全 文 ：第 5 卷 第 5 期 农 业 工 程 Vol． 5 No． 5
2015 年 9 月 Agricultural Engineering Sept． 2015
收稿日期:2015-08-23 修回日期:2015-09-02
基金项目:滨州学院科研基金项目 (项目编号:BZXYG1318)
作者简介:张圣燕，讲师，研究方向:天然产物提取。E-mail:zsykyx@ 126. com
响应面法优化微波提取冬枣叶总黄酮及其抗氧化活性
张圣燕
(滨州学院化学工程系，滨州 256603)
摘 要:采用微波法提取冬枣叶中总黄酮，研究了微波温度、微波时间、微波功率、液料比和乙醇体积分数对总黄酮
提取率的影响。在单因素试验的基础上，采用 Box-Behnken试验设计及响应面分析法对冬枣叶总黄酮的微波提取工艺
进行优化，建立回归方程。得最佳提取工艺条件:微波温度 70 ℃、微波时间 6 min、微波功率 500 W、液料比 60 ∶ 1、
乙醇体积分数 50%，在此条件下，总黄酮提取率为 3. 760%，与响应面拟合所得方程的预测值 3. 757%符合良好。对
提取的总黄酮抗氧化性研究表明，冬枣叶总黄酮对于羟基自由基清除能力较强，有一定的抗氧化活性。
关键词:冬枣叶;总黄酮;微波;响应面;抗氧化
中图分类号:TS210. 1 文献标识码:A 文章编号:2095-1795(2015)05-0065-07
Optimization of Microwave Extraction of Total Tlavones from‘Dongzao’Jujube
Leaves by Ｒesponse Surface Methodology and Flavones Antioxidant Activity
Zhang Shengyan
(Department of Chemical Engineering Binzhou University，Binzhou 256603，China)
Abstract:Microwave was used to extract total flavones from‘Dongzao’ jujube leaves． Effects of the extraction parameters on
the yield of total flavones from‘Dongzao’ jujube leaves were studied，such as microwave temperature，microwave time，micro-
wave power，liquid-solid ratio and ethanol concentration． Box-Behnken design and response surface analysis were adopted to es-
tablish regression equation of extraction of total flavones from‘Dongzao’ jujube leaves on single factor tests． Optimal extraction
conditions were microwave temperature 70 ℃，microwave time 6min，microwave power 500 W，liquid-solid ratio 60 ∶ 1 and
ethanol concentration 50% ． Under the conditions，the yield of total flavones was 3. 760%，which was consistent with the pre-
dicted yield of total flavones of 3. 757% ． Ｒesults showed that the total flavones from leaves of‘Dongzao’ jujube were studied．
Ｒesults also showed that the total flavones had strong activity for hydroxyl radical scavenging，and had a good antioxidant activi-
ty．
