全 文 ：收稿日期:2008-11-10;　修订日期:2008-12-30
基金项目:国家水利部水土保持植物开发研究中心科技专项
(No.SDH20088080, SDH20088190);
湖北省自然科学基金创新群体计划(No.2007ABC008)
作者简介:周　媛(1956-),女(汉族),山东文登人 ,现任三峡大学教授 ,学
士学位 ,主要从事天然产物分离与鉴定教学与研究工作.
＊通讯作者简介:邹　坤(1962-), 男(汉族),湖北京山人 , 现任三峡大学
教授 ,博士学位 ,主要从事天然产物分离与鉴定教学与研究工作.
苎麻叶中总酚酸提取工艺的正交设计优化
周　媛 ,邹　坤＊ ,汪鋆植 ,朱静靖 ,彭元丽 ,刘　闯
(三峡大学化学与生命科学学院天然产物研究与利用湖北省重点实验室 ,湖北 宜昌　443002)
摘要:目的 研究苎麻叶中总酚酸提取工艺。方法 设计不同的工艺路线 , 在单因素实验基础上采用正交设计优化 ,采用
改进的 Folin-Ciocalteu比色法测定总酚酸含量 ,检测波长为 755 nm。结果 适宜的总酚酸提取工艺为用 12倍量 80%浓
度乙醇 , 70 ℃提取 3次 , 2 h/次 ,水稀释体积为 700ml, 碱化 pH值为 10。测得苎麻叶 80%乙醇提取物中总酚酸粗膏得率
为 19.9%, 总酚酸含量为 0.214%。结论 该工艺步骤简单 ,成本较低 , 提取率高 ,适合于苎麻叶中总酚酸的工业化提取。
关键词:苎麻;　总酚酸;　正交实验;　提取工艺
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)08-1867-02
ExtractionTechnologyofTotalPolyphenolinBoehmerianivea(Linn.)Gaudich.bythe
MethodofOrthogonalTestOptimization
ZHOUYuan, ZOUKun＊ , WANGJun-zhi, ZHUJing-jing, PENGYuan-li,LIUChuang
(HubeiKeyLaboratoryofNaturalProductsResearchandDevelopment, ColegeofChemistryandLifeSciences,
ChinaThreeGorgesUniversity, Yichang443002, China)
Abstract:ObjectiveTodesigndiferentextractionandseparationtechnologyoftotalpolyphenolinBoehmerianivea(Linn.)
Gaudich..MethodsTheorthogonaltestmethodwasadoptedtoresearchtheefectofvariousfactors.Thesamplesweredeter-
minedbyspectrophotometer, thedetectionwavelengthwas755 nm.ResultsTheoptimumextractionconditionswereasfolows:
extractionthreetimeswith80% alcohol, extractiontime2h, 12timesthevolumeofthealcoholat70℃, thevolume700mlwith
water, thepH10 withbasification.Thecrudelyyieldingrateoftotalpolyphenolwasabout19.9% andthecontentoftotalpoly-
phenolwas0.212% withthetechnology.ConclusionThetechnologyissuitableforindustrialproduction.
