全 文 ：中国农业大学学报　２０１６，２１（６）：５６－６７
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｈｔｔｐ：∥ｘｕｅｂａｏ．ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
ＤＯＩ：１０．１１８４１／ｊ．ｉｓｓｎ．１００７－４３３３．２０１６．０６．０７
苜蓿根腐病的病原分离、鉴定与杀菌剂毒力测定
阮 柳１　马占鸿１　刘振宇２　秦 丰１　王海光１
（１．中国农业大学 农学与生物技术学院，北京１００１９３；
２．河北省农林科学院 农业资源环境研究所，石家庄０５００５１）
摘　要　为了解河北苜蓿根腐病病原种类，以便有目的地加以防治，对从河北采集的苜蓿根腐病样品进行了病原
分离、鉴定以及致病性和室内毒力测定。根据形态学和核糖体内转录间隔区ＩＴＳ４和ＩＴＳ５、延伸因子ＥＦ－１Ｈ 和
ＥＦ－２Ｔ序列作为引物鉴定，分离出的７１株致病菌株均为镰孢菌属（Ｆｕｓａｒｉｕｍ），其中，木贼镰孢（Ｆ．ｅｑｕｉｓｅｔｉ）５５株，
尖孢镰孢（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）７株，层出镰孢（Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）６株，变红镰孢（Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ）２株，茄镰孢（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）
１株。尖孢镰孢菌株Ｄ１９－２、层出镰孢菌株Ｓ４５和茄镰孢菌株Ｑ１的致病性最强。通过含毒介质法测定，结果表明，
４０％腈菌唑可湿性粉剂（ＷＰ）、５０％多菌灵 ＷＰ、嘧环·咯菌腈（３７％嘧菌环胺和２５％咯菌腈）水分散粒剂（ＷＤＧ）、
５０％福美双 ＷＰ、７０％甲基硫菌灵 ＷＰ和１０％苯醚甲环唑 ＷＤＧ对这３个菌株菌丝生长均有较好抑制作用，而８０％
代森锰锌 ＷＰ、９９％恶霉灵 ＷＰ、４０％菌核净 ＷＰ的抑制作用较弱。
关键词　苜蓿根腐病；镰孢菌；病原鉴定；杀菌剂；毒力测定
中图分类号　Ｓ　４３２．４＋４；Ｓ　４３５．４　　　文章编号　１００７－４３３３（２０１６）０６－００５６－１２　　　文献标志码　Ａ
收稿日期：２０１５－０７－２０
基金项目：公益性行业（农业）科研专项经费项目（２０１３０３０５７）
第一作者：阮柳，硕士研究生，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｈａｓｈａｒｕａｎ１２９＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：王海光，副教授，主要从事植物病害流行学和宏观植物病理学研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｈａｉｇｕａｎｇ＠ｃａｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｃａｕｓｉｎｇ　ａｌｆａｌｆａ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ
ＲＵＡＮ　Ｌｉｕ１，ＭＡ　Ｚｈａｎ－ｈｏｎｇ１，ＬＩＵ　Ｚｈｅｎ－ｙｕ２，ＱＩＮ　Ｆｅｎｇ１，ＷＡＮＧ　Ｈａｉ－ｇｕａｎｇ１＊
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１００１９３，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏ－ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，Ｈｅｂｅｉ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ
Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ　０５００５１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｏ　ｄｉｓｃｏｖｅｒ　ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｃａｕｓｉｎｇ　ａｌｆａｌｆａ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ　ｉｎ　Ｈｅｂｅｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｉｎａ，ａｎｄ　ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ　ｆｏｒ
ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｃｏｎｔｒｏｌ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ，ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｄｏｏｒ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ｔｅｓｔ　ｏｆ　ｐａｔｈｏｇｅｎｓ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ
ｓａｍｐｌｅｓ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ　ｃｏｌｅｃｔｅｄ　ｉｎ　Ｈｅｂｅｉ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ，ａｎｄ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ　ｆｏｒ
ｃｏｎｔｒｏｌｉｎｇ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｗａｓ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ａ　ｔｏｔａｌ　ｏｆ　７１ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅｄ　ｔｉｓｓｕｅｓ　ａｎｄ
ｗｅｒｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ　ａｓ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒｓ（ＩＴＳ４ａｎｄ　ＩＴＳ５）ａｎｄ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ（ＥＦ－１Ｈａｎｄ
ＥＦ－２Ｔ）ａｓ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ＰＣＲ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｂｔａｉｎｅｄ　ｂｙ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ
ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　７１
ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｆｕｓａｒｉｕｍｉｎｃｌｕｄｅｄ　５５ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｆ．ｅｑｕｉｓｅｔｉ，ｓｅｖｅｎ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，ｓｉｘ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ，ｔｗｏ
ｓｔｒａｉｎｓ　ｏｆ　Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ ａｎｄ　ｏｎｅ　ｓｔｒａｉｎ　ｏｆ　Ｆ．ｓｏｌａｎｉ．Ｔｈｅ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ｓｔｒａｉｎ
Ｄ１９－２ｏｆ　Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ，ｓｔｒａｉｎ　Ｓ４５ｏｆ　Ｆ．ｓｏｌａｎｉ　ａｎｄ　ｓｔｒａｉｎ　Ｑ１ｏｆ　Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍｈａｄ　ｔｈｅ　ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ　ａｍｏｎｇ
ａｌ　ｏｆ　７１ｓｔｒａｉｎｓ．Ｔｈｅ　ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒｏｎｇｅｓｔ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｓｔｒａｉｎｓ（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　Ｄ１９－２，Ｓ４５ａｎｄ　Ｑ１）ｔｏ　４０％
ｍｙｃｌｏｂｕｔａｎｉｌ　ｗｅｔａｂｌｅ　ｐｏｗｄｅｒ（ＷＰ），５０％ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ　ＷＰ，９９％ｈｙｍｅｘａｚｏｌ　ＷＰ，４０％ｄｉｍｅｔａｃｈｌｏｎｅ　ＷＰ，ｃｙｐｒｏｄｙｎｉｌ·
　第６期 阮柳等：苜蓿根腐病的病原分离、鉴定与杀菌剂毒力测定
ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ（３７％ｃｙｐｒｏｄｙｎｉｌ　ａｎｄ　２５％ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ）ｗａｔｅｒ　ｄｉｓｐｅｒｓｉｂｌｅ　ｇｒａｎｕｌｅ（ＷＤＧ），５０％ｔｈｉｒａｍ　ＷＰ，８０％ ｍａｎｃｏｚｅｂ
ＷＰ，７０％ｔｈｉｏｐｈａｎａｔｅ－ｍｅｔｈｙｌ　ＷＰ　ａｎｄ　１０％ｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅ　ＷＤＧ，ｗａｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｕｓｉｎｇ　ｔｈｅ　ｐｏｉｓｏｎ　ｍｅｄｉｕｍ　ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　４０％ｍｙｃｌｏｂｕｔａｎｉｌ　ＷＰ，５０％ｃａｒｂｅｎｄａｚｉｍ　ＷＰ，ｃｙｐｒｏｄｙｎｉｌ·ｆｌｕｄｉｏｘｏｎｉｌ　ＷＤＧ，５０％ｔｈｉｒａｍ　ＷＰ，７０％
ｔｈｉｏｐｈａｎａｔｅ－ｍｅｔｈｙｌ　ＷＰ　ａｎｄ　１０％ｄｉｆｅｎｏｃｏｎａｚｏｌｅ　ＷＤＧ　ｈａｄ　ｂｅｔｅｒ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｅｃｔｓ　ｏｎ　ｍｙｃｅｌｉａ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒａｉｎｓ
ｔｈａｎ　ｔｈｅ　ｏｔｈｅｒ　ｔｈｒｅｅ　ｔｙｐｅｓ　ｏｆ　ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ａｌｆａｌｆａ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ；ｐａｔｈｏｇｅｎ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ；ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
　　苜蓿（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ）为多年生豆科植物，抗
逆性强，可改善土壤、保持水土，营养价值高、适口性
好，是世界上广泛种植的牧草，被称为“牧草之王”。
随着畜牧业的发展，苜蓿需求量迅速增加，苜蓿种植
面积日益增大。苜蓿根腐病作为一种重要的根部土
传病害，病原种类较多，该病害的严重发生会影响苜
蓿建植，给生产带来严重损失。
国外研究人员报道的苜蓿根腐病病原有尖孢镰
孢 （Ｆｕｓａｒｉｕｍ　ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）［１－３］、锐 顶 镰 孢 （Ｆ．
ａｃｕｍｉｎａｔｕｍ）［２－４］、燕麦镰孢（Ｆ．ａｖｅｎａｃｅｕｍ）［３－４］、茄
镰孢（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ）［３－４］、接骨木镰孢（Ｆ．ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）［３］、
三 线 镰 孢 （Ｆ．ｔｒｉｃｉｎｃｔｕｍ）［４］、木 贼 镰 孢 （Ｆ．
ｅｑｕｉｓｅｔｉ）［２］、半裸镰孢（Ｆ．ｓｅｍｉｔｅｃｔｕｍ）［２］、镰状镰孢
（Ｆ．ｆｕｓａｒｉｏｉｄｅｓ）［２］、疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｓｐｐ．）［２］、腐
霉菌 （Ｐｙｔｈｉｕｍ　ｓｐｐ．）［２］、茄 丝 核 菌 （Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ
ｓｏｌａｎｉ）［２］、甘薯生小核菌（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｕｍ　ｂａｔａｔｉｃｏｌａ）［２］、
菜豆生壳球孢（Ｍａｃｒｏｐｈｏｍｉｎａ　ｐｈａｓｅｏｌｉｎａ）［３］、黏质
沙雷氏菌（Ｓｅｒｒａｔｉａ　ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）［４］等。
我国对于由镰孢菌引起的苜蓿根腐病的病原调
查和鉴定主要集中在东北、西北、华北等苜蓿种植较
为广泛的北方地区。陈雅君等［５］调查表明尖孢镰孢
和茄镰孢是引起黑龙江苜蓿根腐病的主要病原。李
敏权等［６］研究表明尖孢镰孢、半裸镰孢、锐顶镰孢是
甘肃定西地区苜蓿根腐病的致病菌。王多成等［７］研
究表明镰孢菌是甘肃张掖、酒泉苜蓿根腐病的优势
致病菌，茄镰孢致病性最强，其次是尖孢镰孢和串珠
镰孢（Ｆ．ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）。孟嫣［８］研究了甘肃省干旱
灌区苜蓿地镰孢菌种群结构，结果表明不同季节镰