Key words:‘Dongzao’ jujube leaves，Total flavones，Microwave，Ｒesponse surface methodology，Antioxidant
0 引言
黄酮是自然界中存在的一类天然多酚化合物，属
于植物的次级代谢产物，在植物内部主要与糖结合成
苷类或以碳糖基的形式存在，广泛存在于水果、蔬
菜、坚果、谷物和茶等膳食中［1-3］。黄酮有多种生物
活性，可降压、镇痛、抗菌、清热解毒和抗癌等，对
治疗冠心病、延缓动脉粥样硬化和消除自由基等方面
有显著效果［4］。人体自身不能合成黄酮，只能从食
物中摄取，因此许多科学家都在积极研究探讨植物体
中黄酮的提取、分离与纯化［5］。研究表明，枣叶中
含有黄酮类化合物，冬枣叶中黄酮的提取可为黄酮的
提取研究提供来源参考［6］。
目前，黄酮的提取方法主要有溶剂提取法［7-8］、
超临界萃取法［9-10］、微波辅助提取法［11-12］、超声波
辅助提取法［13-14］、酶解法［15-16］、亚临界－水提取法［17］
和闪式提取法［18］等，而用于枣叶中总黄酮提取的方
法主要有溶剂浸提法［7］和酶解法［15］。本试验采用微
波法提取冬枣叶中的总黄酮，应用响应面法优化提取
工艺，并对提取的总黄酮进行抗氧化性能的研究，以
期为冬枣叶的进一步开发利用提供技术支持。
1 材料与方法
1. 1 材料与仪器
冬枣叶采摘自滨州沾化冬枣园;芦丁标准品
(纯度≥98%)由北京恒元启天化工技术研究院提
供;无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、石油
醚、30%双氧水、水杨酸和硫酸亚铁均为分析纯。
农业工程 食品科学与工程
Agilent8451 型紫外分光光度计 (美国 Agilent) ;
MAS-Ⅱ型微波萃取设备 (上海新仪微波化学科技有
限公司) ;SSY4 型电热恒温水浴锅 (北京泰克仪器
有限公司) ;AUY-120 型电子天平 (日本岛津) ;KQ-
500VDE型双频数控超声波清洗器 (江苏昆山超声波
仪器有限公司) ;SHZ-D (Ⅲ)型水循环真空泵 (山
东甄城华鲁电热仪器有限公司) ;DGF3014 型电热鼓
风干燥箱 (南京实验仪器厂)。
1. 2 试验方法
1. 2. 1 标准曲线的绘制
以芦丁为对照品，按照 NaNO2-Al (NO3)3 比色
法［15］绘制芦丁标准曲线，测定冬枣叶总黄酮含量。
芦丁标准曲线的线性回归方程:A = 9. 302 3 × C －
0. 0195 3，线性相关系数:Ｒ2 = 0. 993 9。
1. 2. 2 冬枣叶总黄酮微波提取工艺及含量测定
新鲜冬枣叶→洗净→干燥→粉碎→过目→超声脱
脂→干燥→微波提取→抽滤→滤液定容→NaNO2-Al
(NO3)3 比色法测定冬枣叶总黄酮的含量。
总黄酮提取率(%)= C ×定容液体积 ×稀释倍数
干冬枣叶质量
×
100%
式中 C———总黄酮浓度，mgmL
1. 2. 3 单因素试验
准确称取预处理好的冬枣叶粉末 1. 0 g，通过改
变微波温度、微波时间、微波功率、液料比和乙醇体
积分数进行单因素试验，根据总黄酮提取率，确定出
各因素试验的最宜值。
(1)微波时间对总黄酮提取率的影响。
微波时间分别为 2、3、4、5、6、7 和 8 min，微
波功率 500 W，微波温度 70 ℃，液料比 50 ∶ 1，乙醇
体积分数 70%的条件下，采用微波法提取冬枣叶总
黄酮，测定并计算提取率。
(2)微波功率对总黄酮提取率的影响。
微波时间 5 min，微波功率分别为 400、500、
600、700、800 和 900 W，微波温度 70 ℃，液料比
50 ∶ 1，乙醇体积分数 70%的条件下，采用微波法提
取冬枣叶总黄酮，测定并计算提取率。
(3)微波温度对总黄酮提取率的影响。
微波时间 5 min，微波功率 600 W，微波温度分
别为 50、60、70、75 和 80 ℃，液料比 50 ∶ 1，乙醇
体积分数 70%的条件下，采用微波法提取冬枣叶总
黄酮，测定并计算提取率。
(4)料液比对总黄酮提取率的影响。
微波时间 5 min，微波功率 600 W，微波温度
70 ℃，液料比分别为 20 ∶ 1、30 ∶ 1、40 ∶ 1、50 ∶ 1、
60 ∶ 1 和 70 ∶ 1，乙醇体积分数 70%的条件下，采用微