Keywords:Boehmerianivea;　Totalpolyphenol;　Orthogonaltest;　Extractiontechnology
　　苎麻叶系荨麻科 (Urticaceae)植物苎麻 Boehmerianivea
(Linn.)Gaudich.的干燥叶。苎麻为多年生宿根性草本植物 , 又
名家苎麻 、白麻 、圆麻。其根具有清热 、止血 、解毒散瘀功效 [ 1] 。
我国的苎麻产量约占全世界苎麻产量的 90%以上 , 其茎皮主要
作为优良的纺织原料。仅以 2005年为例 , 我国苎麻纺织工业苎
麻耗量为 177 250 t, 出口创汇 15 597万美元 [ 2] 。苎麻叶作为苎
麻纺织工业的废弃物资源极其丰富 , 苎麻叶片约占植株重量的
40 %左右 [ 3] 。多年来 ,苎麻根已成为临床常用止血药 , 而对苎麻
叶的研究尚不深入 , 但根据已有研究资料表明 , 叶中含有与根相
同的成分绿原酸 , 此外还含有原儿茶酸 、野漆树苷 、芸香苷等酚酸
类等抗氧化活性物质 [ 4 ～ 7] , 因此有望作为根的代用品 , 并在抗衰
老等方面有进一步的开发和利用的价值 [ 8] 。
本实验以苎麻叶为原料 ,选择了不同的工艺方法提取苎麻叶
中的总酚酸 , 并通过正交实验优化工艺条件 , 以 Folin-Ciocaileu
比色法测定总酚酸粗浸膏中的总酚酸含量 ,为苎麻叶的开发利用
提供研究基础。
1　仪器与材料
1.1　仪器 N1001 EYELA旋转蒸发仪 (上海爱朗仪器有限公
司),大容量离心机 (北京医用离心机厂), S3100紫外分光光度
计(韩国 Scinco公司), BP211D型十万分之一电子天平(德国
Sartorius公司)。
1.2　材料与试剂 苎麻叶 , 采自湖北省咸宁地区 , 晒干 , 粉碎至 5
mm以下的碎片 ,置 50℃干燥箱中干燥 12 h,密封 , 备用。没食子
酸对照品:基准纯 , 购于上海分析试剂厂 , 置 50℃真空干燥箱真
空中干燥 4 h。乙醇为工业级 ,其他试剂均为分析纯。
2　方法
2.1　Folin-Ciocalteu比色法测定总酚酸含量
2.1.1　Folin-Ciocalteu试剂配制 称取 8 g钨酸钠和 2 g钼酸钠
于圆底烧瓶中 , 用 56 ml蒸馏水溶解 , 加入 4 ml85%的磷酸溶液
和 8 ml浓盐酸 , 文火回流 10 h, 然后加入 1.2g硫酸锂及 6 ml双
氧水 , 加热沸腾 15 min至亮黄色 , 不得带微蓝和绿色。冷却 , 移
入 100 ml容量瓶中 , 定容 ,贮于棕色瓶中 , 4 ℃冰箱保存。
2.1.2　对照品溶液制备 准确称取 10.00 mg干燥的没食子酸 ,
加蒸馏水适量 , 超声溶解 , 放冷 , 以蒸馏水定容至 100 ml, 制成每
毫升含 0.1 mg没食子酸的溶液 ,作为对照品溶液。
2.1.3　待测溶液制备
提取工艺Ⅰ待测溶液制备:将全部总酚酸浸膏用 70%的乙
醇溶解 , 定容至 100 ml, 低温避光保存 , 测定时再稀释至适宜浓
度。
提取工艺 Ⅱ待测溶液制备:精密称取一定量总酚酸干浸膏
(约 20mg), 用 70%浓度乙醇溶解 ,定容至 10 ml,低温避光保存 ,
测定时再稀释至适宜浓度。
2.1.4　总酚酸含量测定 准确量取 0.5 ml待测溶液置 10 ml干
燥具塞比色管中 , 加 6 ml水 , 0.5 ml福林试剂 , 充分摇匀 , 加入
0.75ml20%碳酸钠溶液 ,混匀 , 以蒸馏水稀释至刻度。 40 ℃水浴
40 min。同时制作空白管。为消除供试品溶液本身颜色的干扰 ,
同时制作不加显色剂的对照管。于 755 nm波长处测定吸光度
值。
2.1.5　工作曲线绘制 准确量取对照品溶液 0.00, 0.10, 0.20,
0.30, 0.40, 0.50, 0.60, 0.70, 0.80 ml于 10 ml干燥具塞比色管
中 , 照总酚酸含量测定项下操作 , 于 755 nm波长处测定各吸光度
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值。以吸光度值 Y对对照品质量 X(mg)作图 , 绘制标准曲线 ,