孢菌的主要种群不同，春季主要为茄镰孢、串珠镰孢
和尖孢镰孢；夏季主要为茄镰孢、砖红镰孢（Ｆ．
ｌａｔｅｒｉｔｉｕｍ）和尖孢镰孢；秋季主要为砖红镰孢、茄镰
孢、黄色镰孢 （Ｆ．ｃｕｌｍｏｒｕｍ）；冬季主要为木贼镰
孢、砖红镰孢、半裸镰孢；确定了主要种群外的雪腐
镰孢（Ｆ．ｎｉｖａｌｅ）、拟丝孢镰孢（Ｆ．ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、
潮湿镰孢（Ｆ．ｕｄｕｍ）、木贼镰孢、三线镰孢等土壤镰
孢菌也能引起苜蓿根腐病。樊少华［９］研究表明甘肃
省干旱灌区茄镰孢、砖红镰孢、尖孢镰孢等苜蓿镰孢
菌的不同菌株之间存在致病性差异。曹丽霞等［１０］
研究表明镰孢菌是内蒙古中部地区苜蓿根腐病的优
势病原菌，致病性强弱依次是茄镰孢、尖孢镰孢和黄
色镰孢。赵宗峰［１１］在新疆研究表明茄镰孢蓝色变
种（Ｆ．ｓｏｌａｎｉ　ｖａｒ．ｃｏｅｒｕｌｅｕｍ）可引起苜蓿根腐病。
郭玉霞等［１２］研究表明河南安阳苜蓿根部入侵真菌
种类有细交链孢（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ　ａｌｔｅｒｎａｔａ）、茄镰孢、锐
顶镰孢、尖孢镰孢、半裸镰孢、柱孢（Ｃｙｌｉｎｄｒｏｃａｒｐｏｎ
ｄｅｓｔｒｕｃｔｕｎｓ）、多主枝孢（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ　ｈｅｒｂａｒｕｍ）、
燕麦镰孢、茄丝核菌、多隔镰孢（Ｆ．ｄｅｃｅｍｃｅｌｌｕｌａｒｅ），并
且不同季节优势种群明显不同。
对镰孢菌进行形态学分类的主要依据是大型分
生孢子、小型分生孢子、顶细胞和基细胞的特征，分
生孢子梗的特征和瓶梗类型，厚垣孢子的有无和着
生特点，以及菌落生长速度和颜色等。目前，ＤＮＡ
分子标记和主要位点基因序列分析等分子生物学手
段广泛应用于镰孢菌种类鉴定和群体遗传分析，用
于镰孢菌分类的主要基因片段有真菌核糖体ＤＮＡ
内转录间隔区（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ　ｓｐａｃｅｒ，ＩＴＳ）、
２８Ｓ 核 糖 体 大 亚 基 序 列 （２８Ｓｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｌａｒｇｅ
ｓｕｂｕｎｉｔ　ｒＤＮＡ，２８Ｓ ｒＤＮＡ）、基 因 内 间 隔 区
（ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ　ｓｐａｃｅｒ，ＩＧＳ）、线粒体核糖体小亚基
ＤＮＡ （ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ｓｍａｌ　ｓｕｂｕｎｉｔ
ｒＤＮＡ，ｍｔＳＳＵ　ｒＤＮＡ）和一些编码蛋白基因包括延
伸因子ＥＦ－１α（ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　１α，ＥＦ－１α）、β－微管
蛋白（β－ｔｕｂｕｌｉｎ）、组蛋白 Ｈ３（ｈｉｓｔｏｎｅ　Ｈ３）、钙调蛋
白 （ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎ）、高 乌 头 酸 水 合 酶 Ｌｙｓ２
（ｈｏｍｏａｃｏｎｉｔａｔｅ　ｈｙｄｒａｔａｓｅ　Ｌｙｓ２，Ｌｙｓ２）等［１３－１４］。
苜蓿根腐病一旦大面积发生会严重降低苜蓿产
量，甚至需要重新建植。另外，引起根腐病的镰孢菌
可能产生毒素，从而影响以苜蓿为食料的牲畜健
康［１５－１６］。因此，研究苜蓿根腐病和探索其防治方法
具有重要意义。针对苜蓿根腐病，一般采取选用抗
病品种、合理栽培管理和药剂处理的综合措施进行
防治。对于镰孢菌引起的其他作物根腐病，防治效
７５
中 国 农 业 大 学 学 报 ２０１６年 第２１卷　
果较好的药剂有甲基硫菌灵、福美双、苯醚甲环唑、
多菌灵、吡唑醚菌酯、氟硅唑、氯化苦、咪鲜胺、恶霉
灵、代森锰锌、腈菌唑等［１７－２０］。李敏权等［６］测定了
６０％多菌灵可湿性粉剂（ＷＰ）、７０％甲基硫菌灵
ＷＰ、５０％枯腐宁 ＷＰ和５％枯萎绝 ＷＰ对苜蓿根腐
病病原尖孢镰孢、锐顶镰孢、半裸镰孢的抑制效果，
结果表明５％枯萎绝 ＷＰ的效果最好。徐林波等［２１］
测定了１０种杀菌剂对苜蓿茄镰孢的毒力，认为
２．５％咯菌腈悬浮种衣剂、７０％甲基托布津 ＷＰ可
作为生产上参考使用的苜蓿种衣剂。
目前，对于河北苜蓿根腐病病原和防治方面的
研究缺乏。本研究通过对采集于河北的苜蓿根腐病
样品进行室内分离、鉴定、致病性测定，并进行了９
种杀菌剂对强致病菌株的室内毒力测定，筛选出具
有较好抑制作用的６种杀菌剂，旨在为了解河北苜
蓿根腐病病原种类和指导苜蓿根腐病的田间防治提
供参考依据。
１　材料与方法
１．１　材料
２０１３和２０１４年在河北省沧州市黄骅苜蓿种植
地进行了根腐病调查采样，苜蓿品种为中苜一号，采
样时植株经过２次收割，为第３茬。在苜蓿种植地
发现整株发黄枯死，用铁锹挖出根部，根部变褐，侧
根较少，主根较短，纵切发现维管束部分变褐坏死，
基本确定是根腐病样品（图１）。２０１３年所调查地块
具有根腐病症状的植株约占５％，２０１４年具有根腐
病症状的植株所占比例有所增长，约占８％。对于
采集的苜蓿根腐病样品，在实验室内进行病原分离、
纯化和鉴定，然后选用当地种植的苜蓿品种“中苜一
号”种子进行病原致病性测定和杀菌剂毒力测定。
研究所用培养基为ＰＤＡ培养基（马铃薯２００ｇ，葡
萄糖１８ｇ，琼脂１８ｇ，蒸馏水１　０００ｍＬ）和 ＷＡ培养
基（琼脂１０ｇ，蒸馏水１　０００ｍＬ）。
图１　苜蓿根腐病症状
Ｆｉｇ．１　Ｓｙｍｐｔｏｍｓ　ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ
１．２　供试杀菌剂
毒力测定中所用的９种杀菌剂分别是：４０％
腈菌唑 ＷＰ（陶氏益农公司）、５０％多菌灵 ＷＰ（镇
江建苏农药化工有限公司）、９９％恶霉灵 ＷＰ（徐州
新鼎业化工材料厂）、４０％菌核净 ＷＰ（浙江斯佩斯
植保有限公司）、嘧环·咯菌腈（３７％嘧菌环胺和
２５％咯菌腈）水分散粒剂（ＷＤＧ）（先正达（苏州）作
物保护有限公司）、５０％福美双 ＷＰ（广州东中迅
农科股份有限公司）、８０％代森锰锌 ＷＰ（先正达
（苏州）作物保护有限公司）、７０％甲基硫菌灵
ＷＰ（中农住商（天津）农用化学品有限公司）、
１０％苯醚甲环唑 ＷＤＧ（先正达（苏州）作物保护
有限公司）。
１．３　方法
１．３．１　苜蓿根腐病病原分离
将发病植株样品用水冲去表面的土壤和砂砾。
将根部发病部位经过初步处理后，将病组织切成
１ｃｍ×１ｃｍ的小块，利用７５％酒精浸泡进行表面
消毒１ｍｉｎ，再利用无菌水清洗３次；然后在５％
ＮａＣｌＯ溶液中浸泡１ｍｉｎ，再利用无菌水冲洗３次。
将处理过的病组织小块放在ＰＤＡ平板上，每平板
放置４～５个，在２５℃霉菌培养箱中培养５ｄ。利用
经过灭菌处理的挖勺挖取病组织小块周围长出的菌
落，用稀释法进行单孢分离，用无菌水将孢子稀释至
每个视野中不超过５个孢子，将稀释好的孢子悬浮
液均匀涂抹在ＰＤＡ平板上，在２５℃霉菌培养箱中
８５
　第６期 阮柳等：苜蓿根腐病的病原分离、鉴定与杀菌剂毒力测定
培养３ｄ。菌落长出后，利用接种针挑至ＰＤＡ平板
上进行扩繁，部分挑至ＰＤＡ斜面上进行培养，并置
于４℃冰箱中保存备用。
１．３．２　致病性测定
将供试菌株在ＰＤＡ上培养５ｄ，用直径为６ｍｍ
的打孔器在菌落边缘打取菌饼，置于１％ ＷＡ培养