波法提取冬枣叶总黄酮，测定并计算提取率。
(5)乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响。
微波时间 5 min，微波功率 600 W，微波温度
70 ℃，液料比 50 ∶ 1，乙醇体积分数分别为 50%、
60%、70%、80%和 90%的条件下，采用微波法提
取冬枣叶总黄酮，测定并计算提取率。
1. 2. 4 响应面试验设计
在单因素试验的基础上，以冬枣叶总黄酮提取率
(Ｒ1 )为响应值，确定 Box-Benhnken 响应面设计的
因子为微波时间 (A)、微波功率 (B)、液料比
(C)、乙醇体积分数 (D)。根据 Box-Benhnken 试
验设计原理，设计 4 因素 3 水平组合试验，采用响应
面分析法对微波提取工艺参数进行优化，获得最优提
取工艺条件。试验设计与统计分析软件为 Desigh-Ex-
per 8. 0. 6. 1。试验因素水平设计见表 1。
表 1 响应面分析因素与水平
Tab. 1 Variables and their coded levels used in response surface
analysis
水平
因素
微波时间
A min
微波功率
B W
液料比
C
乙醇体积分数
D %
－ 1 4 500 40 ∶ 1 50
0 5 600 50 ∶ 1 60
1 6 700 60 ∶ 1 70
1. 2. 5 冬枣叶总黄酮抗氧化活性测定
以黄酮清除羟基自由基的能力来衡量冬枣总黄酮
的抗氧化活性［19-21］。
移取 25. 0 mL 6 mmolL 的 H2O2 溶液和 25. 0 mL
2 mmolL的 FeSO4 溶液置于 250 mL 的锥形瓶中，混
合均匀后加入 75 mL 6 mmolL 的水杨酸乙醇溶液，
36 ℃恒温水浴 15 min，于 510 nm处测其吸光值 A0 。
从测定体系中取 24. 0 mL 放入小试管中，分别加入
1. 0 mL 不同浓度的提取液 (0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、
0. 5 和 0. 6 mgmL) ，36 ℃恒温水浴 15 min 后，于
510 nm测其吸光值 AX 。
·OH清除率(%)=
A0 － Ax
A0
× 100%
式中 A0 ———空白对照的吸光度
Ax ———加入提取液后的的吸光度
2 结果与分析
2. 1 单因素试验
2. 1. 1 微波时间对总黄酮提取率的影响
微波时间对总黄酮提取率的影响见图 1。由图 1
可知，起初随着微波时间的延长，冬枣叶总黄酮的提
取率逐渐升高，当微波时间达到 5 min 后，再延长微
波时间，黄酮的提取率基本不变。说明在 5 min 时，
66
张圣燕:响应面法优化微波提取冬枣叶总黄酮及其抗氧化活性
提取效果已基本达到最佳，再延长微波时间对总黄酮
的提取率无显著影响。这可能是由于经过 5 min 的微
波提取，冬枣叶细胞中的总黄酮已基本提取完全，继
续延长提取的时间，总黄酮的提取率增加不大。
图 1 微波时间对总黄酮提取率的影响
Fig. 1 Effect of microwave time on the yield of total flavones
2. 1. 2 微波功率对总黄酮提取率的影响
微波功率对总黄酮提取率的影响见图 2。由图 2
可知，微波功率较低时，冬枣叶总黄酮提取率随着微
波功率的增加显著升高，当微波功率达到 600 W 时，
总黄酮提取率达到最大，再增加微波功率，总黄酮提
取率开始下降。这可能是因为微波功率的增加，使细
胞壁的电磁波作用增强，导致细胞壁的破碎程度增
大，总黄酮的溶解度增大，提取率升高。但当微波功
率增加到 600 W 后，继续增加微波功率，反而加快
了黄酮分子间的振动，破坏了黄酮分子的内结构，导
致总黄酮提取率降低。
图 2 微波功率对总黄酮提取率的影响
Fig. 2 Effect of microwave power on the yield of total flavones
2. 1. 3 微波时间对总黄酮提取率的影响
微波时间对总黄酮提取率的影响见图 3。由图 3
可知，当微波温度较低时，冬枣叶总黄酮的提取率随
着微波温度的升高而升高，当微波温度达到 70 ℃左
