全 文 ：　　收稿日期: 2002-05-10
　　基金项目:教育部重点项目 ( 1999)
　　作者简介:杨建雄 ( 1954— ) ,男 ,教授
柿叶黄酮的体外抗氧化作用研究
杨建雄 ,　原江锋 ,　李发荣
(陕西师范大学生命科学学院 ,西安 710062)
　　【摘　要】目的:　研究柿叶黄酮的体外抗氧化作用。 方法:　用水杨酸法研究柿叶黄酮 ( Per-
simmon leaf flav onoid, PLF)清除· OH的效果 ,用硫代巴比妥酸法测定小鼠组织及肝线粒体、微粒
体中丙二醛含量 ( MDA) ,用分光光度法测定小鼠红细胞溶血和肝线粒体膨胀程度研究 PLF的抗
氧化效果。 结果: 　 PLF可以清除· OH,抑制· OH所致丙二醛的产生 ,减少红细胞溶血 ,减轻肝线
粒体膨胀程度。 结论:　可以认为 PLF具有明显的抗氧化作用。
　　关键词: 　柿叶黄酮 ;　羟自由基 ;　抗氧化
　　中图分类号: 　 R151. 2　文献标识码: 　 A　文章编号:　 0512-7955( 2003) 02-0215-03
　　柿 (Diospyros kaki )为双子叶植物柿树科柿树
属中常见的栽培植物。 柿叶中含有芦丁、黄酮甙、
V C、β-胡萝卜素、生理活性物质和多种必需氨基酸
等营养物质。国内外研究表明 ,以柿叶为原料制取的
柿叶茶具有降血压 ,降胆固醇 ,降血脂 ,软化血管 ,抗
衰老 ,抗肿瘤等生理功能 [1～ 3 ]和健肤美容等作用 [4 ]。
本研究探讨柿叶黄酮的抗氧化作用及其机制。
1　材　料　与　方　法
1. 1　材料
　　实验动物为昆明种小鼠 ,雌雄各半 ,体重 ( 20±
2) g ,由西安医科大学实验动物中心提供。化学试剂
为国产分析纯。
1. 2　柿叶黄酮的提取分离 [5 ]
　　称取柿叶 (Diospyros kaki ,采集于陕西师范大
学校园 ) 100 g,加 70%乙醇 1 000 ml , 80℃ 回流抽
提 2～ 4 h,收集提取液 ,减压浓缩后用石油醚萃取
2～ 3次 ,除去叶绿素 ,弃醚相 ,水相用乙酸乙酯反复
萃取 2～ 3次 ,弃水相 ,乙酸乙酯相浓缩干燥后得粗
黄酮 4. 2 g ,得率为 4. 2% 。
1. 3　样品制备
　　 ( 1)红细胞悬浮液的制备:小鼠眼眶取血 ,分离
红细胞 ,生理盐水洗三次 ,制成 0. 5%悬浮液。 ( 2)组
织提取液的制备:迅速取上述小鼠的肝、脾、心、肾、
脑 ,用冷的生理盐水洗净后冰浴下匀浆 ,制成含蛋白
质 0. 5 g /100 ml的悬浮液。 ( 3)肝线粒体和微粒体
的制备:取肝组织在冰浴下以 0. 25 mo l /L蔗糖制成
10 g /100 m l匀浆 , 3 000 g 4℃离心 20 min,沉淀用
冷的 0. 25 mo l /L蔗糖溶液洗 2次 ,合并上清液备
用 , 10 000 g 4℃离心 20 min,所得沉淀用冷的 0. 25
mo l /L蔗糖溶液洗 2次 ,合并上清液备用。所得沉淀
即为线粒体 [ 6]。用 10 mmol /L Tris-HCl缓冲液配成
含蛋白质为 0. 5 mg /ml线粒体悬浮液备用。上清液
用 100 000 g 4℃离心 30 min,所得沉淀即为微粒
体 ,用 10 mmo l /L Tris-HCl缓冲液配成含蛋白质
0. 5 mg /m l微粒体悬浮液备用 [7 ]。
1. 4　PLF清除·OH效果的测定
　　按 Smir nof f等的方法改进 [ 8]产生· OH,以· OH
氧化水杨酸所得产物测 A510 nm ,以 (对照组 - 加药
组 ) /对照组× 100计算· OH清除率。
1. 5　对小鼠红细胞氧化溶血的测定 [9 ]
　　分别取红细胞悬浮液 1 ml,加不同浓度的 PLF
(表 1) ,最后加 100 mmol /L H2O2启动反应 , 37℃
作用 1 h,生理盐水稀释 5倍 , 1 000 g离心 10 min,
取上清液测 A415 nm ,计算溶血度和抑制率。
215营养学报 2003年第 25卷第 2期DOI : 10. 13325 /j . cnki . acta . nutr . si n. 2003. 02. 034
　　Table 1　Effect of PLF on RBC hemolysis induced by
H2O 2 ( x± s, n= 6)
Group Concen tration
( mg /L)
A415 nm
Hemolysi s
(% )
Inhibiti on
(% )
Normal 0 0. 14± 0. 01a 13. 66 —
Cont rol+ H2O2 0 1. 07± 0. 04 100. 0 —
H2O2+ PLF 48 0. 65± 0. 03a 60. 51 42. 60
H2O2+ PLF 112 0. 51± 0. 08a 47. 34 56. 79
