全 文 ：网络出版时间:2015 － 6 － 5 11:22 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /34． 1086． Ｒ． 20150605． 1122． 009． html
荔枝壳原花青素对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡的作用及其机制研究
张晓晖1，孙智达2，李书艺3，曾繁典4，熊益群1，徐超英1，刘心亮1，林 坚1，穆桂萍1，徐绍钢1，刘文赫1
(1．深圳市中医院中医药研究所，广东 深圳 518033;2．华中农业大学食品科学技术学院，湖北 武汉 430070;
3．武汉轻工大学食品科学与工程学院，湖北 武汉 430023;4．华中科技大学同济医学院药理系，湖北 武汉 430030)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2015． 07． 009
文献标志码:A 文章编号:1001 － 1978(2015)07 － 0931 － 05
中国图书分类号:Ｒ-332;Ｒ284． 1;Ｒ322． 11;Ｒ329． 25;
Ｒ631. 022
摘要:目的 研究荔枝壳原花青素(Procyanidins extracted
from the litchi pericarp，LPPC)对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡
的作用及其机制。方法 实验大鼠随机分为 5 组，连续灌胃
两周:空白对照组(control)和脓毒症模型组(LPS)每天给予
蒸馏水灌胃 1 次;LPPC 低、中、高剂量组分别每天给予新鲜
配制的 LPPC 50，100，200 mg·kg －1·d －1灌胃 1 次。给药结
束后，建立脓毒症动物模型。即除空白对照组外所有大鼠腹
腔内注射 LPS(lipopolysacchride，10mg·kg －1，ip)诱导急性
脓毒症模型。4 h 后收集大鼠血清，检测血清同工酶(CK-
MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酶(AST /GOT)的活力。
取大鼠心肌组织，测定心肌组织丙二醛(MDA)、总抗氧化能
力(T-AOC)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量。TUNEL 染色观
察大鼠心肌细胞凋亡情况。Western blot 法检测凋亡相关蛋
白 Cleaved caspase-3 及 TNF-α 水平。结果 与正常对照组
(control)比较，脓毒症模型组大鼠血清 CK-MB、LDH、AST /
GOT以及心肌组织 MDA含量均明显升高(P ＜ 0. 01) ;同时，
心肌组织 T-AOC 和 GSH 的活力明显降低(P ＜ 0. 01) ;凋亡
心肌细胞数量明显增加(P ＜ 0. 01) ;Cleaved caspase-3 及
TNF-α表达水平明显下降(P ＜ 0. 01)。LPPC 预处理明显降
低了大鼠血清 CK-MB、LDH、AST /GOT 以及心肌组织 MDA
含量;增加了大鼠心肌组织 T-AOC和 GSH的活力;凋亡心肌
细胞数量明显减少;Cleaved caspase-3 及 TNF-α 表达水平明
显下降。结论 荔枝壳原花青素预处理能够明显减轻脓毒
症大鼠心肌细胞凋亡，可能与其抗氧化性损伤作用有关。
关键词:荔枝壳原花青素;脓毒症;心肌细胞;凋亡;氧化应
激;大鼠
收稿日期:2015 － 03 － 09，修回日期:2015 － 03 － 27
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81101450) ;深圳市科技
研发资金知识创新计划资助项目(No JCYJ20130329
155553734)
作者简介:张晓晖(1975 －) ，女，博士，副主任药师;研究方向:心血
管药理学、中药药理学，通讯作者，Tel:0755-88359666，E-
mail:767682665@ qq． com
原花青素是自然界来源丰富的多酚类植物化合
物，由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合而成。20
世纪中叶法国科学家马斯·魁勒首次阐明松叶泡汁
中的原花青素和维生素 C都是防治坏血病的有效物
质，从而为原花青素的应用指明了前景［1］。原花青素
广泛存在于多种植物中，目前已发现其在葡萄籽、莲
子壳、荔枝壳、松树皮、废弃油菜籽皮、蚕豆皮、沙棘
籽、高粱种皮、黑豆等中含量均较丰富。除了抗氧化
