全 文 ：大青枣叶中黄酮的提取及其含量的伏安法测定
罗济文 ,陈宪明 ,黎中良 ,韦庆敏　(玉林师范学院化学与生物系 ,广西玉林 537000)
摘要　[目的 ]研究大青枣叶中黄酮提取与测定的最佳方法。 [方法 ]以新鲜的大青枣叶片为材料 ,用乙醇提取其中的黄酮 ,研究乙醇浓
度、提取时间和提取温度对黄酮提取量的影响;用芦丁标准溶液绘制微分脉冲伏安曲线后 ,在磷酸盐缓冲液中 ,用微分脉冲伏安法测定
提取液中的黄酮含量。 [结果]当乙醇浓度为 70%、提取温度为 80 ℃、提取时间为 4h时 ,黄酮提取量最高;微分脉冲伏安法测定黄酮含
量具有操作简单、灵敏度好、检出限高等特点。当磷酸盐溶液的pH值为 4.5时 ,黄酮的检出限为 3.0×10-7 mol/L。 [结论]大青枣叶中
黄酮提取的最佳条件为:用 70%乙醇在 80℃条件下提取 4h。微分脉冲伏安法对黄酮含量的检测效果较好。
关键词　芦丁;大青枣;微分脉冲伏安法
中图分类号　S665.1　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2008)35-15289-03
ExtractionofFlavonoidsfromCottonyJujubeLeavesandItsContentDeterminationbyVoltammetry
LUOJi-wenetal　(DepartmentofChemistryandBiology, YulinNormalCollege, Yulin, Guangxi537000)
Abstract　[ Objective] Theaimwastostudytheoptimummethodontheextractionanddeterminationofflavonoidsfromcotonyjujubeleav-
es.[ Method] Withfreshleavesofcottonyjujubeasthematerial, theirflavonoidswereextractedbyethanol, theefectsofethanolconcn.ex-
tractingtimeandextractingtemperatureonextractionamountofflavonoidswerestudied.Afterthedifferentialpulsevoltammetrycurvewas
drewwiththerutinstandardsolution, theflavonoidscontentinextractwasdeterminedbydiferentialpulsevoltammetryinphosphatebufer.
[ Result] Whentheethanolwas70%, theextractingtemperaturewas80℃andextractingtimewas4h, theextractionamountofflavonoids
wasthehighest.Thedifferentialpulsevoltammetrybywhichtheflavonoidscontentwasdeterminedhadthecharactersofsimpleoperation,
goodsensitivityandhighdetectionlimit.WhenthepHvalueofphosphatesolutionwas4.5, thedetectionlimitofflavonoidswas3.0×10-7
mol/L.[ Conclusion] Theoptimumextractingconditionforflavonoidsfromcotonyjujubeleaveswasthatusingethanoltoextractflavonoidsfor
4 hat80 ℃.Thedetectionefectonflavonoidscontentbydiferentialpulsevoltammetrywasbetter.
