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相同生长条件下几种枣叶凝集素生物活性分析



全 文 :北方园艺2012(01):31~34 ·研究简报·
第一作者简介:韩红艳(1976-),女,硕士,讲师,研究方向为园艺植
物与细胞生物学。E-mail:hhy0822@126.com。
基金项目:山西省教育厅资助项目(20101128)。
收稿日期:2011-10-17
相同生长条件下几种枣叶凝集素生物活性分析
韩 红 艳1,冀 爱 青1,吕 晨 辰1,姚 伟 伟2,李   翔3
(1.晋中学院,山西 榆次030600;2.四川农业大学,四川 雅安611830;3.天津师范大学,天津300387)
  摘 要:提取13个枣品种叶片中的凝集素,经硫酸铵沉淀、透析得到蛋白质提取液,用不同类
型的红细胞检测凝集活性(人的A、B、AB、O型血),并通过糖抑制试验比较凝集素的生物活性。
结果表明:不同品种枣叶中凝集素活性各不相同;同种凝集素对不同种类的血细胞的凝集作用不
同,如在凝集效价为20时,梨枣的枣叶凝集素对A、B、O、AB型血细胞分别为中度凝集、高度凝
集、中度凝集、轻度凝集;不同凝集素对同一种血细胞的凝集作用也不同:如在凝集效价为20 时,
“壶瓶1号”对B型血细胞为高度凝集,“骏枣”对B型血细胞为中度凝集,“壶瓶6号”对B型血细
胞为轻度凝集;糖对凝集素的凝集作用均有抑制,且抑制作用的强弱与其浓度和分子结构有关,
葡萄糖和果糖的抑制作用较弱,而麦芽糖和蔗糖的抑制作用则较强。总体来看,“骏枣”和“壶瓶3
号”的凝集作用最强,“壶瓶4号”的凝集作用最弱。
关键词:枣叶;凝集素;血细胞;糖抑制
中图分类号:S 665.1 文献标识码:A 文章编号:1001-0009(2012)01-0031-04
  植物凝集素(Lectin)一词,起源于拉丁语Legere。
它是非免疫起源的,能与糖类结合的一类蛋白质,具有
使细胞凝集和使多糖沉淀的特性[1],广义上是指能凝集
红细胞及其它细胞的结合碳水化合物的蛋白质[2]。随
着科学研究手段和技术的发展,人们对凝集素的研究也
越来越广泛,通过分离鉴定,对凝集素的分子结构,性质
及功能作了大量的研究[3]。目前成功地用于植物抗病
虫害基因工程的植物凝集素基因主要有雪花莲凝集素
基因、豌豆外源凝集素基因、麦胚凝素基因、苋菜凝集素
基因及核糖体失活蛋白基因等[4],一些研究集中于凝集
素的生物固氮体系[5-7]。发掘新的植物凝集素,探索其
利用的新途径,已成为国内外生物技术工作者新的竞争
焦点。
枣树病虫害种类多、分布广、危害重,是造成枣树产
量低,质量差的重要原因,当前严重发生的病虫害主要
有枣步曲、枣粘虫、桃小食心虫,食芽象甲、枣疯病、枣锈
病等。引起这些病虫害的大多为鳞翅目、同翅目等害虫
及真菌和某些细菌,凝集素可以对其进行很好的防治作
用。该试验取13个枣品种的叶片凝集素,并检测比较
其凝集活性,同时进行凝集素的糖抑制试验,为凝集素
对枣树病虫害的防治提供参考依据,并为下一步试验做
准备。
1 材料与方法
1.1 试验材料
13种枣叶:“梨枣”、“金昌一号”、“骏枣”、“芒果冬
枣”、“壶瓶1号”、“壶瓶2号”、“壶瓶3号”、“壶瓶4号”、
“壶瓶5号”、“壶瓶6号”、“壶瓶7号”、“壶瓶8号”、“京
枣39号”。人的A、B、O、AB型血。
1.2 试验仪器
DS-1高速组织捣碎机;水浴振荡器(HZS-H 哈尔
滨东联电子技术开发有限公司);冷冻离心机(61-206-Ⅱ
上海安亭科学仪器厂)。
1.3 试验方法
1.3.1 凝集素的分离与提取 称取枣叶片各100g剪
切加入0.9%生理盐水,组织捣碎机进行匀浆。4℃、
4 800r/min离心30min,取上清液。加硫酸铵(70%饱
和度),4℃过夜。4℃、4 800r/min离心35min收集沉
淀,用PBS(pH 7.4)溶解,4 000r/min离心15min,取上
清液在PBS中透析过夜,得到粗品溶液。
1.3.2 2%血细胞样品的制备 取A、B、AB、O型人血,
用0.9生理盐水反复洗涤3~5次,每次1 000r/min,