H2O2+ PLF 160 0. 31± 0. 05a 28. 48 77. 14
　　 a: P < 0. 01 vs cont rol
1. 6　脂质过氧化激发与 MDA含量的测定 [10 ]
　　取 1 ml组织提取液或 0. 5 mg /ml肝线粒体、微
粒体 ,加不同浓度 PLF(表 2) , 6 mmol /L FeSO4
100μl,最后加 60 mmo l /L H2O2 40μl,在 37℃下水
浴 1 h后 ,加入 1 ml 15 g /100 ml三氯乙酸 ( TCA)结
束反应 ,再加入 1 m l 0. 67 g /100 ml硫代巴比妥酸
( TBA) ,于沸水浴中显色 15 min,冷却后离心 ,测上
清液的 A532 nm。
　　Table 2　Effect of PLF on lipid peroxidation of extract from rat kidney、brain、hear t、and spleen (x± s , n= 6)
Group
PL F
( mg / L)
Kidney
A532 nm
Inhibit ion
(% )
Brain
A532 nm
Inhibi tion
(% )
Heart
A532 nm
Inhibiti on
(% )
Spleen
A532 nm
Inhibi tion
(% )
Normal 0 0. 04± 0. 01b — 0. 11± 0. 01b — 0. 29± 0. 01a — 0. 05± 0. 02b —
Cont rol 0 1. 04± 0. 02 — 0. 70± 0. 06 — 0. 59± 0. 07 — 0. 59± 0. 03 —
PLF 15 0. 36± 0. 06b 68. 00 0. 47± 0. 06b 38. 98 0. 51± 0. 04 26. 67 0. 18± 0. 01b 75. 93
45 0. 19± 0. 02b 88. 00 0. 38± 0. 04b 54. 24 0. 38± 0. 03a 70. 00 0. 12± 0. 02b 87. 04
75 0. 15± 0. 04b 89. 00 0. 26± 0. 02b 74. 58 0. 33± 0. 01a 86. 67 0. 09± 0. 01b 92. 59
100 0. 13± 0. 02b 91. 00 0. 20± 0. 01b 84. 75 0. 32± 0. 01a 90. 00 0. 08± 0. 01b 94. 44
150 0. 11± 0. 01b 93. 00 0. 15± 0. 01b 93. 22 0. 30± 0. 01a 96. 67 0. 07± 0. 02b 96. 30
　　 a: P < 0. 05 vs cont rol; b: P < 0. 01vs con t rol
1. 7　小鼠肝线粒体肿胀度的测定 [11 ]
　　 3 ml肝线粒体悬浮液 ,加入不同浓度的 PLF后
(图 1) ,以 5μmol /L FeSO4和 0. 1 mmol /L V C激
发线粒体膨胀 ,测不同时间的 A520 nm。
　　Fig . 1　Effect of PLF on mi tochondria swell ing induced
by VE+ Fe 2+
1. 8　数据处理
　　以 x± s表示结果 ,不同实验间差异用 t检验。
2　结　果　与　分　析
2. 1　PLF对·OH的清除作用
　　 PLF在 3. 33 mg /L浓度时对· OH就有一定的
清除能力 ,数据差异显著 ,且呈较好的量效关系 (表
3)。
　　Table 3　The scavenging effect of PLF on · OH
( x± s , n= 6)
Concen tration( mg /L) A510 nm Inhibi tion (% )
0( cont rol ) 0. 32± 0. 038 —
3. 33 0. 23± 0. 007a 28. 89
8. 33 0. 22± 0. 005a 30. 43
16. 67 0. 17± 0. 013a 47. 82
33. 33 0. 16± 0. 009a 50. 93
66. 67 0. 14± 0. 003a 56. 21
100. 00 0. 08± 0. 005a 74. 84
　　 a: P < 0. 01 v s con trol
2. 2　PLF对 H 2O 2诱导小鼠血红细胞 (RBC )溶血的
抑制作用
　　 H2O2加入后溶血量显著高于正常组 , PLF可
显著抑制溶血的发生 ,表 1数据表明 PLF可抑制氧
化损伤 ,保护红细胞膜 ,且呈良好的剂量效应关系。
2. 3　PCL 对小鼠组织及肝线粒体和微粒体脂质过
氧化产物MDA生成的影响
　　由表 2, 4可知 ,模型组 MDA含量比正常组显
著增加 ,若同时加入 PLF, MDA生成量显著减少 ,
说明 PLF可抑制· OH诱导的氧化作用 ,此抑制作
