全 文 ：［１１］Ｍｏｒｎｅ　Ｄｕ　Ｐｌｅｓｓｉｓ，Ｂｒｅｎｄｏｎ　Ｐｅａｒｃｅ，Ｃｌｉｆｆｏｒｄ　Ｊａｃｏｂｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅ－
ｎｅｔｉｃ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｏｒｇａｎｉｃ　ｃａｔｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１　ｇｅｎｅ
（ＳＬＣ２２Ａ１）ｗｉｔｈｉｎ　ｔｈｅ　Ｃａｐｅ　Ａｄｍｉｘｅｄ　ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈ　Ａｆ－
ｒｉｃａ［Ｊ］．Ｍｏｌ　Ｂｉｏｌ　Ｒｅｐ，２０１４，４２（３）：６６５－６７２．
［１２］Ｈｏｏｓａｉｎ　Ｎ，Ｎｅｎｅ　Ｓ，Ｐｅａｒｃｅ　Ｂ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ
ａｎｄ　Ｈａｐｌｏｔｙｐｅ　Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｏｒｇａｎｉｃ　Ｃａｔｉｏｎ　Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ　１
ｇｅｎｅ　ｉｎ　ｔｈｅ　Ｚｕｌｕ　Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｏｕｔｈ　Ａｆｒｉｃａ［Ｊ］．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ，２０１４，８（７）：７４８－７５４．
［１３］Ｐａｏｌｏ　ＡＤ，Ｐｏｌｉｌｏ　Ｍ，Ｃａｐｅｃｃｈｉ　Ｍ．Ｔｈｅ　ｃ．４８０Ｃ＞Ｇ　ｐｏｌｙｍｏｒ－
ｐｈｉｓｍ　ｏｆ　ｈＯＣＴ１　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ　ｉｍａｔｉｎｉｂ　ｃｌｅａｒａｎｃｅ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ａｆ－
ｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｍｙｅｌｏｉｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］．Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ　Ｊ，
２０１４，１４（４）：３２８－３３５．
［１４］Ｓａｎｇ－Ｈｏ　Ｓ，Ｊｅｏｎｇ，Ｙｏｕｎｇ－Ｊｏｏｎ　Ｌ．ＯＣＴ－１　ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｉｓ　ａｓ－
ｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｐｏｏｒ　ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｗｅｌ－ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａ－
ｔｅｄ　ｇａｓｔｒｉｃ　ｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．Ｔｕｍｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１４，３５（６）：５５０１－５５０９．
［１５］Ｓｉｎｇｈ　Ｏ，Ｃｈａｎ　ＪＹ．ＳＬＣ２２Ａ１－ＡＢＣＢ１　ｈａｐｌｏｔｙｐｅ　ｐｒｏｆｉｌｅｓ　ｐｒｅｄｉｃｔ
ｉｍａｔｉｎｉｂ　ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ　ｉｎ　Ａｓｉａｎ　ｐａｔｉｅｎｔｓ　ｗｉｔｈ　ｃｈｒｏｎｉｃ　ｍｙｅ－
ｌｏｉｄ　ｌｅｕｋｅｍｉａ［Ｊ］．ＰＬｏＳ　Ｏｎｅ，２０１２，７（１２）：１－１１．
［１６］Ｎｉｅｓ　ＡＴ，Ｋｏｅｐｓｅｌ　Ｈ，Ｗｉｎｔｅｒ　Ｓ，ｅｔ　ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｏｒｇａｎｉｃ
ｃａｔｉｏｎ　ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ　ＯＣＴ１（ＳＬＣ２２Ａ１）ａｎｄ　ＯＣＴ３（ＳＬＣ２２Ａ３）
ｉｓ　ａｆｆｅｃｔｅｄ　ｂｙ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｎｄ　ｃｈｏｌｅｓｔａｓｉｓ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｌｉｖｅｒ［Ｊ］．
Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００９，５０（４）：１２２７－１２４０．
［１７］Ｇｒａｈａｍ　ＧＧ，Ｐｕｎｔ　Ｊ，Ａｒｏｒａ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｌｉｎｉｃａｌ　ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ
ｏｆ　ｍｅｔｆｏｒｍｉｎ［Ｊ］．Ｃｌｉｎ　Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ，２０１１，５０（２）：８１－９８．
［１８］Ｏｈｉｓｈｉ　Ｙ，Ｎａｋａｍｕｔａ　Ｍ，Ｉｓｈｉｋａｗａ　Ｎ，ｅｔ　ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｐｏｌｙｍｏｒ－
ｐｈｉｓｍｓ　ｏｆ　ＯＣＴ－１　ｃｏｎｆｅｒ　ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ　ｔｏ　ｓｅｖｅｒｅ　ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ
ｐｒｉｍａｒｙ　ｂｉｌｉａｒｙ　ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ　ｉｎ　Ｊａｐａｎｅｓｅ　ｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．Ｊ　Ｇａｓｔｒｏｅｎ－
ｔｅｒｏｌ，２０１４，４９（２）：３３２－３４２．
［１９］冀玮．ＳＬＣ２２Ａ１和ＳＬＣ２１Ａ６遗传多态性对口服降糖药药代动
力学和药效学的影响［Ｄ］．长沙：中南大学，２００９．
［收稿日期］２０１６－０３－０７
［基金项目］全国名老中医药专家传承工作室建设项目（国中医药人教发〔２０１４〕２０号）　［作者简介］刘丽萍，女，硕士，研究方向：主要从事中
药制剂及质量控制研究；电话：０７３１－８４３２７４５８，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｐ９１１１１３＠１６３．ｃｏｍ　［通讯作者］雷鹏，男，副教授，研究方向：中药新药研发及中药质
量控制。电话：０７３１－８４３２７４５８，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｐ７２２２００３＠１６３．ｃｏｍ
正交试验优选枸橘的提取工艺
刘丽萍１，雷鹏１，２，谭润雅１，２，辛锦钰２，黄琪１，刘海涛１，周政１，２　 （１．中南大学湘雅医院药学部，湖南 长沙４１０００８；２．
中南大学药学院，湖南 长沙４１００１３）
［摘要］　目的：对枸橘的提取工艺进行优选。方法：以乙醇浓度、提取时间、溶剂倍数为考察因素，枸橘苷、欧前胡素的转移率
为评价指标，运用正交试验优化提取的最佳工艺条件，同时用方差分析对其进行评价。结果：枸橘最佳提取工艺条件为７０％
乙醇溶液提取两次，第１次６倍量，提取６０　ｍｉｎ，第２次４倍量，提取４５　ｍｉｎ。结论：优选出的提取工艺简单、科学、合理，为枸
橘的开发利用奠定基础。
［关键词］　枸橘；提取工艺；正交试验；枸橘苷；欧前胡素
［中图分类号］Ｒ９２７．２　［文献标识码］Ａ　［文章编号］１００１－５２１３（２０１６）２０－１７３５－０４　ＤＯＩ：１０．１３２８６／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｈｉｎｈｏｓｐｐｈａｒｍａｃｙｊ．２０１６．２０．０３
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ｐｏｎｃｉｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ（Ｌ．）Ｒａｆ．ｂｙ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ
ＬＩＵ　Ｌｉ－ｐｉｎｇ１，ＬＥＩ　Ｐｅｎｇ１，２，ＴＡＮ　Ｒｕｎ－ｙａ１，２，ＸＩＮ　Ｊｉｎ－ｙｕ２，ＨＵＡＮＧ　Ｑｉ　１，ＬＩＵ　Ｈａｉ－ｔａｏ１，ＺＨＯＵ　Ｚｈｅｎｇ１，２　（１．
Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｘｉａｎｇｙａ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｎａｎ　Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１０００８，Ｃｈｉｎａ；２．Ｓｃｌｏｏｌ　ｏｆ　Ｐｈａｒｍａｃｅｕ－
ｔｉｃ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｅｎｔｒａｌ　Ｓｏｕｔｈ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｕｎａｎ　Ｃｈａｎｇｓｈａ　４１００１３，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ　Ｔｏ　ｏｐｔｉｍｉｚｅ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｏｆ　Ｐｏｎｃｉｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ （Ｌ．）Ｒａｆ．ＭＥＴＨＯＤＳ　Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｄｅｓｉｇｎ
ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｏｂｓｅｒｖｅ　ａｎｄ　ｓｔｕｄｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｅｔｈａｎｏｌ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ　ｔｉｍｅ，ｓｏｌｖｅｎｔ　ｍｕｌｔｉｐｌｅｓ　ｆｏｒ　Ｐｏｎｃｉｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉ－
ａｔａ （Ｌ．）Ｒａｆ，ｐｏｎｃｉｒｉｎ　ａｎｄ　ｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎ　ｙｉｅｌｄ　ａｓ　ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ　ｉｎｄｅｘ，ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ　ｗａｓ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｅｖａｌｕａｔｅ　ｔｈｅ　ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．
ＲＥＳＵＬＴＳ　Ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｗａｓ　ａｓ　ｆｏｌｏｗｓ：Ｐｏｎｃｉｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ（Ｌ．）Ｒａｆ．ｗａｓ　ｅｘｔｒａｃｔｅｄ　ｗｉｔｈ７０％ａｌｃｏｈｏｌ　ｆｏｒ　ｔｗｏ
ｔｉｍｅｓ，ｆｉｒｓｔ　ｗｉｔｈ　ｓｉｘ　ｔｉｍｅｓ　ｏｆ　ｖｏｌｕｍｅ，６０　ｍｉｎｕｔｅｓ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｓｅｃｏｎｄ　ｗｉｔｈ　ｆｏｕｒ　ｔｉｍｅｓ　ｏｆ　ｖｏｌｕｍｅ，４５　ｍｉｎｕｔｅｓ　ｆｏｒ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ．
ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ　Ｔｈｉｓ　ｏｐｔｉｍｕｍ　ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ　ｉｓ　ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ｒｅａｓｏｎａｂｌｅ　ａｎｄ　ｓｔａｂｌｅ，ａｎｄ　ｌａｙ　ａ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　ａｎｄ
ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｐｏｎｃｉｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ（Ｌ．）Ｒａｆ．
ＫＥＹ　ＷＯＲＤＳ：Ｐｏｎｃｉｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ（Ｌ．）Ｒａｆ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ　ｐｒｏｃｅｓｓ；ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ；ｐｏｎｃｉｒｉｎ；ｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎ
　　枸橘系芸香科枳属植物枸橘Ｐｏｎｃｉｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉ－
ａｔａ（Ｌ．）Ｒａｆ．的干燥幼果或未成熟果实。主要分
布于福建、河北、河南、山东、湖南、江苏等地，其性味
苦温，归肝、脾经，具有疏肝和胃，理气止痛，消积化
滞的功效［１］，临床上用于食积痰滞、胸腹胀满、胃下
垂等症［２］。近年来，国内外研究者对枸橘药材的关
·５３７１·中国医院药学杂志２０１６年１０月第３６卷第２０期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｏｃｔ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．２０
注度提高，且许多枸橘制剂已应用于临床［３－４］，但鲜
有枸橘提取工艺研究的报道。现代研究表明，枸橘
中含有枸橘苷、柚皮苷和芸香柚皮苷等黄酮类化合
物，其中枸橘苷是枸橘中特有的黄酮类成分，具有促
进胃肠动力、抗炎等药理活性，是枸橘“和胃”作用的
主要有效成分［５－７］。同时含有欧前胡素等香豆素类
化合物，具有镇痛、抗抑郁及中枢神经保护等药理作
用，为枸橘止痛的活性物质之一［８－１３］。本实验采用
正交试验法，首次以枸橘苷和欧前胡素共同作为考
查指标对枸橘药材的提取工艺进行优化，以期得到
最佳的提取工艺。
１　材料
Ａｇｉｌｅｎｔ１１００高效液相色谱仪（配Ｇ１３１１Ａ四元
梯度泵、Ｇ１３１３Ａ自动进样器、Ｇ１３１５Ａ二极管阵列
检测器，美国安捷伦科技有限公司）；ＫＳ－６００Ｄ超声
清洗机 （宁波科生仪器厂）；ＡＧ－２８５型电子天平
（瑞士 Ｍｅｔｔｌｅｒ公司）；ＦＷ１７７型中药粉碎机（天津
市泰斯特仪器有限公司）；１０１－１－ＢＳ型电热恒温鼓
风干燥箱（上海跃进医疗器械厂）；ＤＫ－９８－ＩＩ型电热
恒温水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公司）。枸橘苷
（批号１２１２１５０６，成都普瑞法科技有限公司）；欧前
胡素（批号１４０３１７１０，成都普瑞法科技有限公司）；
枸橘药材［批号２０１５０３０３，河北同源堂有限公司提
供，经中南大学湘雅医院曾嵘教授鉴定为芸香科枳
属植物枸橘Ｐｏｎｃｉｒｕｓ　ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ （Ｌ．）Ｒａｆ．的干燥
幼果或未成熟果实］；高效液相用甲醇、乙腈为色谱
纯，其他试剂均为分析纯。
２　方法与结果
２．１　ＨＰＬＣ法测定枸橘苷的含量
２．１．１　色谱条件　色谱柱：Ｐｒｏｍｏｓｉｌ　Ｃ１８柱（２５０
ｍｍ×４．６　ｍｍ，５μｍ）；柱温：３０℃；检测波长：２８３
ｎｍ；流速：１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；流动相：乙腈（Ａ）－水（Ｂ），
梯度洗脱（０～８　ｍｉｎ，２３％Ａ；８～１３　ｍｉｎ，２３％Ａ→
３３％Ａ；１３～２０　ｍｉｎ，３３％Ａ→５０％Ａ；２０～２５　ｍｉｎ，
５０％Ａ→９５％Ａ）；进样量：１０μＬ；在上述条件下，枸
橘苷的理论板数不低于５　０００。对照品和样品的色谱
图见图１。