5min,弃去上清液,配成2%(v/v)的血细胞悬浮液。
1.3.3 血细胞凝集试验 取10个小离心管(进行1~
10号编号),每管分别加入25μL PBS(pH 7.4),1号管
加入25μL凝集素样品,混匀取25μL,加入2号管,3~
10号管依次进行系列倍比稀释;混匀,每管分别加入
25μL 2%血细胞悬液(PBS作空白对照),室温放置1h
后显微镜检测,样品稀释度最高且有凝集现象的管的稀
释倍数,为该样品的凝集效价。记录为2n(n为产生凝集
13
·研究简报· 北方园艺2012(01):31~34
现象的最大稀释倍数)。
1.3.4 糖抑制试验 试验用4种糖分别为D-果糖(D-
Fructose)、D-葡萄糖(D-Glucose)、蔗糖(Sucrose)、麦芽糖
(Maltose),每种浓度分别为1、2、3mg/mL。向小的离心
管中加入25μL的枣叶凝集素提取液,分别加入不同种
类不同浓度的25μL糖溶液,放置10min,再依次加入
50μL 2%的B型血细胞悬液,振匀。室温下放置1h
后,用显微镜进行检测(与血细胞凝集试验中对应的凝
集效价为20凝集效果进行对比)。
2 结果与分析
2.1 13个枣品种叶片凝集素活力与酯酶同工酶关系
由表1可知,13个枣品种的叶片中提取的粗蛋白对
人的4种血细胞在凝集效价为20时均有凝集作用,均未
表现出血型专一性;在凝集效价为20 时,同种凝集素对
不同种类的血细胞的凝集活力不同。
表1 枣叶凝集素对不同血细胞凝集
效价20时凝集活力的比较
品种 A型 B型 O型 AB型
“梨枣” ** *** ** *
“骏枣” * ** ** **
“京枣39号” *** *** *** ***
“金昌一号” ** *** ** ***
“芒果冬枣” ** *** ** **
“壶瓶1号” *** *** *** **
“壶瓶2号” ** *** *** ***
“壶瓶3号” *** *** *** ***
“壶瓶4号” * ** * ***
“壶瓶5号” ** *** *** **
“壶瓶6号” ** ** * *
“壶瓶7号” ** *** ** **
“壶瓶8号” *** *** ** **
  注:“*”表示细胞凝集个数为20以下,为轻度凝集;“**”表示细胞凝集个数为
20~40,为中度凝集;“***”表示细胞凝集个数为41以上,为高度凝集。
2.1.1 枣叶凝集素对A型血细胞的凝集活力 用A型
血细胞分别对13种枣叶进行凝集活性检测(表2),其中
京枣39号和“壶瓶1号”的枣叶凝集素对A型血细胞的
凝集效价可以达到27,“壶瓶3号”枣叶凝集素对A型血
细胞的凝集效价为26,“壶瓶8号”枣叶凝集素对A型血
细胞的凝集效价为25,“梨枣”、“金昌一号”、“壶瓶2号”、
“壶瓶5号”和“壶瓶7号”的枣叶凝集素对A型血细胞
的凝集效价为24,“壶瓶4号”枣叶凝集素对A型血细胞
的凝集效价则为21,存在很大的差异。
表2  不同品种枣叶凝集素对A型血细胞
凝集活力的检测
种类 20 21  22  23  24  25  26  27  28
“梨枣” + + + + + - - - -
“骏枣” + + + - - - - - -
“京枣39号” + + + + + + + + -
“金昌一号” + + + + + - - - -
“芒果冬枣” + + + + - - - - -
“壶瓶1号” + + + + + + + + -
“壶瓶2号” + + + + + - - - -
“壶瓶3号” + + + + + + + - -
“壶瓶4号” + + - - - - - - -
“壶瓶5号” + + + + + - - - -
“壶瓶6号” + + + + - - - - -
“壶瓶7号” + + + + + - - - -
“壶瓶8号” + + + + + + - - -
  注:“+”表示有凝集现象,“—”表示无凝集现象,下同。
2.1.2 枣叶凝集素对B型血细胞的凝集活力 用B型
血细胞分别对13种枣叶进行凝集活性检测(表3),其中
“京枣39号”、“金昌一号”、“壶瓶3号”和“壶瓶5号”的
