全 文 ：基金项目:国家自然科学基金资助项目(20576113)
作者简介:范杰平 ,男 ,博士生　　*通讯作者:何潮洪 ,男 ,博士生导师　　Te l:(0571)87952709　　E-m ai l:chhez ju@ zju. edu. cn
柿叶中总三萜的提取以及熊果酸分离 、纯化研究
范杰平 1, 2 ,何潮洪 1* ,傅鹏飞1(1.浙江大学化工系 ,杭州 310027;2.南昌大学环境科学与工程学院化工系 ,南昌 330031)
摘要:目的　研究了柿叶中总三萜的提取以及熊果酸的分离 、纯化 , 并确定了提取 、分离及纯化的适宜工艺条件 , 以利于柿叶
资源的开发利用。方法 　以总三萜得率为指标 ,采用溶剂提取法筛选出总三萜提取的合适工艺 ,以及经脱脂 、除杂 、结晶得到
熊果酸的合适条件。熊果酸晶体用 E I-M S, ESI-M S, 1H-NMR和 13C-NM R等方法进行了表征。结果　优化的总三萜的提取精
制工艺条件为:柿叶粉用石油醚(沸点 60 ～ 90 ℃)在 60℃和液固比为 6的条件下 ,脱色除杂 3次 ,每次 2 h;脱色除杂后柿叶用
乙酸乙酯作为提取溶剂 ,在 70 ℃和液固比为 6的条件下 , 提取 3次 ,每次 2 h,合并乙酸乙酯提取液减压蒸干得到总三萜 ,总三
萜得率约为 4. 1%, 纯度约为 63. 1%。熊果酸的分离 、纯化工艺条件为:乙酸乙酯粗提物用石油醚 , 60℃和液固比为 30的条件
下 , 脱色除杂 3次 ,每次 30 m in;然后 ,每 0.4 g经石油醚脱色除杂后的乙酸乙酯提取物用 40 mL乙醇溶解 ,加入 0.4 g左右活
性炭 , 30 ℃下脱色 2次 ,每次 20 m in;最后 ,经活性炭脱色后的乙酸乙酯提取物用乙醇结晶两次就得到熊果酸晶体。经现代谱
学方法研究证明 ,所得晶体为熊果酸 , H PLC测定熊果酸含量超过 98%, 总产率在 0.4%左右(以干柿叶计)。结论 　该工艺简
单易行 、快捷 ,成本较低 、产品纯度高 、环境污染小 ,适合工业规模化提取总三萜及生产熊果酸 。
关键词:柿叶;总三萜;熊果酸;提取;分离及纯化
中图分类号:R284.2 　　　文献标识码:A　　　文章编号:1001 -2494(2007)16 - 1258 - 04
Extraction ofTotal Tr iterpenoids, Separation and Pur ification ofUrsolic Acid from the Leaves ofDiospyros kaki
FAN Jie-ping1, 2 , HE Chao-hong1* , FU Peng-fe i1 (1.D epartm ent of Chem ica l Engineering, Zhejiang University, Hangzhou
310027, Ch ina;2.School of Environm ental Science and Engineering , Nanchang University, Nanchang 330031, China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　The extraction of to tal triterpeno ids, separation and pu rifica tion of u rso lic acid from the leaves ofD i-
sopyros kak iwe re studied in o rde r to exploit the resource of the leave s o fD isopyros kak i.METHODS　The effec t o f d iffe rent facto rs on
leach ing rate wa s studied by so lvent ex trac tion.Urso lic acid wa s obtained a fter the fo llow ing steps:ex traction, deg reasing, deco lo ra tion
and recrysta llization.The chem ical structu re o f urso lic ac id w as identified by E I-M S, ESI-MS, 1H-NMR and 13C-NMR.RESULTS　