２．１．２　对照品溶液制备　精密称取１２．７３　ｍｇ的枸
橘苷对照品，将其置于２５　ｍＬ量瓶中，加甲醇溶解
并稀释至刻度，摇匀，得５０９．２０μｇ·ｍＬ
－１枸橘苷对
照品储备液。吸取上述储备液２　ｍＬ置于１０　ｍＬ量
瓶中，用甲醇定容，摇匀，制得１０１．８４μｇ·ｍＬ
－１的对
照品溶液。
２．１．３　供试品溶液的制备及测定　精密量取枸橘药
材提取后所得滤液２　ｍＬ置２５　ｍＬ量瓶中，无水乙醇
定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用０．４５μｍ微孔
滤膜过滤，在上述色谱条件下测定枸橘苷的含量。
＊－枸橘苷
＊－ｐｏｎｃｉｒｉｎ
图１　对照品（Ａ）和供试品溶液（Ｂ）的 ＨＰＬＣ图
Ｆｉｇ　１　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ａ）ａｎｄ　ｔｅｓｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂ）
２．１．４　药材中枸橘苷含量的测定　称取约０．３　ｇ的
枸橘药材粉末，精密称定，置于２５　ｍＬ量瓶中，加入
６０％甲醇约２０　ｍＬ，超声６０　ｍｉｎ，将其冷却至室温，加
６０％甲醇定容至刻度后摇匀并过滤，取续滤液。进样
前用０．４５μｍ微孔滤膜过滤。在上述色谱条件下进
样１０μＬ测定峰面积，计算枸橘苷含量为０．６３２％。
２．１．５　线性关系考察　精密移取对照品溶液１，２，
５，１０，１２，１４μＬ注入高效液相色谱仪，按“２．１．１”的
色谱条件测定，记录色谱图。以峰面积（Ｙ）为纵坐
标，进样量 （Ｘ）为横坐标，进行线性回归，得到枸橘
苷的 回 归 方 程 Ｙ ＝１６３．６６　Ｘ －９．４１４　７，ｒ ＝
０．９９９　８。表明枸橘苷进样量在０．１０１　８～１．４２５　８μｇ
间线性关系良好。
２．１．６　精密度试验　精密吸取对照品溶液１０μＬ
注入高效液相色谱仪，按“２．１．１”项下的色谱条件连
续进样６次，测定峰面积。结果枸橘苷峰面积ＲＳＤ
为０．９１％，表明仪器精密度良好。
２．１．７　重复性试验　精密称取同一批次药材粉末，
按“２．１．４”项下方法平行制备６份供试品溶液，测定
峰面积，计算枸橘苷含量的ＲＳＤ为１．８２％，表明该
方法重复性良好。
２．１．８　稳定性试验　精密称取药材粉末，按“２．１．４”
项下方法制备供试品溶液，在相同色谱条件下于０，
２，４，６，８，１０，１２　ｈ测定，测得枸橘苷峰面积的ＲＳＤ为
０．３１％，表明供试品在１２　ｈ内稳定性良好。
２．１．９　加样回收率试验　精密称取已知含量的同
一批枸橘样品粉末６份，每份约０．１５　ｇ，精密加入枸
·６３７１· 中国医院药学杂志２０１６年１０月第３６卷第２０期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｏｃｔ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．２０
橘苷对照品储备液１．５　ｍＬ，按“２．１．４”项下方法制
备供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，计算回收
率，枸橘苷的平均回收率为１００．７０％，ＲＳＤ 为
２．６０％，表明该方法准确度良好。
２．２　ＨＰＬＣ法测定欧前胡素的含量
２．２．１　色谱条件　色谱柱：Ｐｒｏｍｏｓｉｌ　Ｃ１８柱（２５０
ｍｍ×４．６　ｍｍ，５μｍ）；柱温：２５℃；检测波长：２４８
ｎｍ；流速：１．０ｍＬ·ｍｉｎ－１；流动相：乙腈－水（７０∶３０）；
进样量：１０μＬ；在上述条件下，欧前胡素的理论板
数不低于５　０００。对照品和样品的色谱图见图２。
＊－欧前胡素
＊－ｉｍｐｅｒａｔｏｒｉｎ
图２　对照品（Ｃ）和供试品溶液 （Ｄ）的 ＨＰＬＣ图
Ｆｉｇ　２　ＨＰＬＣ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍｓ　ｏｆ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｃ）ａｎｄ　ｔｅｓｔ　ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｄ）
２．２．２　对照品溶液的制备　精密称取４．８７　ｍｇ欧
前胡素对照品，置于２５　ｍＬ量瓶中，加甲醇溶解并
