全 文 ：第 8卷第1 期
1 9 9 2年 2月
生 物 化 学 杂 志
C hi ne e s Bio e he m ie a l Jo u r na l
Vo l
.
s, N o
D e e
. ,
1 9 9
岩豆 (M玄王艺e t t玄a d￡e艺S玄a n a H a r m S e x D 主e zs )
凝集素的分离纯化和性质研究
曹仲奎 郑 建 刘荣华
(四川大学生化教研室 , 成都 6 10 06 4 )
摘要 用猪甲状殊球蛋白一S e Ph a r o s e 4 B 作亲和吸附荆 , 再经 S e Ph a d e x G一 10 0 凝胶
过滤 , 可以从岩豆种予 中纯化 出岩豆凝集紊 ( M D )L 。 该凝集素可以凝集人类 A 、 B 、
0 型血细胞和 兔红细胞 , 纯化的 M D L 提集兔红细胞的能力可被 D一松三格 、 邻峭基
一苯阶一 D一丰乳粉和N 一乙耽丰乳箱胺抑制 , 甘落格也有弱 的抑制作用 。 纯化的 M D L
在 P A G E 和 S D S一P A G E 上均显现单一蛋有质染色带 , 经 sc ih f ` , 试荆染 色证明为
格蛋白 , 以阶 一硫酸法浏得共中性箱含全为 6 . 0% ; SD S一 P A G E 浏得 亚 基分子童为
3 2 0 0 0 , s e p h a d e x G一 1 0 0 分予筛柱沮1得其分予童为 6 5 8 0 0 , 等电采焦 电泳显示其等
电 .点为 5 . 1 ; 氮基酸组成分析表明共中 A sP 、 lG u 、 P h e 含蚤较高 , 但不含有 rP 。 、 T yr 。
M D L 也是一个孩促有练分裂原 , 对人外周血沐 巴细胞 转化率可达 81 . 2% , 细胞分
裂比率达 1 4 . 8 % 。
关扭词 : 凝某素 , 箱蛋白 , 岩豆狂某素
凝集素是一类不同于免疫球蛋白的搪蛋白或蛋白质 , 能与糖专一性地 、 非共价 、 可逆地
结合 。 许多豆科植物中都含有性质各不相同的凝集素 【` ’ , 某些凝集素与 A B H 血型物质直接
相关 〔 2〕 。 自七十年代以来 , 对凝集素的理化性质以及其生物学功能的研究 已经引起人们的广
泛注意 , 纯化的凝集素 日渐增多 t一 ` ] 。本文报道从岩豆种子中分离纯化岩豆凝集素 ( M D )L
及其理化 、 生物学性质的研究结果 。
材 料 和 方 法
一 、 材料
岩豆 (M i l l e“ `a d i e l s万a n a H a r m s e x D ie l s ) 采 自四川城 口山区 , 十至十一 月成熟的种子 。
新鲜正常人血得自成都市中心血站 , 兔血球采自本校饲养场 。 红细胞以生理盐水溶液洗涤三
收摘 日期 . 1 9 0 0一 0卜 0 6 , 修回 日期 . 1 9 9 0一 1 2一 2 0
DOI : 10. 13865 /j . cnki . cj bmb. 1992. 01. 015
次 。 A O B血型 由本实验室用标准方法鉴别。
D一松三糖 、 0一 N仇一苯酚一 D一半乳糖 、 N一乙酞半乳糖胺 、 甘薄糖和猪 甲状腺球蛋白购自
s i g m a ; S e P ha o s e r 4 B
、
S e p ha de xG一1 0 0、 Am p ho li e n购自 p ha rm a e i a ; + 二烷基磷 酸钠购自
se y r。 ; 蛋白质标准品购自上海生化所东凤试剂厂 ; 实验用其它试剂皆为分析纯或化学纯 。
二 、 方法
1
.猪甲狱腺球蛋白亲和柱的制备 :按 M a y i le 一 P fe ni ng ne r【, ’ 的方法制备 。 亲和 吸 附剂
经 P B S 洗涤后 , 以生理盐水溶液洗涤 , 装柱并以生理盐水溶液平衡备用 。
2
.