活性外，它还具有多种生物学活性，如抗炎［2］、抗肿
瘤［3］、保护心血管［4］等，其中以抗氧化及清除自由基
的功能最为突出。其抗氧化的效果远远优于维生素
C、维生素 E和 β-胡萝卜素等传统抗氧化剂。
荔枝(Litchi chinesis Sonn．)是无患子科常绿植
物所结果实，我国主要产于广东、福建、广西等地，是
亚洲特产水果，深圳的“南山荔枝”更是享誉海内
外。其营养丰富，味甜肉嫩，色泽鲜艳，素有“岭南
果王”之称。荔枝壳重量占果实总重的 16%左右，
含有多种活性成分，其药用价值很高，早在明朝李时
珍就曾在《本草纲目》中记载:果壳、果核可入药，治
鼻衄、疗疝气、止血止痛。近代的一些研究也提示荔
枝壳中富含类黄酮，如黄酮醇、花青素和原花青素等
生物活性物质。荔枝壳原花青素(Procyanidins ex-
tracted from the litchi pericarp，LPPC)是华中农业大
学食品科技学院天然作物实验室率先从荔枝果壳中
提取出，并通过结构鉴定和功能分析，确定荔枝壳中
的原花青素包括 A 型和 B 型两种，以 A 型为主，延
伸单元和末端单元为表儿茶素，通过 4→8，2→O→7
或 4→6，4→8 连接而成。目前研究发现，LPPC 具有
良好的抗氧化清除自由基［5］、体外抑菌活性［6］、抗
动脉粥样硬化作用［7］及抗癌活性［8］。本课题旨在
研究 LPPC是否对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡的具有
保护作用，并寻找其作用机制，从而找到其新的作用
靶点，为开发利用 LPPC 脓毒症心血管保护的功能
提供理论依据，寻找 LPPC的潜在利用价值。
1 材料与方法
1． 1 主要材料
·139·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Jul;31(7) :931 ～ 5
1． 1． 1 实验动物 健康成年♂ SD 大鼠，体质量
250 ～ 300 g，购自广东省实验动物中心。
1． 1． 2 药品 荔枝壳原花青素(LPPC)由华中农业
大学食品科学技术学院孙智达教授提供。LPPC 溶
解性好，可直接溶解于蒸馏水制成溶液，灌胃给药。
1． 1． 3 试剂 cleaved caspase-3 一抗、TNF-α 一抗
(Cell Signaling Technology) ，HＲP 标记二抗、ECL
(Forevergen) ，TUNEL 试 剂 盒 (Ｒoche) ，CK-MB
ELISA试剂盒(武汉华美生物工程有限公司) ;乳酸
脱氢酶(LDH)试剂盒、谷草转氨酶(AST /GOT)测试
盒、丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能力测定试剂盒、
还原型谷胱甘肽(GSH)测定试剂盒(分光光度法)
均为南京建成生物工程有限公司产品。
1． 2 分组与造模 实验动物适应性喂养 2 周后，随
机分为 5 组，连续灌胃两周:空白对照组(control，
CON)和脓毒症对照组(LPS)每天给予蒸馏水灌胃 1
次;LPPC低剂量组、中剂量组、高剂量组分别每天给
予新鲜配制的 LPPC 50、100、200 mg·kg －1·d －1灌
胃 1 次。
给药结束后，建立脓毒症动物模型。即除空白
对照组外所有大鼠腹腔内注射 LPS(10 mg·kg －1，
ip )诱导急性脓毒症模型。LPS处理 4 h 后，出现竖
毛、淡漠、腹泻等脓毒症体征的清醒大鼠被用于实
验。正常对照组动物注射生理盐水(1 ml·kg －1，
ip)。
4 h后，以 4%水合氯醛麻醉大鼠，打开腹腔，行
腹主动脉取血。全血经室温静置 2 h后 4℃ 1 000 ×
g离心 30 min，收集上清液，分装于 － 80℃冻存。摘
取心脏分为两部分，一部分用 4℃预冷的多聚甲醛
(PFA)固定;另一部分液氮冻存备用。
1． 3 检测指标
1． 3． 1 血清心肌酶学指标检测 血液离心后取上
清，按照试剂盒说明制作标准曲线，测定血清同工酶
(CK-MB)、乳酸脱氢酶(LDH)和谷草转氨酶(AST /
GOT)的活力。
1． 3． 2 心肌组织抗氧化能力检测 取左心室心肌
组织，制备组织匀浆，按照试剂盒说明制作标准曲
线，测定心肌组织丙二醛(MDA)含量、总抗氧化能
力(T-AOC)和还原型谷胱甘肽(GSH)含量。
1． 3． 3 TUNEL法检测心肌细胞凋亡 心肌组织固
定，制作蜡块切片，应用末端脱氧核糖核苷酸转移酶
介导的 dUTP缺口末端标记法(TUNEL)检测凋亡心
肌细胞。按照 TUNEL试剂盒说明书逐步添加试剂，
光学显微镜下观察、拍照。每个心脏观察 3 张切片，
