全 文 ：响应面法优化柿叶总黄酮的超声波辅助提取条件
贾娜，李晓崴，宋立，邵俊花，赵莹莹，戚军，刘登勇*
（渤海大学食品科学研究院，辽宁省食品安全重点实验室，辽宁锦州 121013）
摘 要：利用响应面法（Response surface methodology，RSM）优化柿叶总黄酮的超声波辅助提取条件。以提取温度、
乙醇体积分数、液固比、提取时间为试验因子，以柿叶提取物中总黄酮含量为响应值，采用 Box-Behnken 试验设计进
行试验。结果表明，提取温度对总黄酮含量影响最大，其次为液固比、乙醇体积分数和提取时间。柿叶总黄酮的最佳
超声波辅助提取条件为：温度 53℃、乙醇体积分数 69%、液固比 21∶1、提取时间 32min。在此条件下，柿叶提取物总黄
酮含量的预测值为 35.05mg/g，验证试验所得总黄酮的含量为 35.36mg/g。回归方程的预测值和试验值差异不显著，
所得回归模型拟合情况良好，达到设计要求。因此，超声波辅助提取法能提高提取效率、缩短提取时间和保护有效成
分，具有一定的实际应用价值。
关键词：柿叶；黄酮；超声波；提取；响应面
中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1674-506X（2013）06-0001-0006
Optimization of Ultrasonic-assisted Extraction of Flavonoids from
Persimmon Leaf by Response Surface Methodology
JIA Na， LI Xiao-wei， SONG Li， SHAO Jun-hua， ZHAO Ying-ying， QI Jun， LIU Deng-yong*
（Food Science Research Institute of Bohai University，Food Safety Key Lab of Liaoning Province，
Jinzhou Liaoning 121013，China）
Abstract： Response surface methodology （RSM） was used to optimize the experimental conditions for ultrasonic-
assisted extraction of flavonoids from persimmon leaf. Box-Behnken design was employed to optimize four extraction
variables including extraction temperature， ethanol concentration， ratio of aqueous ethanol to persimmon leaf and
extraction time. The flavonoids content of persimmon leaf extract was the evaluation index. The results showed that
the extraction temperature displayed the max impact on flavonoids content and followed by the ratio of aqueous
ethanol to persimmon leaf， ethanol concentration and extraction time. The optimized conditions were: temperature
53℃， ethanol concentration 69%， ratio of aqueous ethanol to persimmon leaf 21 ∶1， extraction time 32min. Under
the optimal conditions， the predicted flavonoids content of persimmon leaf extract was 35.05mg/g， while the
experimental flavonoids content of persimmon leaf extract was 35.36mg/g. The RSM -predicted yield and the
experimental flavonoids content of persimmon leaf extract were not significantly different from each other. The results
showed that the empirical model developed by RSM was adequate to describe the relationships between the factors
and response values. The ultrasonic-assisted extraction method could improve the extraction efficiency， shorten the
extraction time and protect the bioactive compounds and possess the practical application value.