M D L 的纯化 : 将岩豆种子 ( 1 0 0 9) 磨粉 , 在生理盐水溶液中浸取过夜 , 纱布过滤 ,
离心 ( 4℃ , 7 0 0 0 r / m i n , 3 0 m i n ) , 清液加入固体 ( N H 。 ) 2 5 0 ` 达 4 0% 饱和度 , 置 4℃过夜 , 同
前法离心 , 上清液继续加入 ( N H ; ) 25 0 `达 g0 %饱和度 , 放置过夜后 , 离心收集沉淀 , 并将其
溶于蒸馏水 , 透析除盐后 , 冷冻干燥得凝集素粗品 。
取粗品溶于生理盐水溶液 , 平衡透析 , 离心除去不溶物 , 取 20 m L (蛋白浓度约为 2% )
上猪甲状腺球蛋白亲和柱 。 用生理盐水溶液洗脱至流出液在 2 8 0 n m 处的吸收值小于 0 . 02 为
止 。 换用 0 . 1 m ol / L H人。 溶液解吸附 。 洗脱和解 吸附过程皆分部收集 , 流速为 18 m L / h ,
3一 4m L / P e r t u be 。 收集管经 2 8 0 n m 处测定后 , 以兔红细胞检查收集管的凝集活性 , (解吸附
部份收集管先以 N o H CO :中和 ) , 合并有活性部份 , 透析 , 冷冻干燥 。
凝胶过滤纯化凝集素 : S eP h o d e x G一 1 0 经溶胀后装柱 ( 10 0 x 1 . 6 o m ) , 以生理 盐水溶液
平衡 。 将亲和层析样品用生理盐水溶液溶解 (浓度约为 2% ) , 平衡透析后上柱 (约 10 m )L ,
生理盐水溶液洗脱 , 分部收集。 流速为 12 m L / h , 3 m L / eP r t ub e , 经 2 8 o n m 处测定后 , 以兔
红细胞检测凝集活性 , 合并有凝集活性部份 、 透析 , 冷冻千燥后 , 将此样品进行以下各项测
定 。
3
· 聚丙烯酞胺凝胶电泳 ( p ^ e E ) 检测 : 参照 B . D . H a m e s 和 D . R i e k w o o d [8 ]的方法 。
经不连续的低 P H 和高 P H 凝胶 电泳 (分离胶浓度皆为 7 . 5% ) 。 胶条在 7 % H A 。 中脱色保存 ,
双波长薄层扫描仪 ( s h i m a d z u , D u a lw a v e l e n g t h T e l S e a n n e r , C s一 9 1 0 ) 扫描记录 。
4
. 亚基分子量测定 : 按 W eb er 【。 ] 的 S D S一 P A G E 法测定 。
5
.
se Pha de
x G一 10 0 分子筛柱测定 M D L 的分子量 : 按文献 〔” , 的方法 , 以有效分 配系
数 K va 计算出 M D L 的分子量 。
6
. 凝集活性测定 : 在微量稀释板上用 25 拼L凝集素 ( l m g /m )L 与等量生理盐水溶液进
行系列稀释 , 加入 2%血球悬液 25 ” L , 振摇后 25 ℃静量 h2 , 显微镜下检查结果 。
7
. 糖的抑制作用 : 凝集素样品系列稀释后加入 80 m m ” l/ L的搪液 25 拜L , 混匀 , 25 ℃放
置 30 m in , 再加入 2 5” L血球悬液 , 振摇 , 25 ℃放置 h2 , 显微镜下检查结果 。
8
. 中性精含量侧定 : 以葡萄糖作为标淮 , 按 D ub io , 等的酚一硫酸法 f ` “〕侧定 。
9
. 氨基酸组成分析 : 酸水解凝集素样品 , 日立 8 35 型氨墓酸自动分析仪侧定。
10
. 等电聚焦电泳测定等电点 : 按文献 t ’ 2】的方 法 测定 。 A m Pho h en 的 PH 范围为 PH 4 -
1 0
, 胶浓度为 7 . 5% , 三氛醋酸固定过夜 , 多次换 固定液洗去 A o Pho il en , 考马斯亮兰 R一2 50
染色 4 h , 7 % H A 。 漂洗脱色 。
1 1