并进行线性回归 , 得回归方程为 Y=17.206 8 X+ 0.032 3, r=
0.999 9。该方法的平均加标回收率为 102.87%, 方法的变异系
数为 3.60%。
提取工艺Ⅰ总酚酸含量计算:
多酚含量(mg/100g)= X(mg)×稀释倍数
0.5×总酚酸称样量(mg)×100
提取工艺Ⅱ总酚酸含量计算:
多 酚 含 量 (mg/100g) = X(mg)×稀释倍数
0.5×总酚酸称样量(mg) ×
总酚酸干浸膏量(mg)
原料量(g) ×100
2.2　提取工艺 Ⅰ 准确称取干燥苎麻叶碎片 100 g,加入 12倍量
的一定浓度的乙醇溶液 ,浸泡 24 h, 70 ℃水浴加热提取 2 h,再以
10倍量的一定浓度的乙醇溶液 , 同样条件提取 2次。提取液过
滤合并 50℃减压浓缩成浸膏。加一定量的水稀释 , 再以 10%的
Na2CO3溶液调节 pH值 , 在 2 000 r· min-1下离心 30 min, 取上清
液以 1:1盐酸调 pH至中性 , 浓缩得到总酚酸浸膏 , 40 ℃真空干
燥 12h,得总酚酸粗品 1。通过单因素实验 , 确定乙醇浓度(A),
水稀释体积(B),碱化 pH值(C)等因素对提取率影响较为显著 ,
各因素设计 3个水平 , 利用 L9(34)正交表进行正交实验。正交
因素及水平见表 1, 正交实验结果见表 2。
表 1　提取工艺Ⅰ L
9
(34)正交表因素及水平
水平 A醇浓度(%)
B
水稀释体积 /ml
C
碱化pH
D
酸化 pH
1 95 300 9 7
2 80 500 10 7
3 65 700 11 7
表 2　提取工艺Ⅰ L9(34)正交实验结果
实验号 因素D A B C
结果
醇提取率(%) 总酚酸干浸膏量 /g 吸光度值 /y 总酚酸含量 /mg· 100g-1
1 1 1 1 1 11.0 9.5 0.4720 51.1
2 1 2 2 2 13.1 11.2 0.639 6 70.7
3 1 3 3 3 12.0 10.0 0.599 7 66.2
4 2 1 2 3 18.7 15.1 0.454 7 196.2
5 2 2 3 1 19.3 18.7 0.454 7 196.2
6 2 3 1 2 20.9 19.1 0.475 5 206.3
7 3 1 3 2 15.5 14.1 0.376 4 160.1
8 3 2 1 3 17.5 14.3 0.356 8 154.0
9 3 3 2 1 17.5 16.5 0.484 7 210.0
K1 /3 62.7 125.4 136.1 152.4K2 /3 195.9 146.0 155.3 152.4
K3 /3 173.7 160.8 140.8 127.4 ∑Y= 1 296.7
R 133.2 35.4 19.5 25.0
　　 1)1、 2、 3号样品溶液再稀释 10倍 , 4、 5、6、7、8、9号样品溶液再稀释 40倍;2)极差分析以总酚酸含量为指标。
　　由表 2可知 , 各因素对醇提碱纯化提取总酚酸的影响分别
为:A因子(醇提浓度)>B因子(水稀释体积)>C因子(碱化
pH值)。以因素 A、B、C为方差来源 ,因素 D为误差来源 , 进行总
酚酸含量的方差分析 。方差分析结果见表 3。
表 3　提取工艺Ⅰ总酚酸含量方差分析结果
方差来源 离差平方和 自由度 均方和 F 显著性P
A 30 613.725 6 2 15 306.857 8 805.809 9 <0.05
B 1 867.745 6 2 933.872 8 49.162 5 <0.05
C 572.165 6 2 286.082 8 15.060 5 <0.05
(误差) 37.991 2 2 18.995 62
其中醇提浓度为影响总酚酸得率的主要因素。醇提碱纯化
提取总酚酸的最佳工艺条件为 A2B3C2 , 即醇提浓度为 80%, 水
稀释体积为 700 ml, 碱化 pH值为 10, 酸化 pH为 7。
选择优化的 A因子(80%醇提浓度)和 C因子(碱化 pH=
10), 进一步增加水稀释体积进行试验 , 发现随着水稀释体积的增
加 , 总酚酸的提取收率略有提高 ,但变化很小 ,而且水稀释体积的
增加 , 同时也增加了后面浓缩步骤的成本。
