ）在
其中一个固定时，另外两个对柠檬皮渣黄酮提取率
的交互影响曲面图．比较图１、图２和图３的曲面
图可知，液料比（Ｂ）对柠檬皮渣黄酮提取率的影响
最为显著，表现为曲线较陡，而乙醇浓度（Ａ）和微
波处理时间（Ｃ）次之，表现为曲线相对平滑．微波
处理时间（Ｃ）的影响最小，可能是黄酮类化合物在
４００Ｗ 微波处理下浸出速度都很大，故提取时间的
图１ 乙醇浓度、液料比及其交互作用对提取率的影响
Ｆｉｇ．１ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｌｉｑｕｉｄ－ｓｏｌｉｄ
ｒａｔｉｏ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ
变化对黄酮提取率影响不显著．比较图１、图２和
图３的等高线图可以看乙醇浓度（Ａ）和微波处理
时间（Ｃ）的交互影响相对较为显著，表现为等高线
最密集，结果与方差分析相似．
２．２．３ 优化与验证 根据回归模型，得出柠檬黄
酮最佳提取条件为：乙醇浓度为６３．３３％，液料比
为３０，微波处理时间为４ｍｉｎ，黄酮得率的理论预
测值为１．２４％．考虑到实际操作的便利，确定柠檬
皮中黄酮类化合物的优化提取工艺条件为：乙醇浓
度为６０％，液料比为３０，微波处理时间为４ｍｉｎ，重
图２ 乙醇浓度、提取时间及其交互作用对提取率的影响
Ｆｉｇ．２ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｔｉｍｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ
５７２ 华中师范大学学报（自然科学版） 第４６卷
图３ 液料比、提取时间及其交互作用对提取率的影响
Ｆｉｇ．３ Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｌｉｑｕｉｄ－ｓｏｌｉｄ ｒａｔｉｏ，ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ
ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｙｉｅｌｄ
复试验３次，得黄酮提取率分别为１．２３％、１．１９％、
１．１７％，平均值为１．２０％，与预测值为１．２４％基本
一致，即该方程与实际情况拟合很好，响应曲面法
适用于对柠檬黄酮的微波提取工艺分析和参数
优化．
３ 结论
本文采用响应面法设计试验方案，得出柠檬皮
渣总黄酮微波法乙醇提取的最佳工艺条件，在此条
件下对柠檬皮渣总黄酮进行提取，不但提取率更
高，而且试验的重现性好．本文对于天然产物中有
效成分的提取研究具有一定的参考价值．
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Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｆ
ｌｅｍｏｎ ｐｅｅｌ ｕｓｉｎｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ
ＬＩＡＯ Ｌｉｍｉｎ１，２，ＬＩＵ Ｙｕｅ１，ＬＩ Ｊｉａｎｆｅｎｇ１，２，ＷＡＮＧ Ｂｉ １，２
（１．Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｎｅｉｊｉａｎｇ Ｎｏｒｍａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｎｅｉｊｉａｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ ６４１１１２；
２．Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｆｒｕｉｔ Ｗａｓｔｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ａｎｄ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ，Ｎｅｉｊｉａｎｇ，Ｓｉｃｈｕａｎ ６４１１１２）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｌｅｍｏｎ ｐｅｅｌ，ｗｈｉｃｈ ｗａｓ ｄｒｉｅｄ ａｔ ６０℃，ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｒａｗ ｍａｔｅｒｉａｌｓ ｉｎ ｔｈｉｓ
ｓｔｕｄｙ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｆ ｌｅｍｏｎ ｐｅｅｌ ｗｅｒｅ
ｐｌａｎｎｅｄ ｂｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ．Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｌｃｏｈｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｒａｔｉｏ ｏｆ
ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ａｎｄ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｎ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗｅｒｅ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ
ｂｅｓｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ．Ｗｈｅｎ ｔｈｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎ－
ｔｒａｔｉｏｎ ｗａｓ ６０％，ｔｈｅ ｒａｔｉｏ ｏｆ ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｔｏ ｓｏｌｉｄ ｗａｓ ３０ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｉｍｅ ｗａｓ
４ｍｉｎ，ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｒｅａｃｈｅｄ ｔｈｅ ｍａｘｉｍｕｍ．Ｕｎｄｅｒ ｔｈｉｓ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ，３ｐａｒａｌｅｌｅｄ ｅｘ－
ｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ｃａｒｒｉｅｄ ｏｕｔ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａ－
ｖｏｎｏｉｄｓ ｏｆ ｌｅｍｏｎ ｐｅｅｌ ｗｅｒｅ ｈｉｇｈ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｇｏｏｄ ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ；ｔｈｅ ａｖ－
ｅｒａｇｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｗａｓ １．２０％．Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ｍａｙ ｈａｖｅ ａ ｃｅｒｔａｉｎ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ ｖａｌｕｅ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ａｃｔｉｖｅ ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ ｏｆ ｎａｔｕｒａｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｌｅｍｏｎ ｐｅｅｌ；ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ；ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