全 文 ：检测分析
比色法测定柿叶中总黄酮的含量
王莲，米沙，庞文悦，罗威，张荣泉*
（天津市医药科学研究所，天津 300020）
摘 要：利用黄酮类化合物可与金属离子形成有色螯合物的原理，建立柿叶中总黄酮含量测定方法，并且对供试品制
备方法进行选择。通过正交试验设计选取最佳供试品制备条件，采用分光光度法，KAc-AlCl3体系与供试品中黄酮提
取物反应，选择最大吸收波长，以芦丁为对照品制作标准曲线，并做方法学考察。供试品制备：提取液 70 %乙醇溶液，
提取时间 75 min，供试品与乙醇溶液的固液比为 1∶50（g/mL），用 KAc-AlCl3体系比色法测定供试品柿叶中总黄酮含
量为 1.13 %，重复性 RSD=1.86 %（n=6），平均回收率为 99.23 %，RSD=0.27 %（n=5）。KAc-AlCl3体系比色法测定柿叶
中总黄酮含量的方法可行，呈色稳定，操作简便，可作为柿叶中总黄酮的含量测定方法，并可以做为快速测定方法应
用于生产中对总黄酮含量的监控。
关键词：比色法；总黄酮；正交试验；柿叶
Determination of Total Flavone in Diospyros Leaves Via Colorimetry
WANG Lian, MI Sha, PANG Wen-yue, LUO Wei, ZHANG Rong-quan*
(Tianjin Institute of Pharmaceutical and Medical Sciences, Tianjin 300020, China)
Abstract：To establish the methods of determination of total flavones in diospyros leaves according to colorful
chelate formed by flavone and metal ion and choose the optima conditions on sample preparation. Optima
conditions of sample preparation were determined by mating design; spectrophotometry was conducted; KAc-
AlCl3 system was reacted with flavones extract from samples; the maximum wavelength was selected; standard
curve was made with Rutin-the control article; and methodology was investigated. Sample preparation was under
the condition of 70 % ethanol, extraction 75 min, and the ratio of solid to liquid was 1∶50; the content of total
flavones was 1.13 % in diospyros leaves via KAc-AlCl3 system colorimetry and RSD was 1.86 % (n=6); the average
recovery rate was 99.23 % and RSD was 0.27 % (n=5). The method of determination of total flavone in diospyros
leaves via KAc-AlCl3 system colorimetry was feasible with stable color and simple conduction, which can be
used for the determination of the total flavonoids and be suitable for quick quality monitoring of diospyros leaves.
Key words：colorimetry; total flavone; mating design; diospyros leaves
作者简介：王莲（1982—），女（汉），研究实习员，硕士，主要从事天然
产品和保健食品的质量标准研究。
*通信作者
柿叶为柿科植物柿（Diospyros kaki L.f.）的干燥