对上述醇提碱纯化提取总酚酸的最佳工艺条件进行验证实
验 , 总酚酸粗膏的提取率达到 19.9%, 总酚酸含量为 214.3 mg·
100g-1 , 百分含量为 0.214%
2.3　提取工艺 Ⅱ 准确称取干燥苎麻叶碎片 100 g, 加入 12倍量
的一定浓度的乙醇溶液 ,浸泡 24 h, 70 ℃水浴加热提取 2 h, 再以
10倍量的一定浓度的乙醇溶液 , 同样条件提取 2次。提取液过
滤合并 50℃减压浓缩成浸膏。加入 150 ml蒸馏水悬浮成胶体溶
液后加入醋酸乙酯萃取 3次 , 每次 100 ml。合并所得的醋酸乙酯
液 , 加入一定 pH值的适量碱水(以 10% Na2CO3溶液调节 pH)
反萃 3次 , 萃取碱液用 1∶1 HCl调 pH至酸性后再用适量(酸水
液:醋酸乙酯 =3∶1 ～ 4∶1)醋酸乙酯萃取 3次 , 合并醋酸乙酯
液 ,减压浓缩成浸膏 , 40 ℃真空干燥 12 h, 得总酚酸粗品 2。通过
单因素实验 , 确定乙醇浓度(A), 碱化 pH值(B), 碱水与醋酸乙
酯的比例(C)和调酸 pH值(D)等因素对提取率影响较为显著 ,
各因素设计 3个水平 ,利用进行正交实验。正交因素及水平见表
4, 正交实验结果见表 5。
表 4　提取工艺ⅡL9(34)正交表因素及水平
水平 A醇浓度(%)
B
碱化 pH
C
碱化∶醋酸乙酯
D
酸化 pH
1 95 10 1∶2 2
2 80 11 1∶3 3
3 65 12 1∶4 4
表 5正交分析结果表明 , 乙醇浓度(A), 碱水 pH值(B), 碱
水与醋酸乙酯的比例(C)和调酸 pH值(D)这 4因素中对总酚提
取影响顺序为 B﹥ D﹥ A﹥ C, 其中因素 B以 pH=11为佳 , 因
素 D以 pH=4为佳 ,因素 A以 80%乙醇为佳 , 因素 C以 1:4醋酸
乙酯为佳。即最佳提取工艺条件为 A2B2C3D3。因该工艺总酚酸
得率明显低于提取工艺Ⅰ , 故没有进一步实验的必要。
3　讨论
提取工艺Ⅱ的总酚酸得率低 , 主要是提取步骤较为繁琐以及
碱水(以 10% Na2CO3溶液调节 pH)反萃不完全。我们将萃取
过的醋酸乙酯层和萃出的碱水层以薄层层析检查 , 两者在薄层板
上均显现出相同 Rf值的斑点。
提取工艺Ⅰ的总酚酸得率明显高于提取工艺Ⅱ , 其最佳工艺
条件的验证实验中总酚酸的提取率达到 231.6 mg· 100 g-1 , 证
明了该工艺条件为最优。且提取步骤简单 , 避免了使用醋酸乙酯
有机溶液 , 可降低提取成本 ,有利于环境保护。
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时珍国医国药 2009年第 20卷第 8期 LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.8
表 5　提取工艺ⅡL9(34)正交实验结果
实验号 因素D A B C
结果
醇提取率(%) 总酚酸干浸膏量 m/g 吸光度值 y总酚酸含量 C/mg· (100g)-1
1 1 1 1 1 9.5 0.112 0 0.597 2 3.35
2 1 2 2 2 10.5 0.765 6 0.238 1 8.63
3 1 3 3 3 9 0.883 5 0.160 5 6.94
4 2 1 2 3 24.5 0.395 4 0.326 9 7.31
5 2 2 3 1 24.5 0.395 4 0.326 9 7.31
6 2 3 1 2 23.0 0.291 4 0.411 1 4.75
7 3 1 3 2 15.2 0.165 0 0.296 8 2.93
8 3 2 1 3 17.0 0.412 2 0.464 0 9.36
9 3 3 2 1 16.1 0.246 1 0.236 0 3.70
K
1
/3 6.47 4.53 5.82 5.97
K2 /3 7.65 9.62 6.55 5.43K3 /3 5.33 5.13 6.92 7.87 ∑Y=57.8
R 2.32 5.09 1.10 2.44
　　极差分析以总酚酸含量量为指标
　　本文选择了两种工艺方法提取苎麻叶中的总酚酸 ,并在单因
素实验的基础上通过正交实验 , 优化工艺条件 , 以 Folin-Cio-