The op tim a l conditions o f extracting to ta l triterpeno ids w ere obtained as fo llow s:the leaves ofD iospyros kak iwe re deg reased by petro le-
um e ther (bp 60 ～ 90 ℃) thrice, each fo r 2 h a t 60℃, so lvent vo lum e to the leaves o fD iospyros kak im ass ra tio o f 6∶1, and then ex-
tracted by E tOAC thrice, each for 2 h at 70 ℃, so lvent vo lum e to the leaves o fD iospyros kak im ass ra tio o f 6∶1.The e thy l ace tate ex-
tracts w ere com bined and evaporated to dry under vacuum to obtain the to tal trite rpeno ids.The y ie ld and purity of the to tal triterpeno ids
w ere abou t 4.1% and 63. 1%, respective ly.The op tim a l conditions o f sepa ra tion and purifica tion of urso lic acid w ere as follow s:the to-
ta l trite rpenoids ob tained above w ere deg reased by pe tro leum e the r(bp 60 ～ 90℃) thrice (each fo r30 m in) a t 60 ℃, solvent vo lume
to the tota l trite rpenoidsm ass ratio o f 30∶1, and then was disso lved in e thano l and deco lo rized by ac tive ca rbon tw ice a t 30 ℃ and each
for 20 m in in a so lution o f the volum e to thew e ight of active carbon ratio o f 100∶1. The e thano l so lution w as evapo ra ted to dryness under
vacuum and then the re sidue was recrysta llized from ethano l to obtain urso lic acid(about y ie ld of 0.4% of the powder of the leaves of
D isopy ros kaki).The purity o f ursolic acid is above 98% by HPLC.CONCLUSION 　The produc t is ob tained w ith high y ie ld, high
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purity and low po llu tion. It is feasible fo r the industrial production of to tal trite rpene and urso lic acid from the leave s o fD isopyros kak i.
KEY WORDS:D iospyros kaki;to ta l triterpeno ids;ursolic acid;extraction;separation and purification.
　　柿叶为柿科柿属植物柿 (Diospyros kaki)的叶 ,
长期作为天然药物入药 ,含有多种生理活性物质及
营养成分 ,主要有黄酮 、三萜等化合物 [ 1] ,其中的熊
果酸 (U rso1ic acid ),是 α-香树脂醇型五环三萜酸 ,
具有广泛的药用价值 [ 2] 。目前从柿叶 [ 3]或其他天