Keywords　Flavonoids;Cotonyjujube;Diferentialpulsevoltammetry
基金项目　广西教育厅科研基金资助项目(200507218)。
作者简介　罗济文(1949-),男 ,广西陆川人 ,教授 ,从事仪器分析研究
工作。
收稿日期　 2008-10-13
　　黄酮类化合物(flavonoids)是自然界中广泛存在的一类
天然产物 [ 1] 。研究表明 ,黄酮类化合物具有很多生理活性 ,
对一些常见病和多发病有重要的生理作用 [ 2] 。目前植物中
黄酮类化合物常用的提取方法有水浸取法 、水蒸汽蒸馏法 、
大孔树脂吸附法 [ 3] 、超临界萃取法 、有机溶剂浸取法 [ 4-5] 。
黄酮类物质的含量测定有硝酸铝比色法 、高效液相色谱
法 [ 6-7] 、荧光光度法以及电化学分析法 [ 8-9] 。目前 ,国内对黄
酮含量的测定多采用硝酸铝比色法和高效液相色谱法 ,其中
高效液相色谱和毛细管电泳法测定精度高 ,但仪器价格昂
贵 ,而且要有合适的标样。比色法和电分析中的极谱法通常
以芦丁作黄酮标准对照品 [ 9] ,专一性较差 ,测定结果受杂质
干扰大 ,但适合测定样品中的总黄酮 ,不需价格昂贵的仪器。
大青枣又称台湾甜枣 ,学名毛叶枣 (Zizyphusmauriti-
ana),属热带 、亚热带常绿小乔木果树 ,是由印度毛叶枣经台
湾育种家多代改良选育而成的优良水果品种。大青枣具有
生长快 、早结果 、粗长 、高产和品质优良等特点。 1996年在广
西开始少量试种 , 2000年开始有较大规模的种植。在防城
港 、钦州 、玉林 、贵港 、桂平等市(县)都有大面积种植。目前 ,
种植大青枣主要利用其果实 ,其叶子通常遗弃。关于大青枣
叶中黄酮含量的研究尚未见有文献报道。笔者用乙醚除去
大青枣叶的色素 ,用乙醇提取其中黄酮类物质 ,用微分脉冲伏
安法测定大青枣叶中的黄酮 ,并将结果与光度法进行比较。
1　材料与方法
1.1　仪器　LK98CI电化学综合分析系统(天津市兰力科化
学电子高技术有限公司);三电极体系:工作电极为玻碳电极
(GCE),参比电极为饱和甘汞电极(SCE),对电极为铂丝电
极;pHS-3C型精密 pH计(上海精密科学仪器有限公司);721
型分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);简易索氏提取器。
1.2　材料
1.2.1　 1.0×10-3 mol/L芦丁标准溶液 。准确称取芦丁标
准品(中国医药上海化学试剂公司)66.5 mg,用无水乙醇溶
解并定容至 100 ml;磷酸盐缓冲液(PBS):用 0.1 mol/L
NaH2PO4和 0.1 mol/LNa2HPO4配制 ,并用 0.1mol/LH3PO4
与 NaOH调节至所需 pH值。 95%乙醇 、无水乙醚 、亚硝酸
钠 、硝酸铝;所用试剂均为分析纯 ,试验用水为二次蒸馏水。
1.2.2　新鲜大青枣叶(1月份采于广西玉林地区)。将新鲜
叶洗净沥干 ,自然风干后再于 60℃恒温鼓风干燥箱中干燥至
恒重 ,研磨成粉末后过 40目筛 ,将粉末放入磨口瓶中保存。
1.3　方法
1.3.1　大青枣叶中黄酮的提取。称取干燥大青枣叶粉末
0.500 0g置于简易索氏提取器中 ,加入无水乙醚 30 ml(分 2
次),连接索氏提取器回流装置 ,在 39 ℃恒温水浴中加热回
流 2 h,弃去乙醚 ,再加入体积分数为 70%的乙醇溶液 20ml,
在 80℃的恒温水浴中回流提取 4 h,冷却至室温后 ,将提取
液转移至 50 ml的容量瓶中 ,用相同浓度的乙醇溶液洗涤蒸
馏烧瓶 3次 ,洗涤液并入容量瓶中 ,加 70%的乙醇溶液至刻
度 ,摇匀即得样品溶液 ,供测定芦丁含量使用。
1.3.2　测定方法。①微分脉冲伏安法。将玻碳电极依次用
直径为 1.00、0.30、0.05 μm氧化铝粉末和水的混合物抛光。
洗去表面污物 ,再移入超声水浴中充分清洗 。将电极置于
pH值为 4.5的磷酸盐缓冲溶液中 ,在 -0.5 ～ 1.8 V(vs.