caileu比色法测定总酚酸粗浸膏中的总酚酸含量。结果表明工
艺Ⅰ优于工艺Ⅱ 。工艺Ⅰ以 80%乙醇提取 , 浓缩 , 浸膏以碱水碱
化离心 , 将总酚酸分离 ,含有总酚酸的上清液以盐酸酸化成中性
浓缩得总酚酸粗膏 , 盐酸酸化成中性可避免总酚酸的破坏。因此
苎麻叶中酚酸提取的最佳工艺条件:用 12倍量 80%浓度乙醇 ,
70 ℃提取 3次 , 2h/次 , 水稀释体积为 700 ml, 碱化 pH值为 10。
该工艺简便 , 适合工业化生产 , 总酚酸粗膏得率为 19.9%, 总酚
酸含量为 0.214%。
参考文献:
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国药鉴别
收稿日期:2008-10-28;　修订日期:2008-12-21
基金项目:国家自然科学基金 (No.30760298);海南省科技计划项目(No.061006);海南省自然科学基金资助项目(No.30626)
作者简介:张俊清(1964-),女(汉族),安徽含山人 ,现任海南医学院药学系教授 ,硕士学位,主要从事中药质量标准与安全性评价及中药药物动力学研究工作.
＊通讯作者简介:刘明生(1960-),男(汉族),内蒙武川人 ,现任海南医学院药学系教授 ,博士学位 ,主要从事天然药物化学研究工作.
液相色谱 -质谱联用法鉴定海南枫蓼肠胃康颗粒剂血浆代谢产物
张俊清 , 符乃光 , 陈　峰 , 刘明生＊
(海南医学院·海南省热带药用植物研究与开发重点实验室 ,海南 海口　571101)
摘要:目的 研究大鼠灌胃枫蓼肠胃康颗粒剂后代谢产物的动态 , 寻找具有代表性可作为该复方药代动力学研究指标成
分的代谢产物。方法 大鼠灌胃枫蓼肠胃康颗粒剂溶液〔0.9 g· (100 g)-1〕,血浆样品经过酶(G1512)水解后 , 进行色谱
分析 , 通过与对照品比较研究其血浆中代谢产物动态;采用液相色谱 -质谱联用仪检测 , 大气压电喷雾离子源(EPI)负离
子条件下进行扫描 , 对观测到的代谢产物进行结构鉴定。结果 色谱分析的结果表明 , 枫蓼肠胃康颗粒剂血浆代谢产物
中有槲皮素等黄酮类化学成分 ,同时质谱扫描的结果鉴定出槲皮素(m/z※ 301.0)的化学结构。结论 可以槲皮素为指标
成分研究该复方的药代动力学。
关键词:枫蓼肠胃康颗粒;　液相色谱 -质谱联用;　槲皮素;　代产谢物
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)08-1869-02
IdentificationofFengLiaoChangWeiKangGranuleMetabolitesinRatPlasmabyLiquid
Chromatography-MassSpectrometry
ZHANGJun-qing, FUNai-guang, CHENFeng, LIUMing-sheng＊
(Dept.ofPharmacology, HainanMedicalColege, HainanProvincialKeyLaboratoryofR＆DofTropicalHerbs,Haikou571101, China)
Abstract:ObjectiveTostudythedynamicstateofthemetabolitesinratplasmaafteroraladministrationofFengLiaoChangWei-
KangGranuleandtoseekrepresentativemetabolitesusedasIndexcomponentsinthecompoundpharmacokineticresearch.Meth-
odsTheratswereorallyadministeredFengLiaoChangWeiKangGranulesolution〔0.9 g· (100 g)-1〕.Plasmasampleswerehy-
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LISHIZHENMEDICINEANDMATERIAMEDICARESEARCH2009VOL.20NO.8 时珍国医国药 2009年第 20卷第 8期