Key words： persimmon leaf； flavonoids； ultrasonic； extraction； response surface methodology
doi：10.3969/j.issn.1674-506X.2013.06-001
收稿日期：2013-11-06
基金项目：国家自然科学基金（31301509）。
作者简介：贾娜（1982-），女，博士，讲师。研究方向：肉品加工与质量控制、天然产物抗氧化。
* 通讯作者：刘登勇（1979-），男，博士，副教授。研究方向：肉品加工与质量安全控制。
Food and Fermentation Technology
第 49卷（第 6期） Vol.49，No.6
2013 年第 6 期
柿叶是天然活性物质的良好来源， 富含 Vc、芦
丁、胆碱、黄酮苷、胡萝卜素、鞣质、酚类、挥发油和有
机酸等多种对人体健康有益的成分。 柿叶中的黄酮
类化合物有保护脑血管系统、降脂、抗血栓、抗氧化、
止血等作用［1］。动物实验研究发现，柿叶黄酮能够降
低高脂血症大鼠血脂水平，改善血管内皮功能 ［2］，并
且对高脂血症大鼠的脂质代谢紊乱有显著的调节作
用，对防治高脂性脂肪肝有良好的作用 ［3］。此外，柿
叶黄酮还能显著降低小鼠动脉粥样硬化的形成，具
有抗氧化功能［4］。可见，柿叶黄酮具有良好的开发和
应用前景。
传统的柿叶黄酮的提取途径主要为混合溶剂浸
提法，存在提取时间长、提取效率低的问题，而超声
辅助提取法具有提取时间短、溶剂用量少、提取效率
高等优点， 且可避免因热效应引起的有效成分的结
构变化和损失。在国外，超声波法早已应用于生物活
性成分的提取 ［5］。近年来也有很多应用超声波辅助
提取植物中活性成分的研究， 如提取黄连根茎中的
植物碱、 提取黑莓叶中的抗氧化成分以及提取葛根
素和荔枝多糖［6-9］。
目前， 国内也有关于利用超声波辅助法提取
柿叶总黄酮的研究 ［10-12］，但尚未有利用响应面法
对超声波辅助提取条件进行进一步优化的研究 。
本研究首先采用超声法对柿叶总黄酮进行提取 ，
主要研究温度、乙醇体积分数、液固比、提取时间
对总黄酮含量的影响， 然后在单因素试验的基础
上， 采用响应面法对超声波辅助提取条件进行优
化，确定柿叶总黄酮的最适提取条件，以进一步提
高柿叶总黄酮得率。 本研究旨在为实际生产过程
中提高柿叶总黄酮产量、 节约成本提供一定的理
论和应用指导。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
干柿叶，购于中药店（2012 年采摘）；芦丁标准
品，国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇、石油醚、
氢氧化钠、 亚硝酸钠、 硝酸铝等试剂均为国产分析
纯。
FW100 型高速万能粉碎机，天津市泰斯特仪器
有限公司；BS224S 型电子天平，北京利多斯仪器系
统有限公司；CS101-2A 型电热鼓风干燥箱，中国重
庆银河试验仪器有限公司； SP-752（PC）型紫外可
见分光光度计 ， 上海光谱仪器仪器有限公司 ；
SK8210LHC 超声清洗仪， 上海科导超声仪器厂；真
空冷冻干燥机，北京普析通用仪器有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 单因素试验
干柿叶粉碎，过 40 目筛，所得柿叶粉用于总黄
酮的提取。 准确称取 10g柿叶粉， 加入体积分数为
20-100%的乙醇溶液进行超声波辅助提取， 超声波
处理功率为 200W，液固比为 5∶1-30∶1，提取温度为
20-80℃，提取时间为 10-60min，提取结束后，真空
抽滤，所得提取液用于测定总黄酮含量。
1.2.2 柿叶提取物总黄酮含量的测定
首先绘制芦丁标准曲线，参照郭雷等的方法［13］，
准确称取干燥至恒重的芦丁标准品 10mg，用 50%乙
醇溶解并定容至 50mL， 得到浓度为 0.2mg/mL 的芦
丁标准溶液。 准确吸取芦丁标准溶液 0mL，0.5mL，
1.0mL，1.25mL，1.5mL，2.0mL 于试管中，用 50%乙醇
溶液补充体积至 2mL， 加入 5%亚硝酸钠溶液
0.2mL， 混匀放置 6min 后， 加入 10%硝酸铝溶液
0.2mL，混匀放置 6min，再加入 1mol/L NaOH 溶液
2mL，混匀放置 15min。于 510nm 波长测定吸光值，
以芦丁含量（mg）为横坐标，吸光值为纵坐标绘制
标准曲线， 得到回归方程 y=3.2464x+0.0127，R2=
0.9984。取 0.1mL 柿叶提取物，按照上述方法进行
测定， 再根据回归方程计算提取物中的总黄酮含
量，表示为 mg/g 柿叶。
1.2.3 响应面优化试验
根据单因素试验，选取温度（℃）、乙醇体积分
数 （%）、液固比（V/m）、时间（min）4 个因素为自变
量 （xi），以总黄酮含量为响应值 （Y），进行 Box-
Behnken 试验设计，共 29 个试验点。各因素变化区
间由单因素试验确定。每个试验点均做 3 个平行样，
取平均值。因素水平编码见表 1。
1.3 统计分析
每个试验重复 3 次，结果表示为 x±SD。数据统
计分析采用 Statistix 8.1（分析软件，StPaul，MN）软件
包中 Linear Models程序进行，差异显著性（P<0.05）