皿中央，在２５℃霉菌培养箱中培养３ｄ后，将经过
消毒处理、冲洗干净的２０粒中苜一号种子均匀排列
在带菌 ＷＡ培养基上，在２５℃霉菌培养箱中生长
７ｄ后，调查萌发种子的发病率和严重度，计算病情
指数。每处理３次重复，以不接菌 ＷＡ培养皿上同
样处理的２０粒苜蓿种子作为对照。病害严重度共
分５级［８］，分级标准（图２）为：０级，幼苗健康无病；
１级，幼苗根尖出现黄褐色斑点；２级，幼苗初生根尖
变软、腐烂；３级，幼苗胚根变褐腐烂；４级，种子无法
萌发被菌丝包裹。
　　图中从左到右严重度级别依次为０级、１级、２级、３级和４级。
Ｔｈｅ　ｓｅｖｅｒｉｔｙ　ｌｅｖｅｌｓ　ｆｒｏｍ　ｌｅｆｔ　ｔｏ　ｒｉｇｈｔ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｆｉｇｕｒｅ　ｗｅｒｅ　Ｇｒａｄｅ
０，Ｇｒａｄｅ　１，Ｇｒａｄｅ　２，Ｇｒａｄｅ　３ａｎｄ　Ｇｒａｄｅ　４，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．
图２　致病性测定分级标准
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｓｔａｎｄａｒｄ　ｏｆ
ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
发病率和病情指数的计算公式如下：
发病率＝（发病幼苗数∕种子总数）×１００％
病情指数＝（∑各级发病株数×
病害分级代表值）∕（４×种子总数）×１００
１．３．３　病原形态学鉴定
将病组织分离物分别接种于ＰＤＡ培养基平板
中央，在２５℃霉菌培养箱中培养５ｄ后，观察菌落
形状、背面色素、菌丝形态等，显微观察分生孢子着
生情况、大型分生孢子和小型分生孢子的形态、大型
分生孢子分隔数以及产孢细胞类型，对病原进行形
态学鉴定［２２－２４］。
１．３．４　基于ＩＴＳ引物的病原分子生物学鉴定
采用ＣＴＡＢ法进行病原菌丝基因组ＤＮＡ的提
取。利用通用引物ＩＴＳ４ 和ＩＴＳ５ 进行 ＰＣＲ 扩
增［２５］，ＩＴＳ４ 序 列 为：５′－ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡ－
ＴＡＴＧＣ－３′；ＩＴＳ５序列为：５′－ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴ－
ＣＧＴＡＡＣＡＡＧＧ－３′。
２５μＬ　ＰＣＲ反应体系为：ＩＴＳ４（１０ｐｍｏｌ／μＬ）
１μＬ、ＩＴＳ５（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、Ｔａｇ 酶 ５ Ｕ／μＬ
０．３μＬ、１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｅｒ　２．５μＬ、Ｍｇ
２＋（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）
２μＬ、ｄｄＨ２Ｏ　１５．２μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ、
模板ＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）１μＬ。
ＰＣＲ扩增程序为：预热９５℃，３ｍｉｎ；解螺旋
９４℃，４５ｓ；退火，５４℃，４５ｓ；延伸，７２℃，１ｍｉｎ；解
螺旋、退火、延伸共３５个循环。７２℃，１０ｍｉｎ；４℃
保存。
采用 ＭＥＧＡ　５．１软件进行系统聚类分析，以
Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建系统发育树并分析它们之
间的亲缘关系。
１．３．５　基于延伸因子引物的病原分子生物学鉴定
采用ＣＴＡＢ法进行病原菌丝基因组ＤＮＡ的提
取，利用延伸因子ＥＦ－１Ｈ 和ＥＦ－２Ｔ引物组合进行
目 标 基 因 ＰＣＲ 扩 增［２６］，ＥＦ－１Ｈ 序 列 为：５′－
ＡＴＧＧＧＴＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＡＧＡＣ－３′；ＥＦ－２Ｔ 序列
为：５′－ＧＧＡＡＧＴＡＣＣＡＧＴＧＡＴＣＡＴＧＴＴ－３′。
２５μＬ　ＰＣＲ反应体系为：ＥＦ－１Ｈ（１０ｐｍｏｌ／ｕＬ）
１μＬ、ＥＦ－２Ｔ（１０ｐｍｏｌ／μＬ）１μＬ、Ｔａｇ酶５Ｕ／μＬ
０．３μＬ、１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｅｒ　２．５μＬ、Ｍｇ
２＋（２５ｍｍｏｌ／Ｌ）
２μＬ、ｄｄＨ２Ｏ　１５．２μＬ、ｄＮＴＰ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）２μＬ、
模板ＤＮＡ（５０ｎｇ／μＬ）１μＬ。
ＰＣＲ扩增程序为：预热９４℃，３ｍｉｎ；解螺旋
９４℃，４５ｓ；退火，５５℃，４５ｓ；延伸，７２℃，１ｍｉｎ；解
螺旋、退火、延伸共３５个循环。７２℃，１０ｍｉｎ；４℃
保存。
采用 ＭＥＧＡ　５．１软件以 Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法
构建系统发育树并分析它们之间的亲缘关系。
１．３．６　室内毒力测定
采用含毒介质法进行杀菌剂对所分离病原的室
内毒力测定。在预试验基础上，将选用的９种杀菌
剂均配制成５个浓度，将不同浓度药剂与ＰＤＡ培养
基充分混匀后，配制成不同浓度的待测含药培养基
平板（直径为９ｃｍ），以加入无菌水的ＰＤＡ培养基
作为对照。供试菌种经在ＰＤＡ培养基上复壮后，
置于２５℃霉菌培养箱中保存备用。采用菌饼接种
法，将直径为６ｍｍ 的菌饼放置在不同浓度含药
ＰＤＡ培养基和不含药ＰＤＡ培养基中央。每个处理
重复３次，置于２５℃霉菌培养箱中培养５ｄ，用垂直
十字交叉法测量各培养皿中的菌落直径，取其平均
９５
中 国 农 业 大 学 学 报 ２０１６年 第２１卷　
值，计算抑制率。根据抑制率和浓度对数值，利用软
件ＳＰＳＳ　２０．０获得毒力回归方程以及ＥＣ５０（Ｍｅｄｉａｎ
ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）值，依据ＥＣ５０值比较各种杀
菌剂对供试病原菌株的毒力大小。抑制率的计算公
式如下：
抑制率＝（对照菌落直径－处理菌落直径）／
（对照菌落直径－菌饼直径）×１００％
２　结果与分析
２．１　病原分离、致病性测定和鉴定结果
从发病组织样品上获得的分离物经致病性测
定，得到７１株致病菌，对其进行形态学鉴定，并分别
以ＩＴＳ４和ＩＴＳ５、ＥＦ－１Ｈ 和ＥＦ－２Ｔ作为引物进行
ＤＮＡ　ＰＣＲ扩增、产物测序和比对鉴定，形态学鉴定
和分子生物学鉴定结果一致，７１株均为镰孢菌属
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ），其中，木贼镰孢有５５株，尖孢镰孢有７
株，层出镰孢（Ｆ．ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｕｍ）有６株，变红镰孢
（Ｆ．ｉｎｃａｒｎａｔｕｍ）有２株，茄镰孢有１株。所分离菌
株中致病性较强的菌株接种处理的种子的发病率和
病情指数如表１所示。由表１可知，尖孢镰孢菌株
Ｄ１９－２、层出镰孢菌株Ｓ４５和茄镰孢菌株Ｑ１的致病
性最强。
表１　强致病性菌株处理的苜蓿种子发病率和病情指数
