全 文 ：3　讨论
本法精密度好 ,回收率高 ,操作简单 ,迅速。 可用于复方吲哚
美辛栓中硫酸沙丁胺醇含量质量控制。同时 ,因本法精确度高 ,为
生产投料提供可靠的数据 ,使批生产收得率提高 ,有效地降低了
成本。
参考文献:
[1 ]　中家药典委员会 .中国药典 ,Ⅱ部 [ S ].北京:化学工业出版社 , 2000:
871-871.
收稿日期: 2004-07-19;　修订日期: 2004-11-03
作者简介:杨燕军 ( 1963-) ,女 (汉族 ) ,江西南昌人 ,现任广东省药物研究
所副主任药师 ,硕士学位 ,主要从事天然活性成分和新药开发工作 .
广东蛇药有效成分柚叶总黄酮提取及含量测定方法研究
杨燕军 , 梁北梅
(广东省药物研究所 ,广东 广州　 510440)
摘要:目的: 研究柚叶中总黄酮的提取工艺并测定总黄酮的含量。 方法: 采用正交试验进行提取工艺的优选 ,紫外分光光
度法测定总黄酮含量。结果:最佳提取工艺测定了前年、去年采摘的 4批样品中总黄酮的含量。去年采摘的柚叶总黄酮略
高于前年。 结论: 该方法简单、稳定、可靠 ,重现性好。
关键词: 柚叶 ;　总黄酮 ;　正交实验 ;　含量测定
中图分类号: R284. 2　　文献标识码: A　　文章编号: 1008-0805( 2005) 01-0016-02
Determination of the Total Flavonoids of Citrus grandis ( L. ) Osbeck
YAN G Yan-jun, L IANG Bei-mei
(Cuangdong Institute of Materia Medica, Guangzhou 510440, China )
Abstract: Objective: T o study on the ex traction technolog y and content o f flav onoids of Citrus grandis ( L. ) O sbeck.
Methods: The content o f to tal flav onoids was determined a t 415 nm with ultra - spectropho tometry . Results: The
content o f tota l flav ono ids in Citrus grandis ( L. ) Osbeck o f la st year is a little mo re than the content o f the year befo re
la st year. Conclusion: The method is simple , stable , reliable.
Key words: Citrus grandis ( L. ) Osbeck;　 To tal flav onoids;　 Or thogonal experiment;　 Content dete rmination
　　柚叶为芸香科植物 Citrus grandis ( L. ) O sbeck的干燥叶 ,
具有治头风痛、寒湿痹痛、食滞腹痛的功效 [1 ] ,柚叶亦为广东蛇药
的最主要组分 ,对眼镜蛇、眼镜王蛇、银环蛇、蝮蛇及海蛇等蛇毒
中毒 ,均有明显的保护作用 (P < 0. 001) ,经临床验证 ,治愈率达
99% [2]。 柚叶含挥发油成分 ,其他化学成分尚未有人进行系统的
研究 ,我们经研究证明柚叶中含黄酮类化合物 ,且黄酮类化合物
极性很大 ,但种类较少。为有效利用柚叶所含黄酮类物质 ,笔者采
用正交实验法对提取工艺进行研究并进行了总黄酮的含量测定。
1　仪器与材料
1. 1　仪器 日本岛津 UV- 2201型紫外光谱仪 ;德国 Sa rto rius
精密电子天平。
1. 2　材料 柚叶为广州老字号公司提供经广东省药物研究所副
主任药师叶碧波鉴定为芸香科植物 Citrus grandis ( L. ) O sbeck
的干燥叶。芦丁对照品购自中国药品生物制品检定。所用试剂均
为分析纯。
2　方法与结果
2. 1　对照品溶液的制备 精密称取在 120℃减压干燥至恒重的
芦丁对照品 40. 1 mg于 100 ml容量瓶中 ,加适量 97%乙醇温热
溶解 ,放冷 ,用乙醇稀释至刻度 ,摇匀。 精密量取 20 ml于 100 ml
容量瓶中 ,加乙醇稀释至刻度 ,摇匀。
2. 2　测定波长的确定 取对照品溶液 ,按“ 2. 3”项下方法操作 ,在
300～ 600 nm范围内测定吸收度值 ,结果表明芦丁在 415 nm处
有最大吸收。
2. 3　标准曲线的绘制 精密量取上述对照品溶液 0. 0, 1. 0, 1. 5,