分析使用 Tukey HSD 程序；应用 Design-Expert 7.1
软件（Stat Ease，Inc，Minneapolis，USA）进行优化处
理。
编码 x1 温度/℃ x2 乙醇体积分数/% x3 液固比 x4 时间/min
+1 60 80 25∶1 40
0 50 70 20∶1 30
-1 40 60 15∶1 20
表 1 Box-Behnken 设计因素水平编码表
Tab.1 Factors and levels of Box-Behnken design
2
第 49 卷（总第 178 期）
c
bc
a
ab
bc
提取温度/℃
总
黄
酮
含
量
/（
m
g·
g-
1 ）
21.5
21.0
20.5
20.0
19.5
19.0
18.5
18.0
20 40 50 60 80
图1 提取温度对柿叶提取物总黄酮含量的影响
Fig.1 Effect of extraction temperature on flavonoids
content of persimmon leaf extract
f
d d
c
a
b
e
20 40 50 60 70 80 100
12
16
20
24
28
乙醇体积分数/%
总
黄
酮
含
量
/（
m
g·
g-
1 ）
图2 乙醇体积分数对柿叶提取物总黄酮含量的影响
Fig.2 Effect of ethanol concentration on flavonoids
content of persimmon leaf extract
aaa
b
c
d
5∶1 10∶1 15∶1 20∶1 25∶1 30∶1
40
35
30
25
20
15
10
5
总
黄
酮
含
量
/（
m
g·
g-
1 ）
液固比
图3 液固比对柿叶提取物总黄酮含量的影响
Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on flavonoids content
of persimmon leaf extract
2 结果与分析
2.1 提取温度对柿叶提取物总黄酮含量的影响
在乙醇体积分数 50%、液固比 10∶1、提取时间
30min 的条件下， 不同提取温度对柿叶提取物总黄
酮含量的影响如图 1所示。随着提取温度的增加，总
黄酮含量先显著增加（P<0.05），当提取温度为 50℃
时达到最大值，之后随着温度的增高，含量又开始下
降。适当增加温度能够降低提取溶剂的黏度，从而增
加了黄酮物质的溶出率，但温度过高，可能会导致柿
叶中可溶性蛋白溶出变性，反而增加了溶剂的黏度，
不利于黄酮物质溶出， 并且温度过高也会破坏提取
物中的活性成分 ［13-14］。因此，选择 40℃，50℃和 60℃
进行后续的优化试验。
2.2 乙醇体积分数对柿叶提取物总黄酮含量的影响
在提取温度 50℃、液固比 10∶1、提取时间 30min
的条件下， 不同乙醇体积分数对柿叶提取物总黄酮
含量的影响如图 2 所示。乙醇体积分数从 20%增加
到 70%时，总黄酮含量显著增加（P<0.05），在乙醇体
积分数为 70%时，总黄酮含量达到最大值。当乙醇
体积分数继续增加时， 总黄酮含量开始显著降低
（P<0.05）。乙醇体积分数为 70%时总黄酮含量最高，
这可能是因为柿叶总黄酮主要是以黄酮苷元和糖苷
2 种形式存在，其中苷元成分易溶于乙醇，而糖苷易
于溶于水，而在 70%乙醇体积分数下，水与乙醇达
到最佳比例，二者的提取效果均较好 ［14］。因此，选择
60%、70%和 80%体积分数的乙醇进行优化试验。
2.3 液固比对柿叶提取物总黄酮含量的影响
在提取温度 50℃、乙醇体积分数 70%、提取时
间 30min的条件下， 不同液固比对柿叶总黄酮含量
的影响如图 3所示。可以看出，总黄酮含量随着提取
溶剂用量的增大而呈现上升趋势， 液固比由 5∶1 增
加到 20∶1 的过程中，总黄酮含量增加幅度显著（P<
0.05）， 但是当液固比由 20∶1 继续增加到 30∶1 的过
程中， 总黄酮含量增加的幅度不大， 且差异不显著
（P>0.05），总黄酮含量逐渐趋向于稳定。因此，选择
15∶1、20∶1 和 25∶1 三个水平液固比进行后续的优化
试验。
2.4 提取时间对柿叶提取物总黄酮含量的影响
在乙醇体积分数 70%、液固比 20∶1、提取温度
50℃的条件下， 不同提取时间对柿叶提取物总黄酮
含量的影响如图 4 所示。可以看出，随着提取时间的
延长，总黄酮含量先增加，提取 30min时，含量最高，
但与提取 20min 和 40min 时相比，差异不显著（P>
0.05）。当提取时间继续延长时，总黄酮含量开始显
著降低（P<0.05），且降低幅度较大，这可能是由于提
贾娜等：响应面法优化柿叶总黄酮的超声波辅助提取条件 3
2013 年第 6 期
总
黄
酮
含
量
/（
m
g·
g-
1 ）
26
24
22
20
18
b
ab a ab
c
c
10 20 30 40 50 60
提取时间/min
图4 提取时间对柿叶提取物总黄酮含量的影响
Fig.4 Effect of extraction time on flavonoids content
of persimmon leaf extract
取时间过长会对提取物中的活性成分造成破坏。综
合考虑经济原则和试验周期，选择优化提取时间为
20min，30min和 40min这 3个水平。