稀释至刻度，摇匀，得１９４．８μｇ·ｍＬ
－１欧前胡素对照
品储备液。精密移取上述储备液２　ｍＬ置１０　ｍＬ量
瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，即得３８．９６μｇ·
ｍＬ－１的对照品溶液。
２．２．３　供试品溶液的制备及测定　精密量取枸橘
药材提取后所得滤液５　ｍＬ置２５　ｍＬ量瓶中，无水
乙醇定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，用０．４５μｍ
微孔滤膜过滤，在上述色谱条件下测定欧前胡素的
含量。
２．２．４　药材中欧前胡素含量的测定　称取约０．８　ｇ
的枸橘药材粉末，精密称定，置于２５　ｍＬ量瓶中，加
入８０％甲醇约２０　ｍＬ，超声提取６０　ｍｉｎ，将其冷却
至室温，加８０％甲醇定容至刻度后摇匀并滤过，取
续滤液。进样前用０．４５μｍ微孔滤膜过滤，在上述
色谱条件下进样１０μＬ测定峰面积，计算欧前胡素
含量为０．７０４　ｍｇ·ｇ－１。
２．２．５　线性关系考察　精密移取对照品溶液１，５，
１０，１５，２０，２５μＬ，注入高效液相色谱仪，按“２．２．１”
色谱条件测定，记录色谱图。以峰面积（Ｙ）为纵坐
标，进样量（Ｘ）为横坐标，进行线性回归，得到欧前
胡素的回归方程Ｙ＝１９３．１２　Ｘ－０．０５３　７，ｒ ＝
０．９９９　９。结果表明欧前胡素进样量在０．０３９　０～
０．９７４　０μｇ之间呈良好的线性关系。
２．２．６　精密度试验　精密吸取对照品溶液１０μＬ
注入高效液相色谱仪，连续进样６次，测定峰面积。
结果欧前胡素峰面积ＲＳＤ为０．５７％，表明仪器精密
度良好。
２．２．７　重复性试验　精密称取同一批次药材粉末，
按“２．２．４”项下方法平行制备６份供试品溶液，测定
峰面积，计算欧前胡素含量的ＲＳＤ为１．６８％，表明
该方法重复性良好。
２．２．８　 稳定性试验 　 精密称取药材粉末，按
“２．２．４”项下方法制备供试品溶液，在相同色谱条件
下于０，４，６，８，１０，１２　ｈ测定，测得欧前胡素峰面积
的ＲＳＤ为０．３０％，表明供试品在１２　ｈ内稳定性良
好。
２．２．９　加样回收率试验　精密称取已知含量的同
一批枸橘样品粉末６份，每份约０．４　ｇ，精密加入欧
前胡素对照品储备液２．０ｍＬ，按“２．２．４”项下方法
制备供试品溶液，按上述色谱条件测定含量，计算回
收率，欧前胡素的平均回收率为１００．８０％，ＲＳＤ为
２．００％，表明该方法准确度良好。
２．３　正交试验
２．３．１　试验设计　在单因素试验的基础上，采用
Ｌ９（３４）正交表安排枸橘醇提工艺，以枸橘苷、欧前胡
素的转移率为评价指标，选择乙醇浓度、提取时间、
溶剂倍数３个因素，每个因素设３个水平，见表１。
表１　正交试验因素水平表
Ｔａｂ　１　Ｆａｃｔｏｒｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ
水平
因素
Ａ乙醇浓度／％ Ｂ提取时间／ｍｉｎ　 Ｃ溶剂倍数／倍
１　 ６０　 ９０，６０　 １０，８
２　 ７０　 ６０，４５　 ８，６
３　 ８０　 ４５，３０　 ６，４
２．３．２　正交试验方法及结果分析　称取枸橘药材
３０　ｇ，按正交设计表所列各条件回流提取，按“２．１”
及“２．２”项下方法测定提取液中枸橘苷及欧前胡素
含量，并计算枸橘苷、欧前胡素的转移率，有关实验
数据见表２，方差分析见表３。
　　由正交试验结果直观分析和方差综合分析可
知，影响枸橘苷和欧前胡素转移率的因素大小顺序
为Ａ＞Ｂ＞Ｃ，因素Ａ对欧前胡素转移率有显著性影
响，对枸橘苷转移率无显著性影响，Ａ２提取效果最
好，宜选 Ａ２；Ｂ因素对试验结果均无显著意义，且
·７３７１·中国医院药学杂志２０１６年１０月第３６卷第２０期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｏｃｔ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．２０
Ｂ１、Ｂ２相差不大，从节约药材、能耗角度考虑宜选择
Ｂ２；Ｃ因素对枸橘苷和欧前胡素的转移率均无显著
性影响，且３水平差别不大，故选Ｃ３。综上所述，故
确定工艺条件为Ａ２Ｂ２Ｃ３。
表２　正交试验结果
Ｔａｂ　２　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ　ｔｅｓｔ
