全 文 ：高效液相色谱法同时测定柿叶和
连翘中黄酮和三萜类化合物的含量
王丽峰 , 彭敬东 , 刘丽敏
(西南大学化学化工学院 , 重庆 400715)
摘　要:建立了一种同时测定黄酮类和三萜类化合物的反相高效液相色谱法。
采用 Eclipse XDB-C18(150 mm ×4.6 mm , 5 μm)色谱柱 , 以甲醇-乙腈-0.05%
H3PO4(三乙胺调 pH 3.0)为流动相 , 采用梯度洗脱 , 柱温为 30 ℃, 检测波长采
用波长程序 。芦丁 、金丝桃苷 、槲皮素 、齐墩果酸和熊果酸的线性范围分别为
1.632 ～ 489.6 、1.045 ～ 522.5 、1.349 ～ 134.9 、5.290 ～ 529.0 、5.075 ～ 507.5mg L ,
相关系数均大于 0.999。检测限分别为0.096 、0.196 、0.043 、0.639 、0.733mg L。
该方法可用于柿叶和连翘中黄酮和三萜类化合物的分离测定 。
关键词:反相高效液相色谱;黄酮类;三萜类;柿叶;连翘
　　黄酮类和三萜类化合物广泛存在于天然产物
中 , 二者具有许多相似的生物活性 , 如抗肿瘤 、抗
菌 、 抗病毒等多种药效[ 1] 。柿叶(柿科植物
Diospyros kaki L .f.)和连翘[ 木犀科植物 Forsythia
suspensa(Thunb.)Vah1] 都含有丰富的黄酮类和三
萜类化合物 , 如芦丁 、金丝桃苷 、!槲皮素等常见
的黄酮醇类化合物[ 2 , 3] 和三萜类化合物齐墩果酸 、
熊果酸等[ 4] 。上述几种物质的分析方法主要有紫
外分光光度法[ 5 , 6] 、荧光分光光度法[ 7] 、薄层色谱
法[ 8] 、电化学分析法[ 9 , 10] 和高效液相色谱法[ 11～ 15]
等。紫外分光光度法和荧光分光光度法选择性较
差 , 不能用于多组分同时测定;薄层色谱法准确
度不高 , 目前已很少使用;高效液相色谱以其选
择性好 、灵敏度和准确度高的特点日益成为天然
药物分析的首选方法。已有文献报道用高效液相
色谱法同时测定齐墩果酸和熊果酸[ 14, 15] , 但齐墩
果酸和熊果酸与黄酮类化合物的同时测定至今未
见报道。本文建立了一种反相高效液相色谱法 ,
同时对芦丁 、金丝桃苷 、槲皮素 、齐墩果酸和熊果
酸进行分离测定 , 且应用于柿叶和连翘中该五种
成分的含量测定 , 方法可行。为柿叶和连翘的整
体质量控制及其真伪的鉴别提供一定的理论与技
术依据 , 对常规分析具有重要的指导意义 , 并扩
展了高效液相在中药材质量控制中的应用 。
1　实验部分
1.1　仪器与试剂
Agilent1100高效液相色谱仪(美国 Agilent 公
司 , 包括 G1315B 二级管阵列检测器), UV-VIS
8500紫外分光光度计(上海天美公司), Acculab 电
子天平(德国赛多利斯股份公司), SZ-93自动双重
纯水蒸馏器(上海亚荣生化仪器厂), pHS-3C 型精
密 pH 计(上海精密仪器科技有限公司)。
芦丁 、槲皮素 、齐墩果酸 、熊果酸均购自陕西
省西安慧科植物有限开发公司(98%);金丝桃苷
购自中国药品生物制品检定所;柿叶采集于重庆 、
河南南阳和商丘 , 经重庆工学院傅善权副研究员
鉴定为柿科植物 Diospyros kaki L.f.的干燥叶;连
翘购自重庆市中药材市场 , 经重庆工学院傅善权
副研究员鉴定为木犀科植物 Forsythia suspensa
(Thunb.)Vahl的干燥果实;乙腈 、甲醇(色谱纯 ,
天津市科密欧化学试剂有限公司);H3PO 4(分析