2.5 回归模型的建立及方差分析
在单因素试验基础上，以提取温度、乙醇体积分
数、液固比、提取时间为自变量，以柿叶提取物中总
黄酮含量为因变量，对总黄酮的超声波辅助提取条
件进行优化，试验设计及结果见表 2。对表 2 中的试
验结果进行多项拟合回归，得到二次多项回归方程：
Y=34.47+1.66x1-1.09x2+1.15x3+1.08x4-0.085x1x2+
0.25x1x3-0.63x1x4-0.55x2x3+0.15x2x4+0.61x3x4-2.98x12-
4.18x22-1.97x32-2.68x42
为了检验回归方程的有效性，进一步确定各因
素对总黄酮含量的影响程度，对回归模型进行方差
分析，结果见表 3。可以看出，所得回归模型的 P＜
0.01，差异极显著。本研究所得模型的决定系数为 0.922，
这表明，92.2%的变更能够通过这个模型解释，且模
型失拟不显著，因此，此模型能充分地表明各因素之
间的关系，可以用于实际值的预测。
回归模型的 x1，x2，x3，x4，x12，x22，x32，x42的 P 值均
小于 0.01，说明其对总黄酮含量均有显著影响，但各
种因素的交互作用影响均不显著，说明各个提取条
件之间的交互作用很小。根据方差分析和回归方程
系数显著性检验的结果，将差异不显著的因子剔除
后得到的回归方程为：
Y=34.47+1.66x1-1.09x2+1.15x3+1.08x4-2.98x12-
4.18x22-1.97x32-2.68x42
对回归模型进行方差分析，可以直接从回归系
数绝对值的大小来分析各个因素的改变对总黄酮含
变异来源 平方和 自由度 均方 F 值 P 值 显著性
模型 246.5918 14 17.6137 11.74234 ＜0.0001 **
x1 32.96768 1 32.96768 21.97821 0.0003 **
x2 14.19188 1 14.19188 9.461146 0.0082 **
x3 15.98521 1 15.98521 10.65669 0.0056 **
x4 13.93208 1 13.93208 9.287948 0.0087 **
x1x2 0.0289 1 0.0289 0.019266 0.8916
x1x3 0.255025 1 0.255025 0.170015 0.6863
x1x4 1.5876 1 1.5876 1.058388 0.3210
x2x3 1.221025 1 1.221025 0.814008 0.3822
x2x4 0.09 1 0.09 0.059999 0.8101
x3x4 1.500625 1 1.500625 1.000406 0.3342
x12 57.77024 1 57.77024 38.51307 ＜0.0001 **
x22 113.4339 1 113.4339 75.62179 ＜0.0001 **
x32 25.15637 1 25.15637 16.77073 0.0011 **
x42 46.56537 1 46.56537 31.04324 ＜0.0001 **
剩余 21.00023 14 1.500016
失拟 13.30275 10 1.330275 0.691278 0.7111
误差 7.69748 4 1.92437
总回归 267.592 28
表 3 Box-Behnken 设计方差分析表
Tab.3 Analysis of variance of the regression parameters
for Box-Behnken
注：P＜0.0100极显著（**）；P＜0.0500显著（*）；P＞0.0500不显著。
试验
号
因素
总黄酮含量
/mg/g
x1
温度/℃
x2
乙醇体积分数/%
x3
液固比
x4
时间/min
1 40 60 20 30 26.31
2 60 60 20 30 29.54
3 40 80 20 30 23.79
4 60 80 20 30 26.68
5 50 70 15 20 27.74
6 50 70 25 20 29.05
7 50 70 15 40 27.92
8 50 70 25 40 31.68
9 40 70 20 20 25.07
10 60 70 20 20 31.13
11 40 70 20 40 28.51
12 60 70 20 40 32.05
13 50 60 15 30 27.46
14 50 80 15 30 27.52
15 50 60 25 30 30.99
16 50 80 25 30 28.84
17 40 70 15 30 28.09
18 60 70 15 30 29.67
19 40 70 25 30 29.55
20 60 70 25 30 32.14
21 50 60 20 20 28.06
22 50 80 20 20 24.97
23 50 60 20 40 30.64
24 50 80 20 40 28.15
25 50 70 20 30 36.35
26 50 70 20 30 35.36
27 50 70 20 30 32.85
28 50 70 20 30 34.12
29 50 70 20 30 33.68
表 2 Box-Behnken 设计和响应值
Tab.2 Box-Behnken design and response values
4