2, 2. 5, 3, 3. 5, 4, 5 ml置具塞试管中 ,各加 97%乙醇使成 5 ml,依
次加入 0. 1 mo l /L三氯化铝溶液 3 ml及 1 mo l / L乙酸钾溶液 5
ml,摇匀 ,放置 40 min,于 415 nm波长处测吸收度 ,以吸收度为
纵坐标 ,浓度为横坐标绘制标准曲线 ,结果表明: 在所测定浓度范
围 9. 2～ 30. 8 mg /ml内有良好的线性关系 ,回归方程为: Y=
31. 42X - 0. 000 9,相关系数 r= 0. 999 5。
2. 4　精密度考察 精密量取同一批供试品溶液 0. 25 ml,按
“ 2. 6. 2”项下方法操作重复进行 6次 ,结果见表 1。 R SD为
0. 26% ,表明本方法精密度良好。
表 1　精密度考察结果
次数 吸收度 R SD (% )
1 0. 668
2 0. 664
3 0. 667 0. 26
4 0. 668
5 0. 665
6 0. 667
2. 5　稳定性考察 取同一批供试品溶液 ,依法显色 ,自加完显色
剂开始 ,每隔 10 min测吸收度 1次。结果见表 2。R SD为 0. 15%。
表明供试品溶液在 80 min内测定基本稳定。
表 2　稳定性考察结果
时间间隔 t /min 吸收度 R SD (% )
0 0. 493
10 0. 491
20 0. 490
30 0. 489
40 0. 489 0. 15
50 0. 490
60 0. 491
70 0. 492
80 0. 493
2. 6　供试品溶液的制备
2. 6. 1　柚叶提取条件正交实验 [3] 将干燥柚叶粉碎 ,分别精密称
取 5 g柚叶粗粉 9份 ,选择乙醇浓度、提取时间、提取次数和乙醇
用量等 4个因素 ,每个因素选择 3个水平 ,编制因素水平表 (表
3)。按 L9 ( 34 )正交设计方案分别进行提取 ,过滤提取液 ,提取液浓
缩至干 ,蒸馏水溶解 ,用石油醚萃取至石油醚层无色 ,下层溶液减
压浓缩至干 ,用蒸馏水少量多次溶解 ,过滤于 50 ml容量瓶中定
容 ,过滤 ,放置待测。
2. 6. 2　供试品的含量测定 精密吸取各供试品溶液 0. 25 ml置
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时珍国医国药 2005年第 16卷第 1期 LISHIZHEN M EDICINE AND M ATERIA M EDICA RESEARCH 2005 VOL. 16 NO. 1　
具塞试管中 ,各加 97%乙醇使成 5 ml,依次加入 0. 1 mo l /L三氯
化铝溶液 3 ml及 1 mo l /L乙酸钾溶液 5 m l,摇匀 ,放置 40 min,
另取各供试品溶液 0. 25 ml置具塞试管中 ,不加显色剂 ,加 97%
乙醇稀释至上述同体积作空白 ,于 415 nm处测吸收度 ,通过标
准曲线计算总黄酮含量。
2. 6. 3　正交实验及结果 [3 ] 以柚叶总黄酮含量为指标进行分析。
结果见表 4。由表 4直观分析可知 ,最佳提取工艺为 A3B3C2D2 ,即
用 90%乙醇提取 2次 ,溶剂用量依次为 20, 16倍 ,提取时间分别
为 2, 1 h。表 5表明 ,提取时间显著影响提取结果 ,其次是提取次
数、乙醇用量、乙醇浓度 ,但均无显著性。
表 3　柚叶乙醇提取工艺因素水平
水平 A乙醇浓度 (% )
B
提取时间 /h
C
提取次数 /次
D
乙醇用量 /倍
1 50 2, 2, 1 1 20, 16, 12
2 70 2, 1, 1 2 20, 16, 12
3 90 1, 1, 1 3 20, 16, 12
　　 C为 1次 ,对应 B, D首位值 ; C为 2次 ,对应 B, D前两位值 ; C为 3
次 ,对应 B, D所有值
表 4　柚叶乙醇提取工艺正交实验结果
实验
号
A
乙醇浓度 /(% )
B
提取时间 /h
C
提取次数 /次
D
乙醇用量 /倍
总黄酮含量
(% )
1 1 1 1 1 0. 316
2 1 2 2 2 0. 437
3 1 3 3 3 0. 418
4 2 1 2 3 0. 393
5 2 2 3 1 0. 422
6 2 3 1 2 0. 450
7 3 1 3 2 0. 436
8 3 2 1 3 0. 332
9 3 3 2 1 0. 553
K1 1. 171 1. 415 1. 098 1. 291
K2 1. 265 1. 191 1. 373 1. 323
K3 1. 321 1. 421 1. 276 1. 143
R 0. 150 0. 230 0. 275 0. 180
表 5　含量方差分析