纯 , 重庆北碚化学试剂厂);三乙胺(分析纯 , 重庆
川东化工有限公司);水为二次蒸馏水。
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2008年 5 月 　　　　　　　　　　　　 分析试验室Chinese Journal of Analysis Laboratory　　　　　　　　　　　　Vol.27.Suppl.2008-5
作者简介:王丽峰(1977-), 女 , 硕士研究生
DOI :10.13595/j.cnki.issn1000-0720.2008.0430
1.2　色谱条件
色谱柱:Eclipse XDB-C18(150 mm×4.6 mm , 5
μm);流动相为甲醇-乙腈-0.05%的 H3PO4(三乙胺
调 pH 3.0), 采用梯度洗脱 , 梯度洗脱程序如表 1;
检测波长采用波长程序 , 0 ～ 24 min 检测波长为
360 nm , 24 min后检测波长为 210 nm;柱温为 30
℃;进样量为 20μL。
表 1　梯度洗脱程序
时间
t min
甲醇
%
乙腈
%
0.05%H3PO4(pH 3.0)
%
流速
(mL min)
0 0 20 80 1.0
4 0 20 80 1.0
8 0 40 60 1.0
10 0 40 60 1.0
12 89 0 11 0.5
31 89 0 11 0.5
1.3　样品溶液的制备
1.3.1　标准溶液的配制　精密称取适量标准品 ,
用甲醇溶解后稀释配制成 1 mg mL 的标准贮备液 ,
置于 4 ℃冰箱中保存 。临用前用贮备液配制一系
列不同浓度的 5种标样的混合溶液。
1.3.2　样品的预处理　取 50 ℃真空干燥4 h的柿
叶和连翘 , 粉碎 , 精密称取 1 g 柿叶和连翘各 3
份 , 分别加入25 mL乙醇 , 超声提取40min , 过滤 ,
滤渣再各加 20 mL 乙醇 , 超声提取 20 min , 过滤 ,
合并两次提取液 。将提取液减压浓缩 , 用 90%的
甲醇定容至10 mL。
2　结果与讨论
2.1　色谱条件的优化
2.1.1　检测波长的选择　采用紫外可见光分光光
度计 , 对 5种化合物在200 ～ 500 nm范围内扫描吸
收光谱 , 如图 1所示 。结果表明 , 3种黄酮类化合
物在 260 nm 和 360 nm 均有较强吸收 , 在 360 nm
检测时样品中其他成分干扰较小 , 选择 360 nm为
芦丁 、金丝桃苷 、槲皮素的检测波长 。两种三萜类
化合物在 204 nm 有最大吸收 , 在此检测波长下 ,
流动相中甲醇的紫外吸收干扰较大 , 基线不稳 。
参考文献[ 14 ～ 16] , 选择 210 nm为齐墩果酸和熊果酸
的检测波长 , 实验表明 210 nm 处干扰较小且不影
响样品测定的灵敏度 。
图 1　吸收光谱
1-金丝桃苷;2-槲皮素;3-芦丁;4-齐墩果酸;5-熊
果酸
2.1.2　流动相的优化 　分别考察了水 、 0.05%
H3PO 4水溶液 、0.05%H3PO 4水溶液(三乙胺调 pH
3.0)与乙腈和甲醇以不同的体积比作为流动相分
离5种化合物 , 结果显示 , 0.05%H3PO4 水溶液
(三乙胺调 pH 3.0)做缓冲溶液时其分离效果和峰
形都明显优于另外两种溶液。在流动相中加入
H3PO 4可以改善峰形;少量三乙胺可以改变待测
组分在色谱柱上的保留行为 , 齐墩果酸和熊果酸
的分离度明显提高 , 可达 1.5 以上。最终选择