. 促有丝分裂活性测定 : 用人外周血淋巴细胞培养 , 按 h ho 等的方法 〔川 测定 。
结 果 和 讨 论
一 、 报集案的纯化
MD L的纯化主要有三个步骤 , ( l) 浸取液经硫酸接分级沉淀 , 在饱和度为 40 一90 %时 ,
凝集素被沉淀出来 ,得到 M D L 粗品 。 (2 ) 以猪甲状腺球蛋白一 s e p h o r os e 4 B 作为亲和吸附荆 ,
可对 M D L 粗品进行纯化 , 结果见 iF g . 1 。 生理盐水溶液洗脱 部 份 无技集兔红细胞的活力。
用 0 . l m ol / L H A。 解吸附可获得具有强凝集活力的 M D L 。 ( 3) 经亲和 层 析后的 M D L 还含有
微 t 杂蛋白 , 用 S eP h o d e : G一 10 分子筛柱进一步纯化 , 结果见 iF g . 2 。 图中仅 A峰具有挽集
A e t iv i t y ep a k
.0.0.-.0“哎
O 。 1 , 0 1 / L N a e l
A e t士吐 t y P e ak
1 0 2 0 3 0 40 5 0
.20.1,.10.,
基月哎
1 0 2 0 30 切 50 1 0 2 0 30 切
下 r a e t l o n n u口 b e r F t扭 Ct io n n U m be t
F19
.
1 A f f i n i t y e h r o m a t o g r a p h y o f M D L o n
P o r e i n e t h y
r o g l o b u li n
一
S
e P h a r o
s e 4 B e o l u m n
.
C o l u m n : z s x z
.
s e m
,
F l o w
r a t e : 1 8m L / h
-
4m L / P e
r 七u b e
F 19
.
2 G
e l f i l t r a 七i o n o f M D L o n S e p h a d e x
G一 1 0 0 C o l u m n 一 1 00 x l . 6e m , F l o w r a t e -
1 2m L / h
,
3m L / P e r 乞u b e
活性。 M D L 的亲和层析组份在高 P H 不连续 P A G E 上给出两条 蛋白质带 , 但在低 P H 不连续
P A G E 上仅显示一条蛋白质带 , 其电泳结果见 iF g · 3 ( b ) 、 ( d ) 。 推究原因 可 能是由于 M D L 的
等电点为 5 . 1 , 接近低 p H 不连续 P A G E 的电极缓冲液 pH S . 4 , 而所含的微量杂蛋白其等电点
又可能与 M D L 的等电点接近 , 从而造成电泳分辨 率降低所致 。 M D L 亲和层析组份经 S eP h -
F ! 9
.
3 P o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e t l e p a t t e r n
. e l e e t r o p h o
r e t i e s e a n n i n g d ia g
r a m o f M D L
( a ) e
r u d e l e e t i n
,
( b ) ( d ) a f f i n i t y f r a c t i o n
,
( e ) ( f ) g e l f i l t
r a t i o n f
r a e 七i o n , ( e ) r e f e r e n e e p r o t e i n .
E l e e t r o P h o
r e s i s c o n d i t i o n , ( a ) ( b ) ( e ) P H S
.
3 T r i
s 一
G l y b u f f e r
,
g e l 7
.
5%
,
3m A / P e r g e l
,
f o
r s h
.