右时，总黄酮的提取率达到最高，继续升高温度，总
黄酮提取率显著降低。这可能是由于微波温度较低
时，温度的升高有利于黄酮的溶出，但当温度超过
70 ℃，温度继续升高，使得冬枣叶黄酮分子结构发
生改变，导致总黄酮的含量减少，提取率降低。
图 3 微波温度对总黄酮提取率的影响
Fig. 3 Effect of microwave temperature on the yield of total
flavones
2. 1. 4 液料比对总黄酮提取率的影响
液料比对总黄酮提取率的影响见图 4。由图 4 可
知，冬枣叶总黄酮提取率随液料比中溶剂量的增加先
增大后减小，当液料比达到 60 ∶ 1 时，总黄酮提取率
达到最大。这可能是因为起初溶剂量的增加，有利于
黄酮的溶出，使得总黄酮的提取率增大;但当液料比
达到 60 ∶ 1 时，继续增加溶剂量，使冬枣叶中其他因
亲水性杂质的溶出量增加，导致黄酮与乙醇－水分子
的亲和性减小，提取率降低。
图 4 液料比对总黄酮提取率的影响
Fig. 4 Effect of liquid-solid ratio on the yield of total flavones
2. 1. 5 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响
乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响见图 5。由
图 5可知，冬枣叶总黄酮提取率随着乙醇体积分数的
增加表现出先增大后减小的趋势，当乙醇体积分数达
76
农业工程 食品科学与工程
到 70%时，总黄酮的提取率达到最大。这可能是因为
随乙醇体积分数的增加，黄酮在乙醇溶液中的溶解度
增加，导致提取率相应增大;但当乙醇体积分数超过
70%时，一些醇溶性杂质、亲脂性强成分溶出量增多，
这些成分与黄酮类物质竞争乙醇－水分子，导致黄酮的
溶出量减少，从而降低了总黄酮的提取率［20］。
图 5 乙醇体积分数对总黄酮提取率的影响
Fig. 5 Effect of ethanol concentration on the yield of total fla-
vones
2. 2 响应面试验
2. 2. 1 响应面试验设计与结果
采用 Desigh-Exper 8. 0. 6. 1 软件，按照 Box-Be-
hnken组合设计，依据单因素试验结果选取微波时间
(A)、微波功率 (B)、液料比 (C)、乙醇体积分
数 (D)4 因素作为自变量，以冬枣叶总黄酮提取
率 (Ｒ1 )作为响应值。试验设计方案及数据处理结
果见表 2。
表 2 Box-Behnken设计方案及响应值结果
Tab. 2 Box-behnken experimental design and corresponding re-
sults
试验号 A B C D 提取率%
1 4 500 50 ∶ 1 60 2. 889
2 6 500 50 ∶ 1 60 2. 778
3 4 700 50 ∶ 1 60 2. 878
4 6 700 50 ∶ 1 60 2. 833
5 5 600 40 ∶ 1 50 2. 794
6 5 600 60 ∶ 1 50 3. 050
7 5 600 40 ∶ 1 70 2. 794
8 5 600 60 ∶ 1 70 2. 228
9 4 600 50 ∶ 1 50 2. 900
10 6 600 50 ∶ 1 50 2. 883
11 4 600 50 ∶ 1 70 3. 150
12 6 600 50 ∶ 1 70 2. 772
13 5 500 40 ∶ 1 60 3. 067
14 5 700 40 ∶ 1 60 2. 933
15 5 500 60 ∶ 1 60 3. 172
16 5 700 60 ∶ 1 60 2. 972
17 4 600 40 ∶ 1 60 2. 628
18 6 600 40 ∶ 1 60 2. 528
(续表 2)
试验号 A B C D 提取率%
19 4 600 60 ∶ 1 60 3. 106
20 6 600 60 ∶ 1 60 2. 989
21 5 500 50 ∶ 1 50 2. 894
22 5 700 50 ∶ 1 50 2. 833
23 5 500 50 ∶ 1 70 3. 144
24 5 700 50 ∶ 1 70 3. 106