第 49 卷（总第 178 期） 贾娜等：响应面法优化柿叶总黄酮的超声波辅助提取条件
38
36
34
32
30
28
26
24
总
黄
酮
含
量
/（
m
g·
g-
1 ）
40
45
50
55
60
A:温度
25
23
21
19
17
15C：液固比
图6 温度和液固比对总黄酮含量影响的响应面图
Fig.6 Response surface for the effect of temperature and
liquid-solid ratio on the flavonoids content
25
23
21
19
17
15
C：液固比
40
35
30
25
20D：时间
38
36
34
32
30
28
26
24
总
黄
酮
含
量
/（
m
g·
g-
1 ）
图10 液固比和时间对总黄酮含量影响的响应面图
Fig.10 Response surface for the effect of liquid-solid ratio
and time on the flavonoids content
38
36
34
32
30
28
26
24
总
黄
酮
含
量
/（
m
g·
g-
1 ）
40
35
30
25
20D：时间 B：乙醇体积分数60
65
70
75
80
图9 乙醇体积分数和时间对总黄酮含量影响的响应面图
Fig.9 Response surface for the effect of ethanol concentration
and time on the flavonoids content
38
36
34
32
30
28
26
24总
黄
酮
含
量
/（
m
g·
g-
1 ）
25
23 21
19
17 15C：液固比 B：乙醇体积分数60
65
70
75
80
图8 温度和乙醇体积分数对总黄酮含量影响的响应面图
Fig.8 Response surface for the effect of temperature and
ethanol concentration on the flavonoids content
40
45
50
55
60
A:温度
38
36
34
32
30
28
26
24
总
黄
酮
含
量
/（
m
g·
g-
1 ）
40
35
30
25
20D：时间
图7 温度和时间对总黄酮含量影响的响应面图
Fig.7 Response surface for the effect of temperature
and time on the flavonoids content
38
36
34
32
30
28
26
24
80
总
黄
酮
含
量
/（
m
g·
g-
1 ）
75
70
65
60B：乙醇体积分数 40
45
50
55
60
A:温度
图5 温度和乙醇体积分数对总黄酮含量影响的响应面图
Fig.5 Response surface for the effect of temperature and
ethanol concentration on the flavonoids content
量的影响大小。 回归方程一次项的回归系数绝对值
大小依次为 x1，x2，x3，x4， 表明提取温度对柿叶提取
物总黄酮含量的影响最大，其次是液固比、乙醇体积
分数、提取时间。
5
2013 年第 6 期
2.6 响应面分析
图 5～图 10 直观地反映了各因素对柿叶提取物
总黄酮含量的影响。由图 5、图 6 和图 7 可知，柿叶
提取物的总黄酮含量随温度的增加呈先增加后降低
的趋势，温度在 55℃左右时，对黄酮含量的影响较
大。由图 6、图 8 和图 10 可以看出，总黄酮含量随液
固比的增加也呈现现增加后趋于平缓的趋势。 由图
5、图 8 和图 9 可知，当乙醇的体积分数为 60-70%
时，总黄酮含量随乙醇体积分数的增加而显著增加，
当乙醇的体积数大于70%时， 总黄酮含量随乙醇体
积分数的增加而减小。由图 7、图 9 和图 10 可以看
出，总黄酮含量随时间的延长而增加，当时间度约为
20-30min 时，时间延长使总黄酮含量增大的速度较
大，当时间大于 30min时，总黄酮含量随时间的延长
而降低。
2.7 最适条件和回归模型的验证
通过这个回归模型，采用 Design-Expert 7.1 软
件优化提取条件， 得出柿叶总黄酮的最佳超声提
取条件为：温度 53℃、乙醇体积分数 69%、液固比
21∶1、时间 32min，在此条件下，总黄酮提取的预测
值为 35.05mg/g，而实际测得的产率为 35.36mg/g，
实际值与预测值之间的相对误差为 0.88%， 差异
不显著，符合一般的工程要求，因此，采用超声波
辅助提取柿叶黄酮的工艺条件准确可靠， 具有实
用价值。
3 结论
通过单因素试验和 Box-Behnken 试验设计优
化提取条件， 对柿叶总黄酮的超声辅助提取条件进
行优化。4 个因素对柿叶总黄酮提取量的影响大小
依次为温度>液固比>乙醇体积分数>提取时间，最
适提取条件为：提取温度 53℃、乙醇体积分数 69%、
液固比 21∶1、 提取时间 32min， 总黄酮提取量为
35.36mg/g。并得到柿叶总黄酮提取率与超声提取各
因素变量的二次回归方程模型，该模型回归极显著，
对试验拟合较好，有一定应用价值。
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