枣叶凝集素对B型血细胞的凝集效价可以达到27,“壶
瓶1号”、“壶瓶2号”、“壶瓶7号”和“壶瓶8号”的枣叶
凝集素对B型血细胞的凝集效价为26,”梨枣”和“芒果
冬枣”的枣叶凝集素对B型血细胞的凝集效价为25,最
低的是“壶瓶6号”枣叶凝集素对B型血细胞的凝集效
价则为22。
表3  不同品种枣叶凝集素对B型血细胞
凝集活力的检测
种类 20 21  22  23  24  25  26  27  28
“梨枣” + + + + + + - - -
“骏枣” + + + + + - - - -
“京枣39号” + + + + + + + + -
“金昌一号” + + + + + + + + -
“芒果冬枣” + + + + + + - - -
“壶瓶1号” + + + + + + + - -
“壶瓶2号” + + + + + + + - -
“壶瓶3号” + + + + + + + + -
“壶瓶4号” + + + + + - - - -
“壶瓶5号” + + + + + + + + -
“壶瓶6号” + + + - - - - - -
“壶瓶7号” + + + + + + + - -
“壶瓶8号” + + + + + + + - -
2.1.3 枣叶凝集素对O型血细胞的凝集活力 用O型
血细胞分别对13种枣叶进行凝集活性检测(表4),无凝
集素的凝集效价达到27,“壶瓶3号”的枣叶凝集素对O
型血细胞的凝集效价为26,“京枣39号”、“壶瓶1号”、
23
北方园艺2012(01):31~34 ·研究简报·
“壶瓶2号”和“壶瓶5号”的枣叶凝集素对O型血细胞
的凝集效价为25,最低的是“壶瓶4号”和“壶瓶6号”枣
叶凝集素对O型血细胞的凝集效价则为22。
表4  不同品种枣叶凝集素对O型血细胞
凝集活力的检测
种类 20 21  22  23  24  25  26  27  28
“梨枣” + + + + - - - - -
“骏枣” + + + + - - - - -
“京枣39号” + + + + + + - - -
“金昌一号” + + + + + - - - -
“芒果冬枣” + + + + - - - - -
“壶瓶1号” + + + + + + - - -
“壶瓶2号” + + + + + + - - -
“壶瓶3号” + + + + + + + - -
“壶瓶4号” + + + - - - - - -
“壶瓶5号” + + + + + + - - -
“壶瓶6号” + + + - - - - - -
“壶瓶7号” + + + + + - - - -
“壶瓶8号” + + + + - - - - -
2.1.4 枣叶凝集素对AB型血细胞的凝集活力 用AB
型血细胞分别对13种枣叶进行凝集活性检测(表5),无
凝集效价达到27,“京枣39号“和“壶瓶3号”的枣叶凝集
素对AB型血细胞的凝集效价可以达到26,“金昌一号“、
“壶瓶2号”和“壶瓶4号”的枣叶凝集素对AB型血细胞
的凝集效价为25,“壶瓶5号”、“壶瓶7号”和“壶瓶8号”
的枣叶凝集素对AB型血细胞的凝集效价为24,最低的
是梨枣和“壶瓶6号”枣叶凝集素对AB型血细胞的凝集
效价则为22。
表5  不同品种枣叶凝集素对AB型血细胞
  凝集活力的检测
种类 20 21  22  23  24  25  26  27  28
“梨枣” + + + - - - - - -
“骏枣” + + + + - - - - -
“京枣39号” + + + + + + + - -
“金昌一号” + + + + + + - - -
“芒果冬枣” + + + + - - - - -
“壶瓶1号” + + + + + - - - -
“壶瓶2号” + + + + + + - - -
“壶瓶3号” + + + + + + + - -
“壶瓶4号” + + + + + + - - -
“壶瓶5号” + + + + + - - - -
“壶瓶6号” + + + - - - - - -
“壶瓶7号” + + + + + - - - -
“壶瓶8号” + + + + + - - - -
2.2 13种枣叶凝集素的糖抑制作用