25 5 600 50 ∶ 1 60 2. 355
26 5 600 50 ∶ 1 60 2. 367
27 5 600 50 ∶ 1 60 2. 357
28 5 600 50 ∶ 1 60 2. 367
29 5 600 50 ∶ 1 60 2. 369
2. 2. 2 回归模型的建立及显著性检验
通过统计分析软件 Design Expert8. 0. 6. 1 对表 2
中的试验数据进行二次多项式回归拟合，得到微波提
取冬枣叶总黄酮的四元二次回归方程模型:
Ｒ1 = 2. 36 － 0. 064A － 0. 032B + 0. 064C － 0. 013D
+ 0. 016AB － 0. 004 250AC － 0. 090AD － 0. 016BC +
0. 005 750BD － 0. 21CD + 0. 22A2 + 0. 37B2 + 0. 21C2 +
0. 25D2
建立多元二次响应面回归模型，对该方程的回归
分析与方差分析结果见表 3。
表 3 回归模型方差分析
Tab. 3 Variance analysis of regression model
来源 平方和 自由度 均方 F值 P值
Model 1. 58 14 0. 11 2. 51 0. 047 9
A 0. 049 1 0. 049 1. 09 0. 313 6
B 0. 013 1 0. 013 0. 28 0. 604 8
C 0. 050 1 0. 050 1. 11 0. 310 5
D 2. 133 ×10 －3 1 2. 133 ×10 －3 0. 047 0. 830 7
AB 1. 089 ×10 －3 1 1. 089 ×10 －3 0. 024 0. 878 6
AC 7. 225 ×10 －5 1 7. 225 ×10 －5 1. 606 ×10 －3 0. 968 6
AD 0. 033 1 0. 033 0. 72 0. 409 0
BC 1. 089 ×10 －3 1 1. 089 ×10 －3 0. 024 0. 878 6
BD 1. 322 ×10 －4 1 1. 322 ×10 －4 2. 940 ×10 －3 0. 957 5
CD 0. 17 1 0. 17 3. 76 0. 073 1
A2 0. 32 1 0. 32 7. 10 0. 018 5
B2 0. 88 1 0. 88 19. 48 0. 000 6
C2 0. 29 1 0. 29 6. 53 0. 022 9
D2 0. 40 1 0. 40 8. 91 0. 009 8
残差 0. 63 14 0. 045 — —
失拟项比
F值
0. 63 10 0. 063 18. 85 0. 052 2
纯误差 1. 680 ×10 －4 4 4. 200 ×10 －5 — —
总和 2. 21 28 — —
B 0. 013 1 0. 013 0. 28 0. 604 8
模型的可靠性可从方差分析及相关系数来考察。
统计学根据显著性检验方法所得到的 P 值，一般认
为 P ＜ 0. 05 为显著，P ＜ 0. 01 为非常显著。由表 3 可
知，模型的 P ＜ 0. 05，表明二次方程拟合显著。失拟
项 P ＞ 0. 05，表明失拟项差异不显著，方程对试验有
较好的拟合线性。由 F 检验可以推测出因素贡献率
86
张圣燕:响应面法优化微波提取冬枣叶总黄酮及其抗氧化活性
为 C ＞ A ＞ B ＞ D，即液料比 ＞微波时间 ＞微波功率
＞乙醇体积分数。在总的作用因素中，A2、B2、C2和D2
项的 P ＜ 0. 05，表明影响是显著的;而方程交互项的
P ＞ 0. 05，表明其对冬枣叶总黄酮提取率的影响不显
著，各具体因子对响应值的影响不是简单的线性关
系。
2. 2. 3 响应面交互作用分析
为考察交互项对提取率的影响，其他因素固定在
零水平，选取两个交互的因素对冬枣叶总黄酮提取率
进行响应面图分析，结果见图 6。
图 6 各两因素交互作用对总黄酮提取率的影响
Fig. 6 Ｒesponse surface plots showing the effects of any two factors on the yield of total flavones
图 6 结果表明，曲面上相同提取率对应的因素值
在底面上形成的曲线为等高线，等高线的形状反映了