Ｔａｂｌｅ　１　Ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｄｅｘ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｄｉｓｅａｓｅ　ｃａｕｓｅｄ　ｂｙ　ｓｔｒｏｎｇ　ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　ｓｔｒａｉｎｓ
菌株编号
Ｓｔｒａｉｎｓ
发病率／％
Ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ
病情指数
Ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｄｅｘ
菌株编号
Ｓｔｒａｉｎｓ
发病率／％
Ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ
病情指数
Ｄｉｓｅａｓｅ　ｉｎｄｅｘ
Ｄ１９－２　 １００　 ７４．５８ Ｄ３０　 １００　 ６８．３３
Ｓ４５　 １００　 ７３．３３ Ｓ３９－１　 １００　 ６７．９２
Ｑ１　 １００　 ７３．３３ Ｄ４９　 １００　 ６７．５０
Ｓ４６　 ９８．３３　 ７０．８３ Ｄ１４－２　 ９８．３３　 ６６．２５
Ｓ４９－１　 ９６．６７　 ６９．５８ Ｓ３３－１　 ９６．６７　 ６５．４２
Ｄ２７－２　 ９８．３３　 ６９．１７ Ｄ１２　 ９８．３３　 ６１．６７
　　强致病性菌株Ｄ１９－２在ＰＤＡ培养基上（２５℃
霉菌培养箱中）培养５ｄ后菌落直径为６０．７～
６６．０ｍｍ，气生菌丝繁茂，初期为白色，后变为红色。
小型分生孢子数量多，圆形，大小为５．０～１０．０μｍ×
１．５～３．０μｍ。大型分生孢子少见。产孢细胞较
短，一般为单瓶梗，在菌丝上分散生长。菌落和病原
形态见图３。依据形态学特征，将菌株Ｄ１９－２鉴定
为尖孢镰孢。
图３　菌株Ｄ１９－２形态学鉴定
Ｆｉｇ．３　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　Ｄ１９－２
　　强致病性菌株Ｓ４５在ＰＤＡ 培养基上呈絮状生
长，菌落背面初期为白色，后变为橙红色。在ＰＤＡ
培养基（２５℃霉菌培养箱中）上培养５ｄ后菌落直
径为３９．２～４２．５ｍｍ，气生菌丝发达。在菌落表
面，肉眼可见菌丝颜色从菌落中央到菌落边缘有分
层现象。小型分生孢子以链状着生，大小为５．０～
０６
　第６期 阮柳等：苜蓿根腐病的病原分离、鉴定与杀菌剂毒力测定
１０．５μｍ ×１．０～２．５μｍ。大型分生孢子镰孢状，
稍有弯曲，一般具有２～５个隔膜。菌落和病原形态
见图４。依据形态学特征，将菌株Ｓ４５鉴定为层出
镰孢。
图４　菌株Ｓ４５形态学鉴定
Ｆｉｇ．４　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ４５
　　强致病性菌株 Ｑ１在ＰＤＡ培养基上（２５℃霉
菌培养箱中）培养 ５ｄ 后菌落直径为 ５９．３～
６１．５ｍｍ，菌落背面呈紫红色，菌丝稀疏。小型分生
孢子形成在单瓶梗上，头状聚生，单胞或双胞，卵形
或椭圆形，大小为４．０～１０．０μｍ ×１．０～２．５μｍ。
在ＰＤＡ培养基上培养２～３周，可产生大量厚垣孢
子。菌落和病原形态见图５。依据形态学特征，将
菌株Ｑ１鉴定为茄镰孢。
图５　菌株Ｑ１形态学鉴定
Ｆｉｇ．５　Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｓｔｒａｉｎ　Ｑ１
　　菌株Ｄ１９－２、Ｓ４５和Ｑ１经提取ＤＮＡ，分别利用
ＩＴＳ和延伸因子引物进行ＰＣＲ扩增测序后，利用
Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ法构建的系统发育树如图６和７
所示。由图６和７可见，菌株Ｄ１９－２与ＧｅｎＢａｎｋ中
尖孢镰孢的同源性最高，菌株Ｓ４５与ＧｅｎＢａｎｋ中层
出镰孢的同源性最高，菌株Ｑ１与ＧｅｎＢａｎｋ中茄镰
孢的同源性最高，因此，将菌株Ｄ１９－２、Ｓ４５、Ｑ１分别
鉴定为尖孢镰孢、层出镰孢、茄镰孢。分子生物学鉴
定结果和形态学鉴定结果一致。
２．２　杀菌剂对病原的室内毒力测定
不同杀菌剂对强致病性菌株Ｄ１９－２、Ｓ４５和 Ｑ１
的室内毒力测定结果如表２～５所示。
对于菌株Ｄ１９－２，由表２可知，９９％恶霉灵 ＷＰ
浓度为 ４０ ｍｇ／Ｌ 时，菌丝生长抑制率最高，为
９０．６３％；５０％福美双 ＷＰ浓度为１ｍｇ／Ｌ时，菌丝
生长抑制率最低，为１０．７１％。８０％代森锰锌 ＷＰ
的菌丝生长抑制效果最差。由表３可知，以ＥＣ５０值
为标准，杀菌剂对菌株Ｄ１９－２的毒力由大到小依次
为嘧环·咯菌腈 ＷＤＧ、５０％多菌灵 ＷＰ、１０％苯醚
甲环唑 ＷＤＧ、７０％甲基硫菌灵 ＷＰ、４０％腈菌唑
ＷＰ、５０％福美双 ＷＰ、９９％恶霉灵 ＷＰ、４０％菌核净
ＷＰ、８０％代森锰锌 ＷＰ。各杀菌剂间的毒力大小差
异比较明显。嘧环·咯菌腈 ＷＤＧ的ＥＣ５０值最小，
为０．０４ｍｇ／Ｌ；８０％代森锰锌 ＷＰ的ＥＣ５０值最大，
为６０．８６ｍｇ／Ｌ。结果表明，嘧环·咯菌腈 ＷＤＧ、
５０％多菌灵 ＷＰ、１０％苯醚甲环唑 ＷＤＧ、７０％甲基
硫菌灵 ＷＰ、４０％腈菌唑 ＷＰ对菌株Ｄ１９－２菌丝生
长抑制效果较好。
１６
中 国 农 业 大 学 学 报 ２０１６年 第２１卷　
图６　基于ＩＴＳ的系统发育树
Ｆｉｇ．６　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＩＴＳ４ａｎｄ　ＩＴＳ５ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
图７　基于延伸因子的系统发育树
Ｆｉｇ．７　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＥＦ－１Ｈａｎｄ　ＥＦ－２Ｔｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
２６
　第６期 阮柳等：苜蓿根腐病的病原分离、鉴定与杀菌剂毒力测定
表２　不同杀菌剂对菌株Ｄ１９－２、Ｓ４５和Ｑ１菌丝生长的抑制效果
Ｔａｂｌｅ　２　Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ　ｏｎ　ｍｙｃｅｌｉａ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓｔｒａｉｎｓ　Ｄ１９－２，Ｓ４５ａｎｄ　Ｑ１
杀菌剂
Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ
菌株Ｄ１９－２Ｓｔｒａｉｎ　Ｄ１９－２ 菌株Ｓ４５Ｓｔｒａｉｎ　Ｓ４５ 菌株Ｑ１Ｓｔｒａｉｎ　Ｑ１
质量浓度／
（ｍｇ／Ｌ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
菌丝抑制
生长率／％
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
ｏｆ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ
质量浓度／
（ｍｇ／Ｌ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
菌丝抑制
生长率／％
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