叶。柿叶中含有丰富的 VC、黄酮、胆碱、有机酸、胡萝卜
素、多种氨基酸及铁、锌、钙等对人体健康有益的营养
成分[1]，并且已被作为原料制备成成药，用于治疗冠心
病、心绞痛等[2]。特别是柿叶中所含的黄酮类成分，对
高脂血症大鼠脂质代谢紊乱有显著调节作用，对防治
高脂性脂肪肝有良好作用 [3]，已被认为是柿叶中的主
要功效成分之一，受到重视。
在含有柿叶的配方制剂中，通常以总黄酮作为质
量标准研究中的有效成分进行含量测定，但测定方法
一般都采用加热回流制备含柿叶的供试品溶液，用时
过长，不适于生产过程中原料、中间产品的质量监控。
因此，本文拟建立一种快速简便的方法对柿叶中的总
黄酮的含量进行测定。
黄酮类化合物在适当的 pH条件下，能与金属铝
离子形成稳定的黄色螯合物，利用此特性，建立了柿
叶中总黄酮含量的比色法测定，其方法是以芦丁为对
照品，应用醋酸钾-三氯化铝反应体系测定其含量[4]。
并对测定样品的制备方法进行了考察和筛选，为柿叶
食品研究与开发
Food Research And Development
2012年 6月
第 33卷第 6期
122
原料质量控制提供了有效成分指标的检测方法。
1 材料与仪器
1.1 试药
芦丁对照品：中国药品生物制品检定所；柿叶：采
自蓟县黄崖关，经鉴定为柿科植物柿的干燥叶；无水
乙醇，乙酸乙酯，醋酸钾，三氯化铝：均为分析纯，天津
市化学试剂公司；实验用水为纯化水。
1.2 仪器
SPECORD 210 PLUS紫外分光光度仪：德国耶拿；
KQ-100型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；
LDZ5-2离心机：最高转速 5 000 r/min，北京京立离心
机有限公司；AB204-E型电子天平：万分之一精度；小
型三用水箱：北京西城区医疗器械厂。
2 方法与结果
2.1 溶液制备
2.1.1 对照品溶液的制备
在室温 25 ℃条件下，精密称取芦丁对照品
20.70 mg，置 100 mL量瓶中，加 50 %乙醇约 80 mL，摇
匀，超声 10 min，使之完全溶解，定容至刻度，得芦丁对
照品储备液（0.207 0 mg/mL）。
精密量取该储备液 25.00 mL置 50 mL量瓶中，用
50%乙醇稀释至刻度，得芦丁对照品溶液（0.103 5 mg/mL），
备用。
2.1.2 供试品溶液的制备
精密称取粉碎后的干燥柿叶供试品 1.00 g，按照
正交试验设计表拟定的乙醇溶液浓度、用量加入，称
重，进行超声处理，冷却至室温，再次称重，用相应浓度
乙醇补足重量，过滤。取滤液 10 mL，水浴蒸干，用 pH13
的 NaOH溶液定量溶解，离心（3 000 r/min，15 min），取
上层清液，用 HCl调 pH至 4，加乙酸乙酯萃取 3次，
每次 10 mL，合并乙酸乙酯液，水浴蒸干，用乙醇溶解
并定容至 10 mL，得供试品溶液[5]。
2.2 供试品溶液提取条件选择
2.2.1 因素与水平
为考察供试品溶液制备条件，以总黄酮含量为指
标作 L9（33）正交试验，试验因素分别为：超声时间（A）、
乙醇浓度（B）、供试品与提取溶液的固液比（C）。试验
因素水平见表 1。
2.2.2 试验与结果
依照 L9（33）正交表设计方案，按 2.1.2项下操作过
程进行供试品溶液的制备，以柿叶总黄酮含量为指标
进行分析，结果见表 2。
由表 2可知，A、B、C 3个因素对柿叶总黄酮提取
的影响程度不同，R值大小依次为 RB> RA=RC，乙醇浓
度影响最大，供试品超声时间和供试品与乙醇溶液的
固液比影响较小。根据正交试验直观分析结果，选择
柿叶中总黄酮比色测定方法供试品制备最佳条件为
A3B2C2，即 70 %的乙醇，超声提取时间 75 min，供试品
与乙醇溶液的固液比为 50倍。
2.3 方法学考察
2.3.1 测定波长的选择
取芦丁对照品溶液 5.0 mL，加入 1 %醋酸钾溶液
5 mL，摇匀，再加 2.5 %三氯化铝溶液 3 mL，摇匀，放置
30 min，以试剂为空白，用紫外分光光度仪选择波长，
在 200 nm~700 nm范围内扫描，扫描结果见图 1。
结果显示芦丁对照品在 414.2 nm处有最大吸收，
故选择 414.2 nm波长为测定波长。
表 1 试验因素水平表 L9（33）
Table 1 Experiment factor lever L9(33)
水平
因素
A 超声时间/min B 乙醇浓度/% C 固液比/（g/mL）
1 45 50 1∶30
2 60 70 1∶50
3 75 90 1∶70