次数 Ａ　 Ｂ　 Ｃ　 Ｄ
枸橘苷转
移率／％
欧前胡素
转移率／％
１　 １　 １　 １　 １　 ８１．９４　 ７４．３３
２　 １　 ２　 ２　 ２　 ８３．４４　 ７３．７２
３　 １　 ３　 ３　 ３　 ７４．８６　 ６７．２０
４　 ２　 １　 ２　 ３　 ８２．６９　 ８５．０５
５　 ２　 ２　 ３　 １　 ８５．１４　 ７３．３２
６　 ２　 ３　 １　 ２　 ６７．１４　 ７２．８９
７　 ３　 １　 ３　 ２　 ７５．４６　 ６９．８０
８　 ３　 ２　 １　 ３　 ６６．８３　 ６５．３２
９　 ３　 ３　 ２　 １　 ６５．３３　 ６３．４５
Ⅰ１　 ２４０．２４　２４０．０９　２１５．９１　２３２．４１
Ⅱ１　 ２３４．９７　２３５．４１　２３１．４６　２２６．０４
Ⅲ１　 ２０７．６２　２０７．３３　２３５．４６　２２４．３８
Ｒ１　 ３２．６２　 ３２．７６　 １９．５５　 ８．０３
Ⅰ２　 ２１５．２５　２２９．１８　２１２．５４　２１１．１０
Ⅱ２　 ２３１．２６　２１２．３６　２２２．２２　２１６．４１
Ⅲ２　 １９８．５７　２０３．５４　２１０．３２　２１７．５７
Ｒ２　 ３２．６９　 ２５．６４　 １１．９０　 ６．４７
表３　方差分析结果
Ｔａｂ　３　Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ
方差来源 离差平方和 自由度 平均离差 Ｆ Ｐ
枸橘苷 Ａ　 ２０４．４２　 ２　 １０２．２１　１７．０６ ＞０．０５
Ｂ　 ２０９．２９　 ２　 １０４．６５　１７．４７ ＞０．０５
Ｃ　 ７１．１１　 ２　 ３５．５６　 ５．９４ ＞０．０５
Ｄ（误差） １１．９８　 ２　 ５．９９
欧前胡素 Ａ　 １７８．１３　 ２　 ８９．０７　 ２２．４６ ＜０．０５
Ｂ　 １１３．１２　 ２　 ５６．５６　 １４．２６ ＞０．０５
Ｃ　 ２６．２９　 ２　 １３．１５　 ３．３２ ＞０．０５
Ｄ（误差） ７．９３　 ２　 ３．９７
注：Ｆ０．０５（２，２）＝１９
２．３．３　验证试验　称取枸橘药材３０　ｇ一份，置５００
ｍＬ圆底烧瓶中，按照最佳提取工艺Ａ２Ｂ２Ｃ３条件回
流提取，提取液按照“２．１．３”及“２．２．３”项下处理，测
得枸橘苷和欧前胡素的转移率分别为８９．４５％、
７２．５２％，与原正交试验结 果 中 枸 橘 苷 转 移 率
８５．１４％、欧前胡素转移率７３．３２％相比，两组数据接
近，表明最佳工艺稳定性较好。
３　讨论
本实验考察了乙腈－水、乙腈－０．１％磷酸水溶液
和甲醇－０．１％磷酸水溶液流动相系统对分离样品中
黄酮类成分的影响，发现使用乙腈的出峰时间比甲
醇提前，且分离度和柱效较高；而加入磷酸对色谱峰
的影响较小，综合考虑本试验使用乙腈－水作为流动
相合并梯度洗脱的方式分离枸橘中黄酮类化合物。
同时亦考察了乙腈－水、甲醇－水流动相体系对分离
样品中香豆素类成分的影响，发现乙腈－水为７０∶３０
时欧前胡素色谱峰分离度大于１．５，且出峰时间适
宜，故选择乙腈－水为枸橘中香豆素类成分分离的流
动相体系。分别取枸橘苷和欧前胡素对照品溶液在
２００～４００　ｎｍ条件下进行紫外扫描，结果显示枸橘
苷和欧前胡素分别在２８３，２４８　ｎｍ处有最大吸收波
长，故本试验选择２８３　ｎｍ 和２４８　ｎｍ 为其检测波
长。
为合理选择正交设计各水平，对提取溶剂（水、
６０％、７０％、８０％和９５％的乙醇）进行了预试。结果
显示７０％乙醇提取液中欧前胡素转移率最高，枸橘
苷转移率也较高，故在正交试验中，设计乙醇浓度的
３个水平分别为８０％、７０％和６０％。另外，对乙醇
提取次数也进行了考察，发现提取两次枸橘苷和欧
前胡素的转移率较高。故在正交试验中，设计乙醇
提取次数为２次。
中药药效物质基础复杂，为避免单一指标进行
工艺优化时产生的偏差，本研究首次以枸橘中黄酮
类及香豆素类化合物的代表性物质枸橘苷及欧前胡
素的转移率共同作为评价指标，通过正交试验获得
枸橘药材的最佳提取工艺，操作简便，重现性好，为
枸橘制剂开发及资源利用奠定理论基础。
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［收稿日期］２０１６－０２－２９
·８３７１· 中国医院药学杂志２０１６年１０月第３６卷第２０期Ｃｈｉｎ　Ｈｏｓｐ　Ｐｈａｒｍ　Ｊ，Ｏｃｔ　２０１６，Ｖｏｌ　３６，Ｎｏ．２０