然资源 [ 4]中提取分离熊果酸主要采用柱色谱分步
洗脱的方法 ,这些方法工艺流程长 ,收率低 ,造成熊
果酸成本昂贵。本实验拟对柿叶中总三萜的提取以
及熊果酸的分离 、纯化进行研究 ,以得到一种较简单
易行 、成本较低 、产品纯度高 、环境污染小的总三萜
及熊果酸的制备新工艺 ,为总三萜及熊果酸的工业
化开发提供指导作用 。
1　材料 、试剂与仪器
1.1　原料
柿叶于 2004年秋天采自浙江省杭州市 。实验
前 ,柿叶自然晾干 ,粉碎 ,过筛 ,取 20 ～ 40目柿叶粉
为原料 。
1.2　仪器及试剂
R - 202旋转蒸发器(上海申胜生物技术有限公
司 );WRS - 1B数字熔点仪 (上海精密科学仪器有
限公司);Autopo l©Ⅳ自动旋光仪 (Rudolph research
analytical co rporation, USA;B ruker AMX 500核磁共
振仪 (K arlsruhe, Germany);E I-MS用 F inn igan Trace
DSQ 四极杆质谱仪 (The rmo E lectron Corporation,
USA);ES I-MS用 F inn igan LCQ Advan tage离子阱质
谱仪(Thermo E lec tron C orporation, USA)。
除高效液相色谱用溶剂为色谱纯外 ,其余试剂
皆为分析纯 。熊果酸对照品(中国药品生物制品检
定所)。
2　实　验
2.1　柿叶总三萜的提取及熊果酸分离与纯化的工
艺
以项目组前期工作 [ 5]为基础 ,经过反复预实验
后提出了一种提取柿叶总三萜及分离熊果酸的新工
艺 ,工艺流程见图 1,其主要特色是不采用柱色谱分
离方法 ,不使用酸或碱 ,因此工艺简单 、成本较低 、环
境污染小。该工艺的几个关键步骤为:①在乙酸乙
酯提取柿叶总三萜之前 ,用石油醚脱去柿叶中的脂
溶性成分 ,否则乙酸乙酯提取物为油状的浸膏 ,而不
易形成干燥的固体粉末。 ②在提取柿叶总三萜过程
中 ,选用了较合适的溶剂乙酸乙酯 ,而不采用常用的
乙醇 。③总三萜的粗提取物先用石油醚脱去脂溶性
杂质 ,再用乙醇溶解后加活性炭脱色。
图 1　总三萜的提取以及熊果酸分离 、纯化工艺流程
Fig 1　F low diag ram for the ex traction o f tota l trite rpenoids, sep-
aration and purifica tion o f u rso lic acid from the leaves ofD isopy-
ros kak i
为得到总三萜提取及熊果酸分离的适宜条件 ,
本实验重点对上述关键步骤进行了优化 (整个工艺
过程中 ,搅拌速度都控制在 500 r m in-1)。
2.2　色素的测定
由于很难用质量来定量色素 ,故用色素溶液最
大吸收波长处的吸光度来表示它的含量 。
2.3　总三萜的测定
标准曲线的绘制:选用熊果酸为对照品 ,采用
5%香草醛-冰醋酸溶液及高氯酸显色后 ,进行总三
萜的含量测定 [ 6] 。实验中 ,考察了显色剂香草醛及
高氯酸的用量 、水浴温度和显色时间等因素对吸光
度的影响。经优化后 ,总三萜测定的合适条件为:
5%香草醛-冰醋酸溶液 0.3 mL,高氯酸 1.0 mL, 60
℃水浴 45 m in后 ,在 0 ℃下冷却 ,最后加冰醋酸定
容至 5.0mL,摇匀 ,在其最大吸收波长 548 nm处测
定 ,其效果较佳 。标准曲线方程 Y (g L -1 ) =
0.016 7X -0.001 5 (r2 =0.999 5, Y为浓度 , X为吸
光度 ), RSD为 1.36%。
总三萜的测定:取一定量待测液按绘制标准曲
线的方法测定其吸光度 ,然后按标准曲线方程换算
出总三萜的质量。
2.4　高效液相色谱法测定熊果酸的条件
Ag ilent 1100 se ries高效液相色谱仪 ,配有四元
溶剂输送系统 ,自动进样器和紫外-可见可变波长检
测器;色谱柱:Ag ilent Zorbax SB - C18反相色谱柱
(4.6 mm ×250 mm , 5 μm),柱温:30 ℃;流动相:甲
醇-0.1%磷酸水溶液 (80∶20), 流速 1.0 mL
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m in
-1 ,检测波长 210 nm。
3　结果与讨论
3.1　温度 、液固比 、脱色时间及次数对石油醚脱除