每张切片随机选取 5 个非重叠的 400 × 高倍镜视
野，计算凋亡指数 AI(凋亡心肌细胞数 /心肌细胞总
数 × 100%) ，求其均值。
1． 3． 4 Western blot法检测凋亡相关蛋白水平 采
用预冷的 PBS 冲洗心室肌组织，冰上剪碎，充分匀
浆，以 5 000 r·min －1离心 10 min，弃上清后加入裂
解液，12 000 r·min －1离心 10 min，取上清于低温冰
箱保存。采用 BCA 法检测蛋白浓度。将蛋白与上
样缓冲液混匀后煮沸 10 min。每孔取 30μg 蛋白质
上样，行 15% SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，采用
半干转法转膜，加入 5%脱脂奶粉室温封闭 2 h，分
别加入 Cleaved caspase-3(1 ∶ 1 000)及 TNF-α(1 ∶
1 000)的一抗，4℃孵育过夜，同时以 GAPDH 作为内
参(1 ∶ 5 000) ，加入二抗(1 ∶ 3 000)室温孵育 1 h。
采用化学发光法进行胶片显影，采用 Image J进行目
的条带的光密度分析，最终结果以目的条带的光密
度与内参的比值作为最终结果。
1． 4 统计学分析 采用 SPSS 11. 5 软件进行统计
分析，计量资料以 珋x ± s 表示，组间均数比较采用方
差分析。
2 结果
2． 1 LPPC对脓毒症大鼠血清 CK-MB、LDH以及
AST的影响 CK-MB、LDH和 AST是一系列心肌损
伤血清标记物。如 Tab 1 所示，脓毒症模型组大鼠
血清 CK-MB、LDH 和 AST 各项指标相比正常对照
组都有明显的提高(P ＜ 0. 01) ，说明脓毒症能明显
提高大鼠血清心肌酶谱指标水平。经 LPPC 预处理
后，LPPC各剂量组均不同程度降低脓毒症大鼠血清
CK-MB水平(P ＜ 0. 05)。LPPC中、高剂量组能明显
降低脓毒症大鼠血清 LDH 水平(P ＜ 0. 05)。LPPC
高剂量组能明显降低脓毒症大鼠血清 AST 水平(P
＜ 0. 01)。说明应用 LPPC后，可在一定程度上改善
LPS诱导的大鼠心肌细胞损伤。
Tab 1 Effect of LPPC on serum CK-MB，LDH
and AST of septic rat (珋x ± s，n = 10)
Group CK-MB/U·L － 1 LDH/U·L － 1 AST/U·L － 1
Control 197． 21 ± 26． 92 350． 96 ± 22． 84 197． 19 ± 32． 22
LPS 257． 67 ± 29． 88＊＊ 775． 70 ± 38． 28＊＊ 402． 62 ± 26． 82＊＊
LPPC 50 mg·kg － 1·d － 1 230． 34 ± 21． 76△ 746． 12 ± 30． 69 377． 22 ± 40． 23
LPPC 100 mg·kg － 1·d － 1 227． 40 ± 33． 69△ 726． 64 ± 42． 87△ 353． 68 ± 50． 57
LPPC 200 mg·kg － 1·d － 1 218． 76 ± 38． 00△ 677． 06 ± 59． 59△ 331． 66 ± 54． 15△△
＊＊P ＜ 0. 01 vs control group;△P ＜ 0. 05，△△P ＜ 0. 01 vs LPS group
2． 2 LPPC对脓毒症大鼠心肌组织 MDA、GSH 以
及 T-AOC的影响 如 Tab 2 所示，脓毒症模型组大
·239· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Jul;31(7)
鼠心肌组织 MDA含量明显高于正常组(P ＜ 0. 01) ，
而 GSH 和 T-AOC 的水平明显低于正常组(P ＜
0. 01) ，说明脓毒症模型动物氧化应激水平高于正
常。经 LPPC预处理后，LPPC 各剂量组均不同程度
降低脓毒症大鼠心肌组织 MDA含量(P ＜ 0. 05 或 P
＜ 0. 01) ，并具有剂量依赖性。LPPC 高剂量组能明
显降低脓毒症大鼠心肌组织 GSH 含量(P ＜ 0. 05)。
LPPC中、高剂量组能明显降低脓毒症大鼠心肌组织
T-AOC水平(P ＜ 0. 05 或 P ＜ 0. 01)。说明应用 LP-
PC后，可在一定程度上改善 LPS诱导的大鼠心肌细
胞氧化应激水平。
Tab 2 Effect of LPPC on cardiac tissue MDA，GSH and
T-AOC of septic rat (珋x ± s，n = 10)
