全 文 ：摘 要:本实验研究了茶树根内生细菌的分离方法及对茶多酚的耐受性,并对内生细菌进行了初步的鉴定。结果表明,分
离茶树内生细菌时采用75%的酒精2min和2%次氯酸钠20min表面消毒处理,消毒彻底;含茶多酚的细菌营养平板可作
为茶树根内生细菌的选择性分离平板。茶树内生细菌对茶多酚的耐受浓度,最高不高于0.5g/L;经鉴定主要为芽孢杆菌
属(Bacilussp.)。
关键词:茶树根;内生细菌;茶多酚;耐受性
TheprimaryStudyontheMethodofIsolatingtheEndophyticBac-
teriainTeaRootandToleranceofTeaPolyphenols
LIJian-hua1,QIGui-nian1,TIANHong2,CHENShen-xiang1
(1ColegeofForestryandHorticulture,SichuanAgriculturalUniversity,Yaan625014,China;
2ColegeofResourceandEnvironment,SichuanAgriculturalUniversity,Yaan625014,China)
Abstract:Studyonthemethodofisolationofendophyticbacteriaintearootandtoleranceofteapolyphenols
wascariedoutinthisarticle. Theresultshowsthatitisappropriatetoadopt75% alcoholsolutionand
2% sodium hypocholoritesolutionassurfacedisinfection;Teapolyphenolmedium isusedasselective
medium.Thetoleranceconcentrationofteapolyphenolstotheendophyticbacteriaintearootisnothigher
than0.5g/L,theendophyticbacteriaaremainlyBacilus.
Keywords:Tearoot;Endophyticbacteria;Teapolyphenols;Tolerance
茶树根内生细菌的分离及其茶多酚耐受性的初步研究
李 建 华 1 齐 桂 年 1 田 鸿 2 陈 盛 相 1
(1四川农业大学林学园艺学院·雅安·625014;2四川农业大学资源环境学院·雅安·625014)
收稿日期:2007-12-03
作者简介:李建华(1984- ),女,河南许昌人,四川农业大学茶学系在读硕士研究生,主要从事茶叶研究。
植物内生细菌几乎存在于所有目前已研究的
植物中,它能在植株组织内占据有利生态位点或诱
导植株产生抗性,或与病菌直接相互作用,或通过
促生作用、固氮作用及作为外源基因载体导入植物
体内等生物学作用来保护寄主植物。近年来,国内
罗明[1]、崔林[2]、洪永聪[3]等分别从棉花、马铃薯块茎、
茶树叶片中分离筛选出具有生防作用的内生细菌
菌株。植物内生细菌已经成为植物病害生物防治的
一类极具应用潜力的新的资源菌,国内外有关研究
报道不断增加,主要涉及植物内生细菌的定植动态
研究、内生细菌种群多样性及种群动态研究和生物
学作用研究。国内茶树根内生细菌的研究尚未见报
道,仅有一篇关于对不同茶树品种的健叶和病叶上
分离的内生细菌进行了筛选和鉴定的报道[3]。本实
验采用3～4龄幼年期四川中小叶种茶树根为材料,
对茶树根内细菌进行了初步的分离和鉴定,为茶树
根内生细菌种群多样性研究及其应用奠定了基础。
1材料与方法
1.1材料
2006年4月6日于四川农业大学教学茶园随
机选取四川中小叶种3～4龄幼年期茶树主根和侧
根,装入盛有无菌水的容量瓶中,带回实验室。