表 2 正交试验设计和结果 L9（33）
Table 2 Orthogonal experiment table and results L9(33)
试验编号 A超声时间 B乙醇浓度 C固液比 总黄酮含量/%
1 1 1 1 0.90
2 1 2 2 1.14
3 1 3 3 0.92
4 2 1 2 1.02
5 2 2 3 0.96
6 2 3 1 0.98
7 3 1 3 1.10
8 3 2 1 1.07
9 3 3 2 0.92
K1 2.96 3.02 2.95 -
K2 2.96 3.17 3.08 -
K3 3.09 2.82 2.98 -
R 0.13 0.35 0.13 -
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
吸
光
度
A
250 300 350 400 450 500 550 600 650
波长/nm
图 1 芦丁的波长扫描图
Fig.1 The wavelength scanning of rutin
检测分析 王莲，等：比色法测定柿叶中总黄酮的含量
123
2.3.2 标准曲线的绘制
分别精密吸取芦丁对照品溶液 0.25、0.50、1.00、
2.00、3.00、4.00、5.00 mL于具塞试管中，分别加入70 %
乙醇稀释至 5 mL，再依次加入 1 %醋酸钾溶液5.0 mL
及 2.5%三氯化铝溶液 3.0mL，摇匀，放置 30min，以试剂
为空白，进行吸光度测定，测定波长为 414.2 nm，以吸光
度对芦丁含量作标准曲线，得回归方程 A=2.597C-
0.006 4，r=0.999 6(n=7）。结果见表 3、图 2。
2.3.3 精密度试验
取同一对照品溶液分别显色测定 6次，测定结果
吸光度值的 RSD=0.08 %（n＝6），结果见表 4。
2.3.4 重复性试验
精密称取同一批供试品 6份，依法制备供试品溶液，
分别吸取供试品溶液 1.5 mL至具塞试管中，用 70 %
乙醇稀释至 5 mL，自加入 1 %醋酸钾溶液 5 mL后按
照标准曲线项下操作，测定结果总黄酮含量的 RSD=
1.86 %（n＝6），结果见表 5。重复性试验结果显示，本批
采集柿叶供试品总黄酮含量不高于 1.50 %。
2.3.5 加样回收试验
精称供试品 1.00 g，依法制成供试品溶液，精密吸
取该供试品溶液 1.5 mL至具塞试管中，按表 5分别在
各管中加入一定量的芦丁对照品溶液，测定总黄酮含
量，计算回收率，结果见表 6。
2.3.6 稳定性试验
精称供试品 1.00 g，依法制成供试品溶液，按照表 6
时间设置，分别测定其吸光度，结果见表 7。
3 讨论与结论
1）本方法以芦丁为对照品，黄酮在 KAc-AlCl3络
合反应体系中生成物为黄色，在 414.2 nm处有最大吸
收值，线性关系好，呈色在 90 min内稳定，而且操作简
便，重复性好，可以用于柿叶中总黄酮含量测定，为其
黄酮量性分析提供了具有参考价值的方法。
2）已报道的柿叶中总黄酮测定多采用加热回流的
方法制备供试品溶液[6]，操作复杂，耗费时间长，不适
用生产过程原料及制品的质量监控。本试验采用超声
表 7 稳定性试验
Table 7 Stability experiment
实验编号 时间/min 吸光度 相对标准偏差/%
1 0 0.445 5
2 10 0.445 4
3 20 0.445 5
4 30 0.445 5 0.03
5 40 0.445 7
6 60 0.445 4
7 90 0.445 3
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
吸
光
度
0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
芦丁加入量/mg
y=2.597x-0.006 4
R2=0.999 6
图 2 标准曲线的绘制
Fig.2 The drawing of the standard curve
表 4 精密度试验
Table 4 Precision experiment
实验编号 吸光度 柿叶供试品溶液制备/%
1 0.501 5
2 0.500 9
3 0.501 6 0.08
4 0.501 9
5 0.501 7
6 0.501 0
表 5 重复性试验
Table 5 Repeatability experiment
实验编号 总黄酮含量/% 平均值/% 相对标准偏差/%
1 1.11
2 1.12
3 1.15 1.13 1.86