ｏｆ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ
质量浓度／
（ｍｇ／Ｌ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
菌丝抑制
生长率／％
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
ｏｆ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ
０．１　 ４４．２１ａ ０．１　 ４２．２６ａ ０．１　 ４２．５５ａ
０．５　 ４７．５６ｂ １．０　 ５３．４９ｂ １０．０　 ７６．１１ｂ
１０％苯醚甲环唑 ＷＤＧ　 ５．０　 ６３．４３ｃ ５０．０　 ７９．３７ｃ ５０．０　 ８４．４３ｃ
１００．０　 ８０．０７ｄ １００．０　 ８０．９１ｃ １００．０　 ８５．４７ｄ
２００．０　 ８４．４６ｅ ２００．０　 ８５．９３ｄ ２００．０　 ９０．０５ｅ
１０　 ４０．４２ａ １　 １０．８８ａ １　 ５．４５ａ
１００　 ５２．６９ｂ １０　 ３５．７６ｂ １０　 １４．５３ｂ
８０％代森锰锌 ＷＰ　 ２００　 ５５．０２ｂ ５０　 ５５．２３ｃ １００　 ３２．４３ｃ
３００　 ６０．６３ｃ １００　 ６０．８０ｃ ２００　 ３４．４３ｃ
８００　 ６２．４４ｃ ５００　 ７３．３８ｄ ３００　 ３７．７７ｃ
０．０５　 １９．９５ａ ０．０５　 １２．０４ａ ０．１０　 ２２．２０ａ
０．１０　 ３０．５９ｂ ０．１０　 ２０．２０ａ ０．５０　 ６１．７６ｂ
５０％多菌灵 ＷＰ　 ０．５０　 ４７．６０ｃ ０．５０　 ４３．１０ｂ １．００　 ６８．２１ｃ
１．００　 ６８．５１ｄ ３．００　 ６６．１２ｃ ２．００　 ７９．７０ｄ
３．００　 ８６．０６ｅ ５．００　 ７６．５９ｄ ３．００　 ８５．８５ｅ
１　 １０．７１ａ ５　 ５４．５９ａ １　 ５．００ａ
５　 ４４．７０ｂ １０　 ６２．４２ｂ ５　 ３８．０６ｂ
５０％福美双 ＷＰ　 １０　 ５１．７９ｃ ５０　 ７１．２２ｃ ５０　 ７０．７７ｃ
５０　 ７２．４３ｄ １００　 ７４．５８ｃ １００　 ７７．３２ｄ
１００　 ８３．６４ｅ ２００　 ７５．３６ｃ ２００　 ８８．１４ｅ
１　 １６．８３ａ １　 １３．８６ａ １　 ９．５０ａ
３　 ４６．９０ｂ ５　 ４０．０１ｂ ３　 ３０．９２ｂ
７０％甲基硫菌灵 ＷＰ　 ５　 ５４．８１ｃ １０　 ５４．９７ｃ ８　 ６１．６６ｃ
１０　 ６９．５８ｄ １００　 ８２．３６ｄ １０　 ６１．５０ｃ
４０　 ８３．５９ｅ ２００　 ８７．８０ｄ ５０　 ８４．６０ｄ
１　 １９．７９ａ １　 ３３．６０ａ １　 ２３．８７ａ
５０　 ７８．１０ｂ ５０　 ８４．８２ｂ ５　 ３８．８１ｂ
４０％腈菌唑 ＷＰ　 ８０　 ８４．２９ｃ ８０　 ８４．９８ｂ ５０　 ６３．８５ｃ
１００　 ８４．９２ｃ １００　 ８６．６３ｃ ８０　 ８０．６８ｄ
２００　 ８８．１８ｃ ２００　 ９３．９７ｃ ２００　 ９１．２４ｅ
３６
中 国 农 业 大 学 学 报 ２０１６年 第２１卷　
表２（续）
杀菌剂
Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ
菌株Ｄ１９－２Ｓｔｒａｉｎ　Ｄ１９－２ 菌株Ｓ４５Ｓｔｒａｉｎ　Ｓ４５ 菌株Ｑ１Ｓｔｒａｉｎ　Ｑ１
质量浓度／
（ｍｇ／Ｌ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
菌丝抑制
生长率／％
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
ｏｆ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ
质量浓度／
（ｍｇ／Ｌ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
菌丝抑制
生长率／％
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
ｏｆ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ
质量浓度／
（ｍｇ／Ｌ）
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ
菌丝抑制
生长率／％
Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ　ｒａｔｅ
ｏｆ　ｍｙｃｅｌｉｕｍ
５　 １７．４５ａ ５　 ７．２５ａ ５　 １９．８１ａ
１０　 ２９．３９ｂ ８　 ２９．５６ｂ １０　 ３１．７４ｂ
４０％菌核净 ＷＰ　 ２０　 ５５．００ｃ ５０　 ７５．２９ｃ ２０　 ４０．７３ｃ
３０　 ６４．６５ｄ １００　 ８５．８８ｄ １００　 ９０．７９ｄ
１００　 ８９．１４ｅ ２００　 ９２．１５ｅ ２００　 ９３．２３ｄ
５　 ６６．０９ａ １０　 ６６．０９ｂ １０　 ５０．９２ａ
１０　 ６５．８６ａ ３０　 ６３．２４ａ １００　 ５９．８１ｂ
嘧环·咯菌腈 ＷＤＧ　 ３０　 ６９．６０ｂ ５０　 ６４．３９ａｂ　 ３００　 ６１．４４ｂ
１００　 ７４．２４ｃ １００　 ６９．１４ｃ ５００　 ６３．８４ｂｃ
３００　 ７７．２０ｄ ２００　 ７２．０４ｄ １　０００　 ６７．５１ｃ
５　 １８．０５ａ ５　 ２９．５３ａ ５　 １８．０８ａ
８　 ３５．５３ｂ ８　 ４１．３７ｂ ８　 ３０．４６ｂ
９９％恶霉灵 ＷＰ　 １０　 ４４．１７ｃ １０　 ５４．８２ｃ １０　 ５２．９５ｃ
３０　 ７４．５４ｄ ３０　 ６９．１４ｄ ２０　 ６７．８１ｄ
４０　 ９０．６３ｅ ４０　 ８０．０４ｅ ４０　 ８８．８３ｅ
　　注：对于同一杀菌剂，不同小写字母表示不同浓度对同一菌株的抑制效果在０．０５水平上存在显著差异。
Ｎｏｔｅ：Ｆｏｒ　ｅａｃｈ　ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ，ｔｈｅ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｍｅａｎ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ａｔ　０．０５ｌｅｖｅｌ　ａｍｏｎｇ　ｔｈｅ　ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ　ｅｆｆｅｃｔｓ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ　ｏｎ　ｍｙｃｅｌｉａ　ｇｒｏｗｔｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｓａｍｅ　ｓｔｒａｉｎ．
　　对于菌株Ｓ４５，由表２可见，不同浓度杀菌剂对
其菌丝生长均有一定抑制作用，随着ＰＤＡ培养基
含有杀菌剂浓度增大，菌丝生长抑制率也逐渐增大。
８０％代森锰锌 ＷＰ的抑制效果最差。由表４可见，
以ＥＣ５０值为标准，杀菌剂对菌株Ｓ４５的毒力由大到
小依次为１０％苯醚甲环唑 ＷＤＧ、５０％多菌灵 ＷＰ、