1.2方法
1.2.1分离用培养基
茶 叶 通 讯
TEACOMMUNICATION
第35卷第1期
2008年3月
Vol.35,No.1
March,2008
李建华等:茶树根内生细菌的分离及其茶多酚耐受性的初步研究第1期 15
图1牛肉膏蛋白胨平板上内生细菌菌落形态
Fig.1Thecolonyappearanceofendophytic
bacteriaonbeef-extractpeptonemedium
牛肉膏蛋白胨培养基[4]:牛肉膏5g,蛋白胨10g,
NaCl5g,琼脂 20g,蒸馏水 1000ml,pH7.2,121℃～
126℃下灭菌40min,备用。
茶多酚培养基:茶多酚 4.2146g(纯度为
94.91%,相当于纯度为100%的茶多酚4g)加入装有
100ml灭菌水的容量瓶中,分装于5个装有180ml
灭菌的牛肉膏蛋白胨培养基的容量瓶中,振荡摇
匀,制成茶多酚培养基,备用。
1.2.2样品的表面消毒
将茶树主根侧根表面用无菌水洗净,在无菌操
作台上,依次用75%的酒精和2%次氯酸钠或用0.1%
的升汞作为表面消毒剂处理2min,20min和5min,再
用无菌水漂洗5次。为了检验灭菌效果,将最后一
次漂洗过的无菌水“之”字型划线于牛肉膏蛋白胨
平板、茶多酚培养基平板,29℃倒置培养7d后,若发
现培养皿中无菌落出现,证明根表面消毒彻底。
1.2.3内生细菌的分离
用灭菌的镊子将表面消毒彻底的茶树主根、侧
根的韧皮部剥去,再用灭菌剪刀剪去主根、侧根的
两端,将茶树主根、侧根置于装有灭菌水的培养皿
中,接种环在酒精灯上灭菌后,蘸取内生细菌稀释
液“之”字型划线于牛肉膏蛋白胨平板、茶多酚培养
基平板,29℃培养箱中倒置培养3d,根据平板上菌
落的形态挑取不同单菌落,平板划线纯化镜检。
1.2.4茶树根不同部位内生细菌数量的测定
采用稀释平板记数法。先用灭菌的镊子将表面
消毒彻底的茶树主根和侧根的韧皮部剥去,用灭菌
剪刀剪去侧根和主根距地表0～5cm,5～10cm,10～
15cm的两端,再用灭菌的抗高温塑料膜分别包好,
每个处理样分成两份,一份称湿重;一份称干重。将
称湿重后的侧根和主根分别置于装有10ml灭菌水
的试管内静止30min,制成10-1的菌悬液,再用灭
菌移液管吸取1ml1:10的上清液于装有9ml灭菌
水的试管中,振荡混合均匀,制10-2的菌悬液,如
此,制成10-1,10-2,10-3,10-4,10-5和10-6六个梯度,再
加入到冷却至45℃左右的牛肉膏蛋白胨培养基
中,转动平皿混合均匀,每个梯度重复三次,29℃倒
置培养48h。
1.2.5茶多酚浓度梯度的配置
将纯度为94.91%的茶多酚配成质量浓度为
0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5,6.0,6.5和
7.0g/L的14个梯度,备用。
1.2.6抑菌实验
菌悬液的配制:用灭菌移液管吸取lml1:10
的菌悬液(内生细菌数量约为2.74×107cfu/ml)装
入盛有9ml灭菌水的试管中,重复三次,制成
30ml1:100的菌悬液,备用。
抑菌实验:采用平板打孔药敏法[5]。
2结果与分析
2.1两种表面消毒方法比较
采用两种消毒方法:一种消毒方法是采用
0.1%的升汞液,另一种是采用75%的酒精结合2%
次氯酸钠作为表面消毒剂处理,前者分离到的内生
细菌的种类和数量均相对少于后者,这说明0.1%
的升汞液的消毒能力虽然强于75%的酒精和2%
次氯酸钠,但是有可能将茶树根内生细菌杀死一部
分,所以采用75%的酒精和2%次氯酸钠作为表面
消毒剂处理较为适宜。
2.2不同培养基上内生细菌的生长状况
从图1和图2可以看出牛肉膏蛋白胨平板和
茶多酚平板上内生细菌的生长状况,采用稀释平板
计数法[6]对牛肉膏蛋白胨平板和茶多酚培养基平板