用4种糖对13种枣叶凝集素进行抑制试验,并将
得到的结果分别与血细胞凝集试验中对应凝集素对血
细胞的凝集效价为20的结果进行比较(表6),发现4种
糖对13种枣叶凝集素均有抑制作用,其中葡萄糖和果
糖对凝集素的抑制作用较弱,而麦芽糖和蔗糖的抑制作
用则较强:在4种糖的浓度为1mg/mL时,葡萄糖和果
糖基只对“壶瓶1号”和“壶瓶4号”枣叶凝集素有轻微抑
制作用,麦芽糖和蔗糖除对“金昌一号”、“芒果冬枣”、“壶
瓶2号”、“壶瓶3号”和“壶瓶4号”无抑制作用外,对其
它枣叶凝集素出现轻微抑制作用。在浓度为2mg/mL
时,葡萄糖对“梨枣”、“芒果冬枣”、“壶瓶1号”、“壶瓶3
号”、壶瓶5号、“壶瓶6号”和“壶瓶8号”的枣叶凝集素
出现抑制作用,麦芽糖和蔗糖对“京枣39号”和“壶瓶2
号”没有抑制作用;同一种糖浓度越大对同种凝集素的
抑制作用越强:如蔗糖浓度为1mg/mL时“梨枣”的枣叶
凝集素无抑制作用,浓度为2mg/mL对“梨枣”的枣叶凝
集素有轻微抑制作用,浓度为3mg/mL对“梨枣”的枣叶
凝集素抑制作用明显。
表6   不同浓度糖类对凝集素与B型血细胞
凝集作用的抑制
品种
葡萄糖
/mg·L-1
果糖
/mg·L-1
麦芽糖
/mg·L-1
蔗糖
/mg·L-1
1  2  3  1  2  3  1  2  3  1  2  3
“梨枣” - + ++ - - + + + ++ - + ++
“骏枣” - - + - + ++ - + ++ + + ++
“京枣39号” - - + - - + + + + - - +
“金昌一号” - - + - - + - + ++ - + +
“芒果冬枣” - + + - - + - + + - + ++
“壶瓶1号” + + ++ - + + + + ++ + + ++
“壶瓶2号” - - + - + + - - + - - +
“壶瓶3号” - + + - - + - + + - + ++
“壶瓶4号” - - + + + ++ - + ++ - + +
“壶瓶5号” - + ++ - + ++ + + ++ - + +
“壶瓶6号” - + + - + + - + ++ + + ++
“壶瓶7号” - - + - + ++ - + ++ + + ++
“壶瓶8号” - + ++ - + ++ + + + - + ++
  注:“-”表示无抑制作用,“+”表示有轻微的抑制作用,“++”表示有明显的抑
制作用。
3 讨论
3.1 血型与凝集素凝集活力的关系
13个枣品种的叶片中提取的粗蛋白对人的4种血
细胞在凝集效价为20 时均有凝集作用;在凝集效价为
20时,同种凝集素对不同种类的血细胞的凝集活力不
同,这是由于不同类型的红细胞,其表面结构有一定的
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·研究简报· 北方园艺2012(01):31~34
差异,比如细胞表面能与植物凝集素结合的位点的数量
或细胞膜的流体化状态等。所以植物凝集素对红细胞
的凝集作用也具有一定的选择性,或者有凝集效果的强
弱之分[8]。不同凝集素对同一种血细胞的凝集作用不
同,该试验中不同凝集素对同一种血细胞的凝集作用不
同的结论与前人在其它材料的研究结果一致[9],这与其
凝集素的含量不同及其含有的凝集素种类、性质和糖结
合位点不同有关。
3.2 13种枣叶中糖对凝集素的抑制作用
凝集素能与细胞表面的糖相结合从而使血细胞凝
集,对其产生抑制作用的糖被认为结构互补于凝集素结
合部位。大多数凝集素对寡糖具有更高的亲和力。与
寡糖相比,尤其是更为复杂的寡糖相比,单糖或双糖需
更高的浓度才能对凝集素抑制。这是因为凝集素的糖
结合位点与寡糖或复杂寡糖更为互补的缘故[10]。该试
验中4种糖对13种枣叶凝集素均有抑制作用,且葡萄糖
和果糖对凝集素的抑制作用较弱,这与前人的研究结果
一致,而麦芽糖和蔗糖的抑制作用则较强,试验中在4
种糖的浓度都为2mg/mL时,葡萄糖和果糖对个别凝
集素出现抑制作用,麦芽糖和蔗糖对各种基本都有抑制
作用;同一种糖浓度越大对同种凝集素的抑制作用