交互作用的强弱。当等高线接近于圆形时，两因素的
交互作用弱;当等高线呈现椭圆形时，两因素的交互
作用强。从 6 组图可以看出，液料比与乙醇体积分数
的交互作用最显著。
2. 2. 4 响应面因素水平优化结果
应用响应面分析方法对回归模型进行优化分析，
寻找最优响应结果为，微波时间 6 min，微波功率
500 W，液料比 60 ∶ 1，乙醇体积分数 50%，响应面
最优值为 3. 757%。
2. 3 模型验证试验
在响应面分析优化的最佳提取条件下，即微波时
间 6 min，微波功率500 W，液料比60 ∶ 1，乙醇体积分
数 50%，重复试验 3 次，进行模型验证试验，试验数
据见表 4。3 次试验的平均提取率为 3. 760%，与预测
值 3. 757%非常接近，说明采用响应面法优化得到的微
波提取条件参数可靠，具有一定的实用价值。
2. 4 对比试验
在最佳工艺条件下，分别采用乙醇浸提法 (提
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农业工程 食品科学与工程
表 4 响应面试验优化条件下总黄酮提取率
Tab. 4 Yield of total flavones under optimal condition with re-
sponse surface test
试验编号 1 2 3 平均值
提取率% 3. 765 3. 750 3. 764 3. 760
取温度 80 ℃，提取时间 4 h，液料比 20 ∶ 1，乙醇体
积分数 70%)和微波法 (微波功率 500 W，微波温
度 70 ℃，微波时间 6 min，液料比 60 ∶ 1，乙醇体积
分数 50%)提取冬枣叶中的总黄酮，测定含量，比
较提取率。对比试验结果见表 5。
表 5 提取工艺对总黄酮提取率的影响
Tab. 5 Effect of extraction technologies on the yield of total fla-
vones
提取方法 乙醇浸提法 微波法
提取率% 1. 50 3. 75
由表 5 可知，在最佳工艺条件下，乙醇浸提法的
提取率为 1. 50%，微波法的提取率为 3. 75%。可见，
相对于乙醇浸提法而言，微波法可缩短提取时间，提
高冬枣中总黄酮的提取率。
2. 5 抗氧化活性分析
H2O2 与 Fe
2 +混合会产生羟基自由基，在体系中
加入水杨酸捕捉羟基自由基会产生有色的物质，该种
物质在 510 nm下有最大的吸收，根据吸光度的大小
衡量羟基自由基的多少，评价冬枣叶总黄酮的抗氧化
性。
总黄酮浓度对羟基自由基清除的影响见图 7。由
图 7 可知，在测定范围内，总黄酮对羟基自由基有一
定的清除能力。开始随着冬枣叶总黄酮浓度的增加，
清除羟基自由基能力显著增强，当总黄酮浓度达到
0. 4 mgmL后，随总黄酮浓度的增加，羟基自由基的
清除能力基本稳定，为 66. 89%。
图 7 总黄酮浓度对羟基自由基清除的影响
Fig. 7 Effect of total flavones concentration on hydroxyl radical
scavenging
3 结束语
采用微波法提取冬枣叶中总黄酮，利用单因素试
验分析了微波功率、微波时间、液料比及乙醇体积分
数对冬枣叶中总黄酮提取率的影响;在单因素试验基
础上，应用响应面对提取工艺进行优化，建立回归模
型。得到回归方程:Ｒ1 = 2. 36 － 0. 064A － 0. 032B +
0. 064C －0. 013D +0. 016AB －0. 004 250AC －0. 090AD －
0. 016BC + 0. 005 750BD － 0. 21CD + 0. 22A2 + 0. 37B2 +
0. 21C2 + 0. 25D2 ;最佳提取工艺:微波温度70 ℃、微
波时间 6 min、微波功率 500 W、液料比 60 ∶ 1、乙醇
体积分数 50%，此工艺条件下冬枣叶总黄酮的提取率
为 3. 760%，与模型预测值 3. 757%吻合良好。在最佳
工艺条件下，微波法与传统的乙醇浸提法相比，微波
法提取冬枣中总黄酮的提取率较高。
抗氧化活性分析结果表明，冬枣叶总黄酮对羟基
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