方差来源 离差平方和 自由度 均方 F值 显著性
A 0. 012 2 0. 006 0. 75 < 0. 05
B 0. 253 2 0. 127 15. 87 > 0. 05
C 0. 013 2 0. 007 0. 88 < 0. 05
D 0. 015 2 0. 008
　　 F1- 0. 1(2, 2) = 8. 53　 F1- 0. 01= 99. 00
2. 7　重现性实验 取同一批样品 ,按供试品溶液的制备方法测定
其含量 ,重复进行 4次。 结果见表 6。 结果表明该方法重现性良
好。
表 6　重现性实验结果
序号 吸收度 C /μg· ml-1 平均 R SD (% )
1 0. 353 0. 586
2 0. 341 0. 566 0. 589 2. 98
3 0. 366 0. 607
4 0. 360 0. 597
2. 8　回收率实验 取已知含量的 9份供试品溶液各 0. 25 ml,精
密加入 0. 401 mo l / L的芦丁对照品溶液 1 ml,依“ 2. 6. 2”项下方
法显色 ,放置 40 min,于 415 nm处测吸收度。见表 7。结果表明:
回收率高 ,方法可行。
表 7　回收率实验结果
取样量
m /mg
加入量
m /mg
测得值
m /mg
回收率
(% )
平均回收率
(% )
R SD
(% )
0. 131 9 0. 401 0. 541 8 102. 2
0. 140 2 0. 401 0. 541 3 100. 0
0. 113 7 0. 401 0. 516 9 100. 5
0. 170 0 0. 401 0. 590 1 104. 7
0. 122 8 0. 401 0. 532 3 102. 1 101. 7 1. 60
0. 137 3 0. 401 0. 546 6 102. 1
0. 259 8 0. 401 0. 660 8 100. 0
0. 122 0 0. 401 0. 536 3 103. 3
0. 276 8 0. 401 0. 678 9 100. 3
2. 9　柚叶中总黄酮的含量测定 精密称取前年、去年采摘的不同
批次柚叶各 5. 0 g (编号分别为 1, 2, 3, 4) ,用 90%乙醇提取 2次 ,
溶剂用量依次为 20, 16倍 ,提取时间分别为 2, 1 h ,按“ 2. 6. 2”项
下操作方法进行总黄酮的含量测定。 结果见表 8。
表 8　样品含量测定结果
编号 取样量
m /g
A
读取浓度
C /mg· m l- 1
样品含黄酮量
m /mg
百分含量
(% )
1 5. 000 0. 391 0. 012 4 33. 727 0. 674
2 5. 000 0. 394 0. 012 6 32. 678 0. 654
3 5. 000 0. 375 0. 012 0 35. 460 0. 709
4 5. 000 0. 401 0. 012 1 34. 671 0. 693
3　讨论
3. 1　 柚叶总黄酮的含量测定采用紫外分光光度法测定具有快
速、准确、重现性好的特点。
3. 2　 紫外测定中 ,由于空白样品的紫外吸收度较高 ,因此 ,实验
中选择以随行空白样品液参比 ,标准品的空白溶液与样品的空白
溶液不同 ,标准品的空白为用同体积的溶剂代替对照品 ,然后依
法操作 ,为正常情况下的空白溶液 ,而样品空白指不加显色剂 ,只
加样品的溶液。
3. 3　 由于柚叶含较多的叶绿素 ,为了排除干扰 ,在供试品提取
过程中采用石油醚萃取 ,使含量测定结果更为准确 ,重现性更好。
3. 4　 通过正交试验结果直观分析和方差分析得出柚叶总黄酮
的最佳提取工艺条件是分别用 20, 16倍 90%的乙醇提取两次 ,
提取时间分别为 2, 1 h。
3. 5　 柚叶总黄酮的含量测定表明 ,黄酮含量较高 ,可作为黄酮
化合物新的来源 ,去年采摘的柚叶黄酮含量略高于前年采摘的柚
叶。
参考文献:
[1 ]　江苏新医学院 .中药大辞典 ,下册 [M ].上海: 上海人民出版社 ,
1977: 1505-1505.
[2 ]　马郁琪 ,梁　彬 ,胡本荣 ,等 .广东蛇药中水溶性部分有效成分的分
离鉴定 [ J ].中草药 , 1982, 13( 5): 1-1.
[3 ]　徐吉民 .正交法在医药科研中的应用 [M ].北京:中国医药科技出版
社 , 1987: 37-38, 130-140.
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LISHIZHEN M EDICINE AN D M ATERIA MEDICA RESEARCH 2005 VO L. 16 NO. 1 时珍国医国药 2005年第 16卷第 1期