柿叶中色素的影响
由于熊果酸不溶于石油醚 ,而柿叶中很多杂质
成分却溶于石油醚 ,所以用石油醚可以去除柿叶中
能溶于石油醚的杂质 。以石油醚提取液的最大吸收
波长(412 nm)下的吸光度为指标 ,实验中考察了温
度 、液固比 、提取时间及提取次数对石油醚除杂的影
响 。经优化条件后得出 ,在 60 ℃,液固比为 6,石油
醚脱色 3次 (每次 2 h)后 ,柿叶的石油醚脱色液中
色素基本不变。
3.2　提取溶剂 、提取温度 、液固比 、提取时间及次数
对总三萜提取的影响
结果见图 2, 3。预实验发现乙酸乙酯 、二氯甲
烷 、丙酮 、乙醇和甲醇等作为提取溶剂时 ,经纯化后
都能得到熊果酸晶体 ,但用乙酸乙酯时 ,粗提物中总
三萜和熊果酸的产率及纯度都较高 ,另外从分离得
到熊果酸的难易程度 、产率 、溶剂的毒性等因素考
虑 ,所以选择乙酸乙酯作为总三萜的提取溶剂 。
图 2　柿叶总三萜提取的动力学曲线
A[提取温度的影响(20 g柿叶 , R=10)] :-◇- - 20 ℃;-△- - 30 ℃;-□- -
40℃;-|- - 60℃;-×- - 70℃;-※- - 77 ℃;B[液固比的影响(20 g柿叶 , 70
℃)] :-◇- -R =4;-□- -R=6;-△- -R =10;-※- -R =12
F ig 2　K inetics of ex trac tion o f to ta l triterpeno ids from the leav-
e s ofD iospy ros kak i w ith ethy l ace tate
A[ influence o f ex traction tempe ra ture (20 g leaves o fDiospyros kak i, R=10)] :-
◇- - 20 ℃;-△- - 30℃;-□- - 40℃;-|- - 60℃;-×- - 70 ℃;-※- - 77
℃;B[ ra tio (R) of vo lume of e thy l aceta te to mass of raw material(20 g leave s o f
D iospyros kak i, 70℃)] :-◇- -R =4;-□- -R =6;-△- -R=10;-※- -R =12
以乙酸乙酯为提取溶剂 ,考察了提取温度 、液固
比和提取次数对柿叶中总三萜提取的影响 。由图 2
(a)可知 ,随温度升高 ,提取产率增大 ,但增幅逐渐
变小 ,考虑到在乙酸乙酯沸腾温度提取时 ,溶剂损耗
较大 ,所以选择 70 ℃作为适宜的提取温度 。由图 2
(b)可看出 ,总三萜产率随液固比增大而增大 ,但总
体变化较小 ,考虑总三萜的得率及经济成本后 ,选择
液固比等于 6作为合适的提取条件 。另外 ,从图 3
可以看出 ,经过 3次提取后 ,柿叶中总三萜的产率就
基本不变。
图 3　提取次数对柿叶总三萜产率的影响 (提取条件:20 g
柿叶 , 70 ℃, 液固比为 6, 每次提取时间 2 h)
Fig 3　 In fluence o f extrac tion tim es on y ie lds of the to tal trite r-
peno ids(20 g leaves ofD iospyros kak i, ethy l ace tate, 70 ℃, R=
6, 2 h each tim e)
因此 ,合适的提取条件为:乙酸乙酯为溶剂 、70 ℃、
液固比为 6、提取 3次 (每次 2 h),此时得到的粗提
物为深绿色 ,总三萜产率及纯度都比较高。
3.3　温度 、液固比 、脱色时间及次数对石油醚脱除
乙酸乙酯粗提物中色素的影响
虽然柿叶经过石油醚脱色 ,但仍然存在少量未
除尽的色素 ,因此在柿叶的乙酸乙酯粗提取物中还
含有少量色素 。为纯化乙酸乙酯粗提物 ,所以用石
油醚去除粗提物中的杂质。以石油醚提取液的最大
吸收波长 (412 nm)下的吸光度为指标 ,实验考察了
温度 、液固比 、提取时间及提取次数对石油醚脱色除
杂的影响 。
实验得出 ,在液固比为 30, 60 ℃、石油醚脱色除
杂 3次(每次 30 m in)的条件下 ,脱色良好 ,乙酸乙
酯粗提物的石油醚脱色液中色素基本不再变化 ,脱
色后的粗提物颜色为浅绿色 。
3.4　经石油醚脱色后的乙酸乙酯粗提物用乙醇溶
解后加活性炭脱色
结果见图 4。经石油醚脱色后的乙酸乙酯粗提
物颜色仍较深 ,这是因为石油醚除去的是脂溶性色