( d ) p H ` . 5 H A e 一 A l a b u f f e r , g e l 7 . `% , s m A , p e r g e l , fo r 12 h . ( e ) ( f ) S D S 一 P A G E P H 7 . 2 , o . l m o l / L
P h o . P h碑t e b u f f e r 一 g e l 工0% , 咯m A / Pe r g e l , fo r 母h
a de xG 一1 0进一步纯化后 , 在分辨率较高的高 P H 不连续 P A G E上仅显示一条蛋白质染色带 ,
见 iF g . 3 c( ) 。 以上结果说明经过三个纯化步骤 , 获得了在 P A G E 上均一的 M D L 。
二 、 MO L 的血型专一性
M D L 经贬胶过池纯化后 , 其凝集活性见 aT lb ” l , 从表中可见 , M D L 无血型专一性 , 但
对 B 、 O 型血细胞的跳集能力较兔红细胞和 A 型血细胞为弱 。
T a b l e 1 H e m a g g l u t i n a七i n g a e t i v i七y o f M D L
B乙
O甘
A.4B l
o o d g
r o u P
P u
r iif e d l e e t i n
(产 g /产 L )
r a b b i t
0
.
4 9
三 、 抽的抑制作用
有关凝集素的抑制搪列于 aT bl e Z , 甘薄糖所表现的抑制作用较弱 , 而松三精 , 猪甲抉腺
球蛋白 , 卵枯蛋白等的抑制作用较强 。
T a b l e I n h i b i t i o n o f a g g l u 乞i n a t i o n b y s u g a r s
C
o n t r o l
D
一
M e l i z i t o s e 8 0 m m o l / L
O
一
N O
: 一 P h e n o l
一
D
一
G
a
l 8 0
m m o l / L
G a l N A e 8 0m m o l / L
M a n n o s e 5 0 m m o l / L
P o r e i n
e t h y r o g l
o b u l i n 3%
o v o m u e i n 3%
十 +
+ +
四 、 M O L 的理化性质
M D L 在 s D s一 P A G E 上给出单一蛋白质带 , 见 iF g · 3 ( f) 表明 M D L 是含一种亚基 , 与标
准蛋白比较 , 通过相对迁移率 ( R f ) 计算出亚基分子量为 3 2 0 0 0 ( F i g · 4 ) 。经 s e Ph a d e x G一 10 0
凝胶过滤 , 应用有效分配系数 ( K va ) , 可计算出 M D L 分子量为 63 8 0 0 ( iF g . 5) 。 由此可以确
定 M D L 分子是由两个相同的亚基组成 ( 3 2 00 x 2) 。
M D L 是一种糖蛋白 , 其分子中含中性精量约为 6 . 0 % 。
M D L 的氨基酸组成分析结果见 T a b l e 3 。 从表中可见 M D L 不含 T y r 和 p r o , 但 A s P 、 G l u 、
P h e 含量较高 , 尤其是 A sP 含量高达 24 . 92 % 。
M D L 的等电聚焦电泳显示 两 条蛋白质染色带 , 其中一条染色很深 , 另一条 染 色 较 弱
( iF g
.
6)
, 可见在 P A c E 和 s D s 一 P A G E上呈现均一性的 M D L , 经等电聚胶电泳后出现不 均
一性 , 其原因可能是由于 M D L 的肤链或 精 链上的微不均一性所致 。 由于肚链中的个别氨基
酸或搪链糖基的微小差异 , 在 P人G E 上还不能显现 , 但在分辫率更高的等电聚焦电泳上表现
0母
l of
i
0
.
10
.
2 0
.
30
.
4 0
.
0 5
.
06
.
78 0
R f
J,甘
乙工X李龙
M W X 1 0
.
F 19
.
4 M o l e e u l a r w e i g h 七d e 七e r m i n a t i o n o f 七h e
. u b n u it 日 o f M D L b y S D S一 P A G E
U a in g 七h e f o l l o w i n g e a l i b r a t i o n p r o t e i n s .
( i ) P h o . p h o r y l a s e B ( 。4 00 0 ) , ( 2 ) B o v i n e
a e r u m a l b u m i n ( 6 7 0 0 0 )
,
( 3 ) A e t i n ( 4 3 0 0 0 )
,
(一 ) C a r b o n i e a n h y d r a s e ( 5 0 0 0 0 ) , ( 5 ) T M V e o a t
P r o 七e i n ( 17 0 0 0 ) , ( 6 ) M D L ( 3 2 0 0 0 )
F 19
.
5 M o l e e u l a r w e i g h t d e t e r m i n a t io n
o f t h e M D L o n S e P h a d e x G
一
1 0 0
.