4 1.13
5 1.16
6 1.11
表 6 回收率试验
Table 6 Recovry experiment
实验
编号
供试品
已知量/mg
芦丁
加入量/mg
测得量/
mg
总黄酮
含量/%
平均值/
%
相对
标准偏差/%
1 0.020 7 0.192 0 99.17
2 0.041 4 0.211 7 98.79
3 0.172 9 0.062 1 0.233 6 99.40 99.23 0.27
4 0.082 8 0.254 2 99.41
5 0.103 5 0.274 7 99.38
表 3 回归方程的计算
Table 3 The calculation of the regression equation
实验编号 芦丁加入量/mg 吸光度 回归方程 相关系数
1 0.025 9 0.065 7
2 0.051 8 0.136 9
3 0.103 5 0.254 7
4 0.207 0 0.515 0 A=2.597C-0.006 4 0.999 8
5 0.310 5 0.803 2
6 0.414 0 1.078 2
7 0.517 5 1.334 8
（下转第 127页）
检测分析王莲，等：比色法测定柿叶中总黄酮的含量
124
（上接第 124页）
提取方法，经试验测定与加热回流方法相比，对供试
品总黄酮的提取率无明显影响，正交试验中设定 3个超
声时间，45、60、75 min，试验结果确定超声时间 75 min，
较加热回流方法用时明显缩短。
3）根据文献报道 [5]，本试验进行了提取溶剂选择
的预试验，分别选用水、乙醇、甲醇以相同实验条件进
行柿叶中总黄酮的提取，结果表明乙醇的总黄酮提取
率最高，甲醇次之，水最低，故选用乙醇做为柿叶中总
黄酮的提取溶液。并将乙醇浓度作为正交试验考察因
素之一。
4）在柿叶供试品溶液制备方法的考察过程中，分
别使用 70 %乙醇与 90 %乙醇进行提取过滤，如滤液
未进行除杂步骤（酸碱处理及乙酸乙酯萃取）而直
接进行紫外测定，则 90 %乙醇提取液吸收度要大于
70 %乙醇，与滤液除杂后再进行紫外测定结果正好相
反。原因为随着提取液中乙醇浓度的增高，叶绿素等
杂质的提取量增多，对显色反应干扰增大，造成假象
结果，故超声提取后的滤液，采用除杂步骤是必要的，
以利显色测定的准确性，吸收度及总黄酮的含量更接
近真实值。
5）另外，采用酸碱处理及乙酸乙酯萃取，过程相对
繁琐些，对操作者的实验技能和水平要求较高，也使
得重复性实验中的相对标准偏差稍高（在 2 %以内），
但对于柿叶原料总黄酮含量的检测准确度影响不大，
表明本方法具有较强的可行性与实用性。
参考文献：
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收稿日期：2012-02-17
20
10
0
0 2 4 6 8 10 12 14
时间/min
7.
36
3
图 3 本方法样品测定色谱图
Fig.3 This method of the chromatogram of sample
150
100
50
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16
时间/min
3.
90
8
图 4 GB/T 15038-2006中柠檬酸测定方法样品测定色谱图
Fig.4 GB/T 15038-2006 Citric acid method for the determination
of the chromatogram of sample
99；2+98；5+95 3种。以本方法处理不同红葡萄酒、白
葡萄酒各 3个样品，共 6个样品分别以 3种流动相进
样。得到结果中，以甲醇+0.1 %磷酸溶液（1+99）为流动
相进样的样品分离效果最好（见图 3），柠檬酸峰周围
没有干扰、峰型最好。故最后采用 1+99的配比。
4 结论
经过试验验证，本方法通过对前处理和色谱条件
的优化，改善了国标测定葡萄酒中柠檬酸方法的不
足，从而得到准确的柠檬酸测定结果。
参考文献：
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收稿日期：2011-12-12
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
检测分析 张燕，等：葡萄酒中柠檬酸的液相色谱检测
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