素 ,但粗提物中还含有大量的非脂溶性色素如黄酮
类色素等 。乙酸乙酯粗提物的乙醇溶液经过点板显
色分析 ,确实证明有黄酮类化合物存在 ,另外实验发
现黄酮量的变化规律与色素脱除的规律类似 ,这也
说明活性炭可以把乙酸乙酯粗提物中的黄酮类色素
除去 。
以乙醇溶液最大吸收波长处 (372 nm)吸光度
表示色素的含量 ,用脱色率和总三萜的保留率来考
察活性炭脱色的效果 [脱色率 =(未脱色溶液的吸
光度 -脱色后溶液的吸光度 ) /未脱色溶液的吸光
度;总三萜的保留率 =脱色后溶液中总三萜的量 /未
脱色溶液中总三萜的量 ] 。图 4(A)表示活性炭用
量对脱色效果的影响 ,随着活性炭用量的增加脱色
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图 4　活性炭加入量(A)、温度(B)、脱色时间(C)和脱色次
数(D)对活性炭脱色的影响
-◇- -脱色率;-△- -总三萜的保留
F ig 4　 In fluence of am oun t of ac tive carbon added (A), temper-
a tu re (B), ex traction tim e (C) and ex trac tion time s(D)
-◇- - deco loring ra tio by ac tive carbon;-△- - remaining ra tio of tota l triterpe-
no ids
率增加 ,但总三萜的量也随之减少 ,在含 0.4 g乙酸
乙酯粗提物的 40 mL无水乙醇溶液中 ,当活性炭加
入量达到 0.4 g后 ,脱色效果增加比较缓慢 ,总三萜
量减少的幅度也变小 ,综合考虑脱色效果及总三萜
保留率 ,所以选择每 40 mL溶液中加入 0.4 g为合
适的活性炭用量 。本实验中也考察了温度对活性炭
脱色的影响 ,活性炭吸附作用以物理方式进行 ,存在
着吸附与解吸附的动态平衡:一方面 ,温度升高 ,可
减少溶液黏度 ,促进吸附质扩散 ,加速炭孔中先被吸
附的气体的置换出来 ,有利于加速吸附;另一方面 ,
物理吸附是个放热过程 ,吸附量与吸附质的溶解度
成反比 ,温度升高 ,不仅使吸附质溶解度增太 ,不利
于吸附 ,而且使吸附平衡向解吸附方向移动 ,解吸附
加强。从本实验来看 ,活性炭的脱色效果及总三萜
的保留率随温度变化不大 [图 4(B)] ,可能是因为
温度对活性炭吸附正反两方面作用综合导致的结
果 ,所以实验选择 30 ℃作为合适的脱色温度。从图
4(C)可以看出活性炭脱色能快速达到平衡 , 20 m in
后脱色效果增加不大但总三萜保留率却在下降 ,所
以脱色 20m in比较合适 。从图 4(D)可得出 ,脱色 2
次已足够 ,增加次数只会使总三萜的保留率下降而
脱色效果变化不大。
总之 ,在 30 ℃,活性炭用量与溶液体积比为
0.4 g 40mL -1时经过 2次 (每次 20 m in)脱色后 ,
脱色效果及总三萜的保留率都比较好 ,经脱色后乙
酸乙酯提取物的乙醇溶液蒸干后可得到白色的固体
　　
粉末 。
3.5　熊果酸的结晶
通过筛选结晶溶剂 ,发现乙醇作为结晶溶剂时 ,
结晶量大 ,产品纯度高 ,能得到无色的针状晶体 ,经
两次重结晶后纯度超过 98%(HPLC),熊果酸总产
率为 0.4%左右(以干柿叶粉计)。
3.6　熊果酸检测分析
与标准品比较 ,经重结晶后的熊果酸产品经高
效液相分析 ,纯度达 98%以上。经熔点 、比旋光度 、
质谱 、核磁共振氢谱 、核磁共振碳谱分析与标准品及
文献结果 [ 7-8]一致 。
4　结　论
本实验提出了一条从柿叶中提取总三萜及分离
熊果酸的新工艺 ,并对工艺条件进行了优化。在优
化的总三萜提取工艺条件下得到总三萜产率约为
4.1%,纯度约为 63.1%, 熊果酸晶体总产率在
0.4%左右 (以干柿叶粉计 ),纯度超过 98%。
本工艺为合理利用柿叶资源提供了一个较好的
途径 。通过本工艺得到的总三萜产率及纯度都比较
高;在分离和纯化熊果酸的过程中 ,避免了使用传统
工艺中柱色谱分离的方法 ,所以使分离过程简单易
行 、快捷 ,成本较低;另外也没有使用酸碱试剂 ,因此
避免了对生产设备的腐蚀及废水的处理 ,因此该工
艺降低了成本 ,减小了对环境污染 。总之 ,该工艺较
适合工业规模化提取柿叶总三萜及生产熊果酸。
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