0.05%H3PO4 水溶液(三乙胺调 pH 3.0)作为水缓
冲溶液。
使用上述优化的水缓冲溶液 , V(乙腈)∶V(水
缓冲)=20∶80 , 可以很好地分离芦丁 、金丝桃苷和
槲皮素 , 但此体系改变比例无法完全分离齐墩果
酸和熊果酸;V(甲醇)∶V(水缓冲)=89∶11 , 流速
为 0.5 mL min 时可以完全分离齐墩果酸和熊果
酸 , 使其分离度达到 1.5 以上 , 但甲醇-水缓冲体
系改变比例无法完全分离芦丁和金丝桃苷 。因此 ,
要同时测定芦丁 、金丝桃苷 、槲皮素 、齐墩果酸和
熊果酸并尽可能的缩短分析时间需使用梯度洗脱 。
梯度洗脱程序见表 1。
2.1.3　波长程序的优化　由于各物质的最大吸收
波长不同 , 为使各物质的检测灵敏度最大限度的
提高 , 测定过程中使用了波长程序 。0 ～ 10 min 检
测波长为 360 nm , 由于 10 ～ 12 min内设置了梯度
程序 , 在 20 min 前调节检测波长到齐墩果酸和熊
果酸的检测波长 210 nm , 基线将会波动 , 因此选
择在 24 min时调节检测波长至 210 nm 。此时基线
波动小 , 且不影响齐墩果酸和熊果酸的测定。
2.1.4　流速的优化　考察了分离过程中流速对分
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离效果的影响 。结果显示 , 随着流速的增加 , 芦
丁 、金丝桃苷 、槲皮素的分离度未发生明显变化 ,
但齐墩果酸和熊果酸的分离度明显降低 , 为了缩
短分析时间且能使齐墩果酸和熊果酸达到基线分
离 , 对其流速也采用梯度程序 , 在 0 ～ 10 min (即
芦丁 、金丝桃苷和槲皮素的洗脱时间内)流速为
1.0 mL min , 10 ～ 12 min 流速线性变化至 0.5 mL
min , 12 ～ 31 min流速为 0.5 mL min。这样既能保
证芦丁 、金丝桃苷和槲皮素的高灵敏度 , 又能使
齐墩果酸和熊果酸的分离度大于 1.5。
2.1.5　柱温的选择　温度的变化可以引起待测物
在流动相和固定相间分配系数的变化 , 改变柱温
可以改善分离效果。分别考察了柱温为 20 、 25 、
30 、 35 、40 ℃时对分离效果的影响 , 结果表明 , 随
着柱温的升高 , 齐墩果酸和熊果酸的分离度有所
增加 , 超过 30 ℃以后 , 其分离度几乎不变 , 考虑
到柱温的升高会影响色谱柱的使用寿命 , 最终选
择柱温为 30 ℃。
2.2　样品前处理条件的优化
2.2.1　提取方法的选择　分别考察了超声 、加热
回流 、冷浸(48 h)3 种提取方法。实验结果表明 ,
超声可以将连翘和柿叶中的黄酮类和三萜酸类化
合物提取完全 , 且超声提取方便 , 提取率高 , 与传
统提取方法相比 , 具有快速 、环保 、高效等优点;
故选择超声作为连翘和柿叶药材的提取方法 。
2.2.2　提取溶剂的选择　参考文献[ 17 , 18] , 考察了
3种溶剂甲醇 、乙醇 、乙酸乙酯的提取效果 , 结果
表明 , 3种溶剂的提取效率相当 , 考虑到乙醇的毒
性小 , 故选择乙醇为提取溶剂。
2.3　方法学评价
2.3.1　线性范围和检出限　取 1.3.1项下配制的
一系列不同浓度的 5种标样的混合溶液分别进样
20μL , 以各组分峰面积 Y 对其质量浓度X(g L)进
行线性回归分析 , 得到的回归方程 、相关系数 、线
性范围及其检出限(3σ)见表 2 , 图 2为对照品及样
品的色谱图。
图 2　对照品(a), 柿叶(b)和连翘(c)的色谱图