５０％福美双 ＷＰ、嘧环·咯菌腈 ＷＤＧ、４０％腈菌唑
ＷＰ、７０％甲基硫菌灵 ＷＰ、９９％恶霉灵 ＷＰ、４０％菌
核净 ＷＰ、８０％代森锰锌 ＷＰ。１０％苯醚甲环唑
ＷＤＧ的ＥＣ５０最小，为０．４４ｍｇ／Ｌ；其次是５０％多菌
灵 ＷＰ的ＥＣ５０，为０．８２ｍｇ／Ｌ，表明菌株Ｓ４５对这２
种杀菌剂最为敏感。８０％代森锰锌 ＷＰ的ＥＣ５０最
大，说明菌株Ｓ４５对该杀菌剂敏感性最小。
对于菌株Ｑ１，由表２可知，９种杀菌剂对其菌
丝生长的抑制作用均随浓度增大而增大。４０％菌核
净浓度为２００ｍｇ／Ｌ时，菌丝生长抑制率最大，为
９３．２３％；８０％代森锰锌 ＷＰ浓度为１ｍｇ／Ｌ时，菌
丝生长抑制率最小，为５．４５％。由表５可知，９种杀
菌剂对菌株Ｑ１的ＥＣ５０值之间差异比较明显，８０％
代森锰锌 ＷＰ的ＥＣ５０最大，为２　５８３．１０ｍｇ／Ｌ；１０％
苯醚甲环唑 ＷＤＧ的ＥＣ５０最小，为０．２６ｍｇ／Ｌ。９
种杀菌剂的ＥＣ５０值从小到大依次为１０％苯醚甲环唑
ＷＤＧ、５０％多菌灵 ＷＰ、７０％甲基硫菌灵 ＷＰ、嘧环·
咯菌腈 ＷＤＧ、４０％腈菌唑 ＷＰ、９９％恶霉灵 ＷＰ、５０％
福美双 ＷＰ、４０％菌核净 ＷＰ、８０％代森锰锌 ＷＰ，前５
种杀菌剂对菌株Ｑ１菌丝生长具有较好抑制效果。
在实际生产中，土壤中存在的大多是镰孢菌菌
群，由单一种类镰孢菌引起苜蓿根腐病的情况较少。
因此，防治苜蓿根腐病所用的杀菌剂最好对多种镰
孢菌均有良好抑制效果。综合比较各杀菌剂对病原
毒力测定结果，１０％苯醚甲环唑 ＷＤＧ、５０％多菌灵
ＷＰ、５０％福美双 ＷＰ、嘧环·咯菌腈 ＷＤＧ、４０％腈
菌唑 ＷＰ、７０％甲基硫菌灵 ＷＰ等６种杀菌剂可作
为推荐使用的防治苜蓿根腐病的杀菌剂。
４６
　第６期 阮柳等：苜蓿根腐病的病原分离、鉴定与杀菌剂毒力测定
表３　不同杀菌剂对菌株Ｄ１９－２的毒力
Ｔａｂｌｅ　３　Ｔｈｅ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ　ｏｎ　ｓｔｒａｉｎ　Ｄ１９－２
杀菌剂
Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ
毒力回归方程
Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ
相关系数ｒ
Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｒ
ＥＣ５０／ｍｇ／Ｌ
１０％苯醚甲环唑 ＷＤＧ　 ｙ＝０．１２８ｘ＋０．７１１　 ０．９９４　 ０．４５
８０％代森锰锌 ＷＰ　 ｙ＝０．１２０ｘ＋０．４４２　 ０．９８７　 ６０．８６
５０％多菌灵 ＷＰ　 ｙ＝０．１６１ｘ＋１．７７１　 ０．９８８　 ０．３７
５０％福美双 ＷＰ　 ｙ＝０．３５０ｘ＋０．６０４　 ０．９９１　 １０．０９
７０％甲基硫菌灵 ＷＰ　 ｙ＝０．４４９ｘ＋０．８００　 ０．９８６　 ４．２９
４０％腈菌唑 ＷＰ　 ｙ＝０．３１５ｘ＋０．６２３　 ０．９９２　 ８．１４
４０％菌核净 ＷＰ　 ｙ＝０．５７３ｘ＋０．５１４　 ０．９９２　 １８．８２
嘧环·咯菌腈 ＷＤＧ　 ｙ＝０．０７０ｘ＋０．６９２　 ０．９７８　 ０．０４
９９％恶霉灵 ＷＰ　 ｙ＝０．７５９ｘ＋０．６５２　 ０．９９６　 １２．６１
表４　不同杀菌剂对菌株Ｓ４５的毒力
Ｔａｂｌｅ　４　Ｔｈｅ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ　ｏｎ　ｓｔｒａｉｎ　Ｓ４５
杀菌剂
Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ
毒力回归方程
Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ
相关系数ｒ
Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｒ
ＥＣ５０／ｍｇ／Ｌ
１０％苯醚甲环唑 ＷＤＧ　 ｙ＝０．１３５ｘ＋０．７２４　 ０．９９８　 ０．４４
８０％代森锰锌 ＷＰ　 ｙ＝０．２３７ｘ＋０．４３０　 ０．９９６　 ３９．４８
５０％多菌灵 ＷＰ　 ｙ＝０．３１８ｘ＋０．９４１　 ０．９９９　 ０．８２
５０％福美双 ＷＰ　 ｙ＝０．１４２ｘ＋０．６５４　 ０．９６９　 １．６５
７０％甲基硫菌灵 ＷＰ　 ｙ＝０．３２１ｘ＋０．５９０　 ０．９９３　 １０．４９
４０％腈菌唑 ＷＰ　 ｙ＝０．２８１ｘ＋０．６８３　 ０．９９３　 ４．４６
４０％菌核净 ＷＰ　 ｙ＝０．５３３ｘ＋０．４６５　 ０．９８３　 ２３．２６
嘧环·咯菌腈 ＷＤＧ　 ｙ＝０．１１３ｘ＋０．６０８　 ０．９９５　 ２．２１
９９％恶霉灵 ＷＰ　 ｙ＝０．５１６ｘ＋０．６３５　 ０．９７８　 １０．９５
表５　不同杀菌剂对菌株Ｑ１的毒力
Ｔａｂｌｅ　５　Ｔｈｅ　ｔｏｘｉｃｉｔｙ　ｏｆ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｆｕｎｇｉｃｉｄｅｓ　ｏｎ　ｓｔｒａｉｎ　Ｑ１
杀菌剂
Ｆｕｎｇｉｃｉｄｅ
毒力回归方程
Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ　ｅｑｕａｔｉｏｎ
相关系数ｒ
Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｒ
ＥＣ５０／ｍｇ／Ｌ
１０％苯醚甲环唑 ＷＤＧ　 ｙ＝０．１４４ｘ＋０．７７２　 ０．９９３　 ０．２６
８０％代森锰锌 ＷＰ　 ｙ＝０．１３５ｘ＋０．２１５　 ０．９９２　 ２　５８３．１０
５０％多菌灵 ＷＰ　 ｙ＝０．４２４ｘ＋１．２３１　 ０．９８８　 ０．３８
５０％福美双 ＷＰ　 ｙ＝０．３５２ｘ＋０．５４５　 ０．９８５　 １４．９０
７０％甲基硫菌灵 ＷＰ　 ｙ＝０．４５７ｘ＋０．７１８　 ０．９８２　 ６．６７
４０％腈菌唑 ＷＰ　 ｙ＝０．２９４ｘ＋０．５９１　 ０．９８６　 ９．８１
４０％菌核净 ＷＰ　 ｙ＝０．５０３ｘ＋０．４７３　 ０．９８５　 ２２．６３
嘧环·咯菌腈 ＷＤＧ　 ｙ＝０．０７８ｘ＋０．５３４　 ０．９８９　 ７．３３
９９％恶霉灵 ＷＰ　 ｙ＝０．７８５ｘ＋０．６７３　 ０．９８０　 １２．０４
５６
中 国 农 业 大 学 学 报 ２０１６年 第２１卷　
３　结论与讨论
本研究从苜蓿根腐病病组织上共分离到具有致
病性的７１株镰孢菌，形态学鉴定结果与基于ＩＴＳ
和延伸因子的分子生物学鉴定结果一致，致病性较
强的为尖孢镰孢菌株Ｄ１９－２、层出镰孢菌株Ｓ４５、茄
镰孢菌株Ｑ１，并且进行了９种杀菌剂对分离病原的
室内毒力测定。本研究结果有助于了解河北苜蓿根
腐病的病原种类，为指导该病害的防治提供了依据。
苜蓿是多年生植物，苜蓿根腐病的致病菌种类
较多，除镰孢菌（Ｆｕｓａｒｉｕｍｓｐｐ．）外，还有腐霉菌
（Ｐｙｔｈｉｕｍｓｐｐ．）、疫霉菌（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｓｐｐ．）和丝
核菌（Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａｓｐｐ．）等病原物［１－１２，２７－２８］。在不同
地区，苜蓿根腐病病原种类并不相同［１－３］，对于不同
苜蓿品种，根腐病病原也不相同［１２］，甚至在不同季
节，致病菌镰孢菌的种群亦有较大差异［８］。本研究