越强。
参考文献
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The Study of Several Dates Varieties Lectin in Leaf for Blood Coagulation Effect
HAN Hong-yan1,JI Ai-qing1,LV Chen-chen1,YAO Wei-wei 2,LI Xiang3
(1.Jinzhong University,Yuci,Shanxi 030600;2.Sichuan Agriculture University,Ya’an,Sichuan 611830;3.Tianjin Normal University,
Tianjin 300387)
Abstract:13dates Lectin of leaves extracted by ammonium sulfate precipitation,dialysis,got protein extracted fluid,
which impacted diferent types of red blood cels detection agglutinate activity(people type A,type B,type AB,type O
blood),and through the sugar suppression test,compared the biological activity of Lectin.The results showed that
Lectin in diferent varieties dates had diferent activity;Same Lectin to diferent kinds of blood cels had diferent efect;
As for the aggregation titer 20,date leaf Lectin of‘Li Dates’to type A,type B,type O,AB blood cels separately for
moderate aggregation,highly agglutinate,moderate agglutinate,mild aggregation;Diferent kind of Lectin to same kind
of blood cels had diferent aggregation function:As for the aggregation titer 20,‘HuPing Date 1’to type B cels for
height of aggregation,‘Jun Dates’to type B cels for moderate aggregation,‘HuPing 6’to type B cels for mild
aggregation;Sugar to the aggregation function of Lectin were restrained,and inhibiting efect was concerned with its
concentration and molecular structure,the inhibition of glucose and fructose were relatively weak,but the inhibition of
maltose and sucrose was stronger.In a word,‘Jun Dates’and‘HuPing 6’had the strongest aggregation function,
HuPing 4had the weakest aggregation function.
Key words:Date leaves;Lectin;blood cels;sugar suppression
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