Group MDA/μmol·g － 1 Pro GSH/kU·g － 1Pro T-AOC/kU·g － 1Pro
Control 3． 63 ± 0． 44 22． 24 ± 2． 93 4． 30 ± 0． 48
LPS 7． 97 ± 0． 53＊＊ 14． 85 ± 2． 50＊＊ 2． 12 ± 0． 69＊＊
LPPC 50 mg·kg － 1·d － 1 7． 10 ± 0． 66△△ 14． 53 ± 3． 31 2． 33 ± 0． 50
LPPC 100 mg·kg － 1·d － 1 5． 98 ± 0． 73△△ 17． 36 ± 3． 77 2． 68 ± 0． 47△
LPPC 200 mg·kg － 1·d － 1 5． 38 ± 0． 70△△ 17． 55 ± 2． 40△ 3． 98 ± 0． 88△△
＊＊P ＜ 0. 01 vs control group;△P ＜ 0. 05，△△P ＜ 0. 01 vs LPS group
2． 3 LPPC对脓毒症大鼠心肌细胞凋亡的影响
TUNEL法染色检测心肌细胞凋亡的情况见 Fig 1。
与 Control 组相比，单纯 LPS 处理组大鼠心肌细胞
AI值明显上升(P ＜ 0. 01) ，说明脓毒症大鼠心肌中
有大量心肌细胞凋亡。LPS + LPPC 各处理组与单
纯 LPS 处理组相比，AI 值均不同程度下降(P ＜
0. 01) ，且具有剂量依赖性。说明应用 LPPC 后，可
有效抑制 LPS诱导的大鼠心肌细胞凋亡。
2． 4 LPPC 对脓毒症大鼠心肌组织 Cleaved
caspase-3 和 TNF-α 蛋白表达的影响 Cleaved
caspase-3 和 TNF-α蛋白在正常对照组(Control 组)
的大鼠心肌组织中几乎不表达。单纯 LPS 处理组
与 Control 组相比，Cleaved caspase-3 和 TNF-α 蛋白
表达水平明显升高(P ＜ 0. 01)。LPS + LPPC 各处理
组与单纯 LPS 处理组相比，Cleaved caspase-3 和
TNF-α蛋白表达水平均不同程度下降(P ＜ 0. 05 或
P ＜ 0. 01) ，且具有剂量依赖性。
3 讨论
脓毒症(sepsis)是由感染引起的全身炎症反应
综合征(systemic inflammatory response syndrome，
SIＲS) ，是创伤、烧伤、休克、感染、大手术等临床急
危重患者的严重并发症之一，也是诱发脓毒性休克
(septic shock)、多器官功能障碍综合征(multiple or-
gan dysfunction syndrome，MODS)的重要原因。脓
毒症合并心功能衰竭，死亡率高达 70% ～ 90%［9］，
临床救治相当困难。近来的研究发现，脓毒症心功
能不全与细胞凋亡［10］有关。凋亡是细胞在一定的
生理或病理条件下，受内在机制的控制主动结束生
命的过程，并伴随有典型的形态学改变，常涉及半胱
氨酸蛋白酶(caspases)或 TNF-α 等促凋亡介质的活
化。
我们的研究结果发现，与正常对照组大鼠比较，
脓毒症模型组大鼠凋亡心肌细胞数量明显增加，
caspase-3 及 TNF-α 表达水平明显下降(P ＜ 0. 01)。
LPPC 预处理能减少凋亡心肌细胞数量以及
caspase-3 和 TNF-α 的表达。可能与其抗氧化性损
伤有关。
最近的研究表明，氧化应激在脓毒症心肌细胞
凋亡的发生、发展过程中发挥了重要作用［11］。脓毒
症心肌可产生大量的活性氧(ＲOS) ，后者可导致心
肌细胞膜的脂质双分子层发生过氧化反应，使其功
能和活性降低，造成心肌细胞损伤;同时 ＲOS 也可
损害线粒体膜，引起 caspase-3 活化，继而启动凋亡
程序，导致心肌细胞损伤。
Fig 1 Level of rat cardiac myocytes apoptosis detected by TUNEL staining(珋x ± s)
＊＊P ＜ 0. 01 vs control group;△△P ＜ 0. 01 vs LPS group
·339·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Jul;31(7)
Fig 2 Expression level of rat cardiac tissue caspase-3 and
TNF-α by Western blot analysis(n = 4，珋x ± s)
＊＊P ＜ 0. 01 vs control group;△P ＜ 0. 05，△△P ＜ 0. 01 vs LPS
group