在河北省沧州市黄骅所采集的苜蓿根腐病病组织上
分离获得的致病菌只有镰孢菌，并且其表现出的致
病性差异明显。本研究除分离到镰孢菌，还分离到
一些其他微生物，如链格孢菌（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａｓｐｐ．）等，
根据文献报道，研究中只对镰孢菌和链格孢菌进行
了致病性测定，排除了其他微生物。致病性测定结
果表明只有７１株镰孢菌具有致病性。本研究在进
行病原分离时，由于仅选用了ＰＤＡ培养基，并且培
养５ｄ后进行单孢分离，从而可能造成忽视其他生
长慢、不易产孢的菌株，并且也可能造成忽视不能在
ＰＤＡ培养基培养的病原。在今后的研究中，应该对
所用病原分离方法进行改进，尽可能保证分离获得
应有的病原。
已有研究报道不同杀菌剂对苜蓿根腐病不同病
原的抑制作用有较大差异［６，２１］，给生产上选用杀菌
剂带来了困难。本研究结果亦表明不同杀菌剂对分
离菌株的抑制效果存在差异，１０％苯醚甲环唑
ＷＤＧ、５０％多菌灵 ＷＰ、５０％福美双 ＷＰ、嘧环·咯
菌腈 ＷＤＧ、４０％腈菌唑 ＷＰ、７０％甲基硫菌灵 ＷＰ
等６种杀菌剂对苜蓿根腐病３个强致病性菌株室内
毒力测定的表现较好。
实际生产中，苜蓿根腐病的发生情况可能比较
复杂，会存在复合侵染。针对苜蓿根腐病，应该采取
综合防治措施，选育和合理选用抗病品种，合理施
肥，增施磷、钾肥，提高苜蓿对根腐病的抗性，使用种
衣剂包衣处理和定植后合理选用药剂进行防治。苜
蓿根腐病的病原物种类较多，广谱性杀菌剂用于土
壤处理时更有利于减轻病害发生。另外，适当选择
一些非寄主植物进行混播或轮作，避免单一品种大
面积种植，也是减轻苜蓿根腐病的有效途径［２９］。
致谢　感谢中国农业科学院北京畜牧兽医研究
所袁庆华研究员、王瑜老师和苗丽宏老师在研究中
给予的大力支持和帮助。
参　考　文　献
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［２２］Ｂｏｏｔｈ　Ｃ．Ｔｈｅ　Ｇｅｎｕｓ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ ［Ｍ］．Ｋｅｗ：Ｃｏｍｍｏｎｗｅａｌｔｈ
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［２４］王拱辰，郑重，叶琪明，章初龙．常见镰刀菌鉴定指南［Ｍ］．北
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Ｗａｎｇ　Ｇ　Ｃ，Ｚｈｅｎｇ　Ｚ，Ｙｅ　Ｑ　Ｍ，Ｚｈａｎｇ　Ｃ　Ｌ．Ｇｕｉｄｅ　ｔｏ
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｏｍｍｏｎ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ　Ｓｐｅｃｉｅｓ［Ｍ］．Ｂｅｉｊｉｎｇ：
Ｃｈｉｎａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｐｒｅｓｓ，１９９６ （ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ）
［２５］Ｗｈｉｔｅ　Ｔ　Ｊ，Ｂｒｕｎｓ　Ｔ，Ｌｅｅ　Ｓ，Ｔａｙｌｏｒ　Ｊ．Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｄｉｒｅｃｔ
ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｏｆ　ｆｕｎｇａｌ　ｒｉｂｏｓｏｍａｌ　ＲＮＡ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｓ
［Ｃ］／／Ｉｎｎｉｓ　Ｍ　Ａ，Ｇｅｌｆａｎｄ　Ｄ　Ｈ，Ｓｎｉｎｓｋｙ　Ｊ　Ｊ，Ｗｈｉｔｅ　Ｔ　Ｊ，Ｅｄｓ．
ＰＣＲ　ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ　ｇｕｉｄｅ　ｔｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｌｏｎｄｏｎ：
Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ，１９９０：３１５－３２２
［２６］Ｌｅｓｌｉｅ　Ｊ　Ｆ，Ｓｕｍｍｅｒｅｌ　Ｂ　Ａ，Ｂｕｌｏｃｋ　Ｓ．Ｔｈｅ　Ｆｕｓａｒｉｕｍ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ［Ｍ］．Ａｍｅｓ，Ｉｏｗａ：Ｂｌａｃｋｗｅｌ　Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ
Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ，２００６
［２７］Ｇｒａｙ　Ｆ　Ａ，Ｂｏｈｌ　Ｗ　Ｈ，Ａｂｅｒｎｅｔｈｙ　Ｒ　Ｈ．Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ　ｒｏｏｔ　ｒｏｔ
ｏｆ　ａｌｆａｌｆａ　ｉｎ　Ｗｙｏｍｉｎｇ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ，１９８３，６７（３）：２９１－２９４
［２８］Ｍｕｎｋｖｏｌｄ　Ｇ　Ｐ，Ｃａｒｌｔｏｎ　Ｗ　Ｍ．Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ　ａｎｄ　ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ　ｏｆ
Ａｐｈａｎｏｍｙｃｅｓ　ｅｕｔｅｉｃｈｅｓ　ａｎｄ　Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｒａ　ｍｅｄｉｃａｇｉｎｉｓ　ｉｎ　Ｉｏｗａ
ａｌｆａｌｆａ　ｆｉｅｌｄｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ，１９９５，７９（１２）：１２５１－１２５３
［２９］王雪薇，王纯利，周刚，黄常福，徐灵芝，王冬梅．新疆阿勒泰新
垦区苜蓿病害调查与分析［Ｊ］．新疆农业大学学报，１９９６，１９
（３）：４０－４４
Ｗａｎｇ　Ｘ　Ｗ，Ｗａｎｇ　Ｃ　Ｌ，Ｚｈｏｕ　Ｇ，Ｈｕａｎｇ　Ｃ　Ｆ，Ｘｕ　Ｌ　Ｚ，Ｗａｎｇ　Ｄ
Ｍ．Ｉｎｖｅｓｔｉｖａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｎ　ｌｕｃｅｒｎｅ　ｄｉｓｅａｓｅｓ　ｆｒｏｍ　Ａｌｔａｙ
ｎｅｗｌｙ－ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ　ａｒｅａｓ　ｉｎ　Ｎｏｒｔｈｅｒｎ　Ｘｉｎｊｉａｎｇ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｘｉｎｊｉａｎｇ　Ａｇｒｉｃｕｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，１９９６，１９（３）：４０－４４ （ｉｎ
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责任编辑：王燕华
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