U s i
n g 七h e f o l l o w i n g e a l i b r a t i o n P r o t e -
i n s : ( i ) P h o . p h o
r y l a 日 e B ( 9 4 0 0 0 ) , ( 2 )
B o v i n e s e r u m a l b u m i n ( 67 0 0 0 )
,
( 3 ) E g g
a l b u m i n (砚5 0 0 0 ) , ( ` ) C a r b o n i e a n h y d r a 日。
( 3 0 0 0 0 )
,
( 5 ) R N A s e ( 2 7 0 0 0 ) a n d ( 6 ) M D L
( 6 3 0 0 0 )
T a b l e 3 A m i n o a e i d e o m P o s i七i o n o f
M D L ( % )
A s p
T h r
S 6 r
G I U
G l y
A la
C y .
V a l
M 6 t
2名。 9 2
7
.
0 6
` 。 4 8
8
.
2 3
2
.
8 0
1
。
2 1
6
.
1 0
2
。
3 1
5
。
6 2
1 1.
L e U
T y r
P h e
L y s
N H .
H i 日
A r g
P r o
2
.
0 9
3
。
4 8
0
1 2
。
1 4
4
。
2 3
8
。
2 7
1
。
9 9
3
.
2 5
0
出不均一的两条蛋白带 , 其中染色较深的
等电点为 5 . 1 , 这是 M D L 的主带 , 染色很
弱的是等电点为 5 . 8 的弱带 , 可能即是微
不均一的 M D L 。
F l g
.
6 I s o e l e e t r o f o c u s i n g e l e e t r o p h o r e t ie
P a t t e
r n o f P u r i f i d M D L
五 、 M O L 的促有缘分裂活性
M D L 的促有丝分裂活性测定结果见 T ab le 4 。 其对人外周血淋巴细胞的转化率达 81 . 2% ,
细胞分裂比率高达 14 . 8 % , 且转化细胞的形状很好 。
根据 M D L 的糖专一性试验 , 猪 甲状腺球蛋白对 M D L 的凝血作用有较强的抑制 , 因此选
用猪甲状腺球蛋白作为配体制备亲和吸附剂 , 可以较好地从岩豆种子中纯化出凝集素 , 此法
操作过程简单 , 是一种比较理想的方法 。 对 M D L 的性质研究表明 , M D L 是由两个相同的亚
T a b l e 4 T h e a c t i v i t y o f t h e M D L i
n m i t o g e n e s i s
S a m P l e T r a n a fo r m e d e e l l
C e l l a i n
d i v i 日 io n T
o t a l e e l l .
T r a n . f o
r m a Li o n
r a t i o
D i v i s i o n
r 扭 t i o
M D L
P H A
1 6 8
5 3
1 1 3 5
6 2 5
8 1
.
2%
6 7%
1 4
. 已%
8
.
1%
P H A , p h y乞o h a e m a尽尽l u t i n i n
基组成 , 分子中 A 3 P 和 lG u 含量较高 , 等电点为 5 . 1和 5 . 8 , 因此 M D L 是一种酸性糖蛋白。
同时 M D L 又是一个强促有丝分裂原 , 不仅对淋巴细胞 的转化率高于 P H A , 而且细胞分裂比
率也远远高于 P H A , 达 14 . 8% , 同时处于分裂中期的细胞 , 其染色体形状细长 , 有利于用作
染色体的分带研究 , 这一结果 , 提示了 M D L 在细胞遗传学的染色体研究方面可能很有用途 。
根据我室应用异硫 氛墓荧光素标记的 M D L 对人精细胞 的研 究 , 证明 M D I J 对人精细胞有极
强的凝集作用 , 应用 M D L 作配体可用于人精细胞膜上受体的研究 。
参 考 文 献
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c 0 P r o t e i n
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I t s
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I t s h o w o m i t o g e n i e a e t i v i t y o n h u m a n P e r i P h e r a l b l o o d l y m P h o e y t e s
.
A m i n o a e i d a n -
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b u t n o P r o l i n e a n d t y r o s i n e e a n b e f o u n d i n t h e l e e t i n
.
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