MDA 是一种重要的细胞膜脂质过氧化反应产物，
其在组织中的含量可直接反应机体脂质过氧化的强
度;而体内的抗氧化系统，如 GSH等则能减少氧自
由基对细胞的损伤，可用来评价机体清除氧自由基
的能力。本研究结果发现，脓毒症大鼠心肌组织
MDA含量明显增高，而 GSH，T-AOC 水平明显下
降，提示脓毒症大鼠体内氧化应激明显增强。经
LPPC预处理的脓毒症大鼠 MDA 含量明显减少，
GSH，T-AOC 水平明显恢复，说明 LPPC 用于预防
脓毒症心肌细胞凋亡可能与其抗氧化应激作用有
关。
TNF-α是参与脓毒症全身炎性反应的重要炎症
介质之一，心肌细胞是 TNF-α 的靶细胞，其自身也
可分泌 TNF-α，心肌组织中 TNF-α 的含量可用来反
映脓毒症心肌组织炎症的程度。本实验观察到，脓
毒症大鼠中 TNF-α 水平明显升高(P ＜ 0. 01) ，而
LPPC预处理可以抑制脓毒症大鼠心肌组织中 TNF-
α水平的升高(P ＜ 0. 01) ，提示其可以通过减少心
肌组织中炎症因子 TNF-α 的浸润发挥抗炎作用，达
到保护心脏的目的。
Caspase-3 是一类天冬氨酸特异性的半胱氨酸
蛋白酶，其激活在心肌细胞凋亡的发生中起重要的
作用。Caspase-3 是凋亡的最终执行者，在凋亡级
联激活中处于核心地位［12］。我们的研究发现，在脓
毒症大鼠心肌组织中，caspase-3 蛋白表达水平升高
(P ＜ 0. 01) ，而 LPPC干预可以使其表达水平部分恢
复，说明 LPPC 正是通过抑制具有生物活性功能的
caspase-3 的产生，从而降低脓毒症大鼠心肌细胞凋
亡率，减轻心肌损害。LPPC干预确有抗脓毒症大鼠
心肌组织细胞凋亡的作用。
本实验结果显示，脓毒症大鼠血清 CK-MB、
LDH、AST /GOT 以及心肌组织 MDA 含量均明显升
高，同时，心肌组织 T-AOC 和 GSH 的活力明显降
低，提示心肌损伤明显。心肌组织中凋亡细胞数量
明显增多，且心肌组织中 Cleaved caspase-3 及 TNF-
α含量明显增高，提示脓毒症大鼠心肌损伤的发生
与 TNF-α 以及细胞凋亡有关。在给予不同剂量的
LPPC 预处理后，明显降低了大鼠血清 CK-MB、
LDH、AST /GOT以及心肌组织 MDA 含量;增加了大
鼠心肌组织 T-AOC 和 GSH 的活力;凋亡心肌细胞
数量明显减少;Cleaved caspase-3 及 TNF-α 表达水
平明显下降。说明荔枝壳原花青素预处理能够明显
减轻脓毒症大鼠心肌细胞凋亡，可能与其减轻炎症
介质的产生以及抗氧化应激性损伤作用有关。
致谢:本文实验在深圳市中医院国家中医药科
研三级实验室(No:TCM-2009-289)完成，在此表示
衷心感谢。
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Protective effects of LPPC on cardiomyocyte apoptosis in septic rats
ZHANG Xiao-hui1，SUN Zhi-da2，LI Shu-yi3，ZENG Fan-dian4，XIONG Yi-qun1，XU Chao-ying1，
LIU Xin-liang1，LIN Jian1，MU Gui-ping1，XU Shao-gang1，LIU Wen-he1
(1． Chinese Medicine Institute of Shenzhen TCM Hospital，Shenzhen Guangdong 518033，China;
2． College of Food Science and Technology of Huazhong Agriclultual University，Wuhan 430070，China;
3． College of Food Science and Engineering of Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China;
4． Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430030，China)
Abstract:Aim To explore the protective effects of
LPPC (procyanidins extracted from the litchi pericarp)
on cardiomyocyte apoptosis in septic rats and its mech-
anisms． Methods The rats were randomly divided in-