上的内生细菌进行了计数,前者为2.84×106cfu/ml,
后者长势较弱,为2.66×104cfu/ml。
图2茶多酚平板上的内生细菌菌落形态
Fig.2Thecolonyappearanceofendophytic
bacteriaonteapolyphenolsmedium
第35卷16 茶叶通 讯
2.3茶树根不同部位内生细菌数量比较
采用稀释平板计数法[6]对茶树根不同部位的
内生细菌进行计数,结果表明,侧根和距地面5～
10cm,10～15cm主根内生细菌的数量较多,分别
1.35×104cfu/g、1.43×104cfu/g和 2.30×14cfu/g,距
地面 0～5cm主根内生细菌的数量较少为 3.72×
102cfu/g。可能因为茶树主根系在距地面0～15cm
的土层中,随着土层的增加内生细菌的数量越多,
田永辉等[7]研究表明0～20cm土层茶树根系活力
最强,根系活力强则根际分泌物多,根际微生物种
类和数量丰富,而离茶树根尖越近的主根部位生
活力较强,定植在茶树根内的内生细菌的数量相
应地也在增加。
2.4内生细菌对不同茶多酚浓度的耐受性
由下图可知,随着质量浓度的增加,茶多酚的
抑菌活性增强,抑菌圈直径随茶多酚浓度的增加而
扩大。当茶多酚质量浓度在0.5～7.0g/L时,有较明
显的抑菌圈。在较低质量浓度0.5～2.0g/L范围内呈
明显的剂量依赖效应,当茶多酚质量浓度增加到
2.0g/L以后,抑菌圈由小增大就已经比较平缓。茶
多酚对茶树根的最低抑菌质量浓度 (MIC)不高于
0.5g/L,最佳抑菌质量浓度在1.5～2.0g/L。
2.5内生细菌的鉴定
对茶树主根和侧根分离得到的25株内生细
菌菌株形态和生理生化两方面进行了鉴定,结果表
明,上述菌体均为杆状,菌落乳白色或桔黄色、圆
形、扁平,中等或大,表面光滑,不透明;有的中央隆
起,革兰氏染色阳性,周生鞭毛,产芽孢、芽孢椭圆
形、在菌体中央或一端形成,兼性厌氧,接触酶阳性
等。参照东秀珠等编著的《常见细菌系统鉴定手册》[8]
的方法,初步鉴定茶树根内生细菌主要为芽孢杆菌
属(Bacillus sp.)。
3讨论
采集茶树主根侧根时,应尽量减少污染机会,
减少消毒剂对茶树根内生细菌的影响,最大限度的
分离根内生细菌。通过茶树根不同部位在培养基上
的生长状况,初步推测茶树根内生细菌存在于根木
质部和韧皮部之间的形成层中。茶树根不同部位内
生细菌数量不同,可能是因为侧根和距地面5～
10cm,10～15cm的主根比距地面0～5cm的主根生
长活性强,内生细菌在前者的定植能力大于后者,
所以内生细菌的数量前者多于后者。植物内生细菌
与宿主植物是协同进化的,它所产生的生物活性物
质如抗生素类物质、植物生长刺激因子和病程相关
蛋白(PR)等,在植物体内不仅起直接诱导植物抗
性、参与植物其他防御反应的作用,同时,对某些特
殊用途的植物(如药材植物),内生细菌的某些种群
可能具有合成某些药用成分的能力,这为开发这类
细菌资源提出一条新的途径。总之,对茶树内生细
菌与植物的相互作用机理、茶树体内多种内生细菌
之间的相互关系的研究及茶树内生细菌与病原菌
之间的作用机制等的进一步研究,将有助于推动茶
树有益微生物资源的开发和应用。
参考文献
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8东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:中国科学出版
社,2001.
抑
菌
直
径
(
m
m)
抑菌圈直径 抑菌率
抑
菌
率
(
%
)
茶多酚浓度(g/L)
图3茶多酚浓度对内生细菌抑制效果
Fig.3 The effect of tea polyphenols anti-
microbial activities on endophytic bacteria