用有一定的量效关系。
2. 4　PLF对小鼠肝线粒体肿胀的影响 (图 1)
　　由图 1可见 ,随着时间的延长各组在 520 nm吸
光值下降 ,说明线粒体膜被氧化损伤而发生了肿胀 ,
其中对照组下降幅度最大 ,加 PLF组下降趋势减
216 Acta Nutrimenta Sinica, Jun. 2003, Vo l. 25 No. 2
缓 ,表明 PLF可抑制· OH所致氧化损伤程度 ,肿胀 减轻 ,而且呈剂量依赖关系。
　　Table 4　Effect of PLF on lipid peroxidation of liver、mi tochondria and microsome ( x± s, n= 6)
Group
PLF
( mg /L)
liv er
A532 nm Inhibi ti on(% )
liver mi toch ondria
A532 nm Inhibi tion(% )
liver microsom e
A532 nm Inhibi ti on (% )
Normal 0 0. 04± 0. 01a — 0. 07± 0. 02b — 0. 02± 0. 01b —
Cont rol 0 0. 66± 0. 05 — 0. 76± 0. 09 — 0. 94± 0. 09 —
PLF 15 0. 54± 0. 03a 17. 23 0. 43± 0. 11a 43. 85 0. 48± 0. 09b 48. 67
30 0. 52± 0. 02a 21. 04 0. 24± 0. 06b 69. 24 0. 34± 0. 05b 63. 84
45 0. 42± 0. 03b 35. 67 0. 22± 0. 06b 71. 47 0. 24± 0. 01b 75. 08
60 0. 39± 0. 05b 39. 48 0. 11± 0. 02b 85. 60 0. 13± 0. 03b 86. 32
　　 a: P < 0. 05 vs cont rol; b: P < 0. 01 v s cont rol
3　讨　论
　　近年研究表明 ,黄酮类化合物具有的多酚结构 ,
能够提供活泼的质子 ,与自由基结合成较稳定的产
物 ,因而有较强的抗氧化作用 ,可以阻断脂类的自动
氧化过程 [ 9, 12] ,柿叶含有丰富的黄酮类化合物 ,本项
研究表明 PLF可有效地清除· OH,抑制红细胞膜 ,
肝、肾、脾、脑组织及肝线粒体、微粒体膜的氧化损
伤 ,说明 PLF可用于防止生物膜的氧化损伤 ,且其
对· OH的清除作用可能是保护生物膜的机制之一。
这一结论对于柿叶黄酮的开发利用及黄酮类抗氧化
作用机制的研究有一定参考价值。
〔参　考　文　献〕
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[ 3]　吴小南 ,汪家梨 .柿叶茶抗氧化与降血脂保健作用的初
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THE ANTI-OXIDATIVE EFFECT OF
PERSIMMON LEAF FLAVONOID IN VITRO
YANG Jian-xiong , YUAN Jiang-feng , LI Fa-rong
(Col leg e of Lif e Science. Shan xi N orm al University , X i’ an 710062, China )
　　【Abstract】　 Objective: To study the anti-oxidativ e ef fects o f PLF. Methods: The · OH scavenging
ef fect w as measured by sa licylic acid method, the content o f MDA in liv er mitochondria and micro some
w as measured by TBA assay; hemo lysis o f RBC and the sw elling of mi tochondria w ere detected by spec-
trophotometric methods. Results: PLF can scavenge · OH, inhibit production of MDA, sw elling of mi to-
chondria and hemolysis of RBC. Conclusion: PLF ha s anti-oxida tion ef fects invi t ro.
　　 Key words:　 persimmon leaf flavonoid ( PLF) ;　 hydroxyl radical;　 ant i-oxidation
217营养学报 2003年第 25卷第 2期