to 5 groups，and were given orally the drug for two
weeks continuously． The control group (control)and
sepsis model group (LPS)were given distilled water
once a day． LPPC low，medium and high dose groups
were given LPPC 50，100，200 mg·kg －1·d －1 re-
spectively which were prepared freshly every day． After
the treatment，sepsis animal models were established．
Except for the control group，other groups were injec-
ted LPS (lipopolysacchride，10mg·kg －1)intraperito-
neally to induce acute sepsis model． 4hrs later，rat se-
rum was collected，isoenzyme (CK-MB) ，lactate de-
hydrogenase (LDH) and activity of aspertate amin-
otransferase (AST /GOT)were detected． Then rat car-
diac tissue was obtained and cardiac tissue malondial-
dehyde (MDA) ，total antioxidant capacity (T-AOC)
and reduced glutathione (GSH)content were deter-
mined． TUNEL staining was performed to analyze the
apoptosis of myocardial cells． Cleaved caspase-3 and
TNF alpha protein expressions were analyzed by West-
ern blot． Ｒesults Compared with the control group
(control) ，serum of sepsis model group rats CK-MB，
LDH，AST /GOT and cardiac tissue MDA content were
significantly increased (P ＜ 0. 01)． At the same time，
the activity of cardiac tissue T-AOC and GSH de-
creased obviously (P ＜ 0. 01)． The apoptotic myocar-
dial cells increased significantly (P ＜ 0. 01) ，and the
expression level of cleaved caspase-3 and TNF alpha
decreased obviously (P ＜ 0. 01)． LPPC pretreatment
significantly decreased the serum CK-MB，LDH，AST /
GOT and tissue MDA content，increased tissue T AOC
and GSH activity，attenuated apoptosis of rat myocardi-
al cells significantly，and decreased expression level of
cleaved caspase-3 and TNF alpha． Conclusion LPPC
pretreatment can significantly attenuate rat myocardial
cell apoptosis induced by sepsis，and the underlying
mechanisms may be related to its anti-oxidative effects．
Key words:LPPC;sepsis;cardiomyocyte;apoptosis;
oxidative stress;rat
·539·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2015 Jul;31(7)