1-芦丁;2-金丝桃苷;3-槲皮素;4-齐墩果酸;5-熊
果酸
表 2　3 种黄酮和两种三萜酸的校正曲线的回归分析
对照品 回归曲线 相关系数 r 线性范围 (mg L) 检出限 (mg L)
芦丁 Y=32673X +103.39 0.9995 1.632～ 489.6 0.096
金丝桃苷 Y=19548X +46.124 0.9997 1.045～ 522.5 0.196
槲皮素 Y=86929X +89.732 0.9996 1.349～ 134.9 0.043
齐墩果酸 Y=24213X +29.011 0.9996 5.290～ 264.5 0.639
熊果酸 Y=22295X +30.247 0.9996 5.075～ 507.5 0.733
2.3.2　精密度试验　取 1.3.1项下 5种标样的混
合溶液 , 重复进样 6次 , 分别测定各组分的峰面
积。芦丁 、金丝桃苷 、槲皮素 、齐墩果酸和熊果酸
的峰面积的 RSD分别为 0.97%、 1.52%、 1.46%、
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2.06%、 1.32%, 表明该方法的精密度良好。
2.3.3　稳定性试验　取 1.3.2项下柿叶和连翘提
取液各一份 , 于 0 、 4 、 8 、 12 、 24 、 36 h 进样测定 。
柿叶中的芦丁 、金丝桃苷 、槲皮素 、齐墩果酸和熊
果酸的 RSD 分别为 1.51%、 2.56%、 2.92%、
2.85%、 2.24%, 连翘中该 5种成分的 RSD分别为
1.75%、 2.82%、 3.05%、2.98%、 3.38%, 表明样
品在 36 h内稳定 。
2.3.4　加样回收率试验　取各组分含量已知的柿
叶和连翘样品 , 分别精密加入适量的芦丁 、金丝
桃苷 、槲皮素 、齐墩果酸和熊果酸 , 测得样品的平
均回收率(n =6)分别为 , 柿叶:芦丁 98.6%、金
丝桃苷 95.6%、槲皮素 97.3%、齐墩果酸 96.2%、
熊果酸 95.7%;连翘:芦丁 97.2%、 金丝桃苷
95.2%、槲皮素 96.4%、齐墩果酸 95.8%、熊果酸
96.1%。
2.3.5　样品测定　分别取柿叶和连翘样品 , 按
“1.3.2”项下方法制备样品 , 在上述色谱条件下测
定其峰面积 , 含量测定结果见表 3。
表 3　样品测定结果(n=3)
药材 产地 含量 (mg g)芦丁 金丝桃苷 槲皮素 齐墩果酸 熊果酸
柿叶 河南南阳 0.193 0.939 0.397 2.244 4.219
河南商丘 0.231 1.096 0.338 2.180 4.633
重庆 0.340 1.187 0.548 3.169 3.949
连翘 河南 4.393 0.291 0.109 3.331 2.185
山东 3.566 0.470 0.211 4.475 1.643
陕西 3.980 0.322 0.068 2.585 2.672
3　结论
本方法采用反相高效液相色谱法分离测定黄
酮醇类和三萜类物质 , 用二极管阵列检测器检测 ,
方法灵敏快速 , 结果可靠。可同时对柿叶和连翘
中的芦丁 、金丝桃苷 、槲皮素 、齐墩果酸和熊果酸
进行含量测定 。简化了分析过程 , 使常规分析和
大量样品的分析更加方便 , 可以更快速 、更全面
的反映中药的物质信息 , 为控制柿叶和连翘的内
在质量提供了科学依据。
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