SCE)以 100 mV/s速度扫描 8圈 ,使电极活化 ,然后在 -0.2
～ 0.8V扫描至伏安曲线稳定电极便可用于溶液分析。取一
定量的试液于电解池中 ,用 0.1 mol/L, pH值为 4.5的磷酸盐
缓冲溶液定容至 20 ml,记录差示脉冲伏安曲线和电流峰高
安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2008, 36(35):15289-15291 责任编辑　庆瑢　责任校对　吴晓燕
度 。电化学试验前预先向电解池通氮气 6min以除去氧。②
分光光度法。取 6支 25ml的比色管 ,依次加入 0、0.5、1.0、
1.5、2.0、2.5 ml1.0×10-3 mol/L芦丁标准溶液 ,分别加入 1
ml5%的 NaNO2溶液 ,然后加入 70%的乙醇溶液至 10 ml刻
度 ,摇匀 ,静置 8 min后 ,加入 1ml10%的 A1(NO3)3溶液 ,静
置 6min,再加入 8ml4%的 NaOH溶液 ,同时加水至刻度 ,静
置 15min。以 1号管溶液作为参比液 ,在 510nm处测定各溶
液的吸光度 ,重复测定 3次取平均值 ,以测得的数据做标准曲
线。同样条件下测定一定浓度的试液 ,在标准曲线求出其浓度。
2　结果与分析
2.1　黄酮提取条件的确定
2.1.1　乙醇浓度。分别用体积分数为 40%、50%、60%、
70%、80%、90%的乙醇溶液为提取剂 ,其他条件按 “1.3”所
述步骤提取 ,然后用分光光度法测定各提取液中黄酮含量 。
结果表明 ,当乙醇溶液的体积分数达 70%时 ,提取液中黄酮
类物质的含量最高。但 70%以后 ,黄酮类物质的含量减少 ,
这可能是由于大青枣叶中黄酮为多种化合物的混合物 ,这些
物质的极性和化学结构不同所致 。试验选取体积分数为
70%的乙醇溶液作为提取溶剂 。
2.1.2　回流时间。改变回流提取时间 ,提取液浓度 、温度和
步骤都按 “1.3”进行 ,结果发现提取时间在 2 h内 ,提取液的
吸光度较小 ,提取不完全;随着时间的延长 ,提取液中黄酮类
物质的含量随之增加 ,但 4 h以后 ,升高的幅度逐渐变小 ,因
此试验选取的回流提取时间为 4 h。
2.1.3　提取温度。在其他条件和步骤不变 ,只改变提取温
度的情况下进行试验 ,结果表明 ,随着提取温度的升高 ,提取
液中黄酮类物质的含量增加 。但提取温度过高会造成提取
液中黄酮类化合物活性的破坏。同时 ,高温提取能量消耗也
较大 ,对试验条件的控制要求也较高。因此 ,试验选取 80 ℃
作为提取温度。
2.2　大青枣叶中黄酮的测定
2.2.1　大青枣叶试液在玻碳电极上的伏安表现。在电解池
中加入已配制好的大青枣叶试液 2.00ml,用 pH值为 4.5、浓
度为 0.1 mol/L的磷酸盐的缓冲溶液稀释至 20.00 ml,再以
活化处理的玻碳电极为指示电极测定循环伏安曲线 。曲线
上有 1对氧化还原峰 ,电位 Epa、Epc分别为 0.43、0.38 V(图
1a)。若以芦丁标准溶液代替试液在同样的条件所得的曲线
如图 1b所示 。在几乎相同的位置有 1对氧化还原峰 , Epa、
Epc分别为 0.43、0.35 V,与试液的 1对峰的电位十分相近 ,
Ipc∶Ipa=1.32,表现为准可逆过程。
注:扫描速度为 100mV/s。
Note:Scanrateis100mV/s.
图 1　玻碳电极在大青枣黄酮提取液(a)、芦丁溶液(b)中的循环伏安曲线
Fig.1　CyclicvoltammogramofGCEinflavonoidsextractsolution(a)andrutinsolution(b)
　　由于微分脉冲法的灵敏度高 ,分辨能力强 ,特别是对可
逆过程 ,这一优点更突出 [ 10] ,因此试验采用微分脉冲法进行
测定 。在试液中加入芦丁标准溶液做微分脉冲法扫描 ,测定
参数为:脉冲幅度 0.05V,脉冲宽度 0.05 s,脉冲间隔 0.2 s。
结果显示 ,曲线峰电位为 0.42V左右(图 2)。在试液中加入
芦丁标准溶液可以看到 ,脉冲峰电流随加入的标准芦丁溶液
的增加而增大 ,而峰电位基本维持不变。这说明该峰是由芦
丁在电极反应所产生。
2.2.2　pH值对测定的影响。固定芦丁浓度 ,在 pH值为 2.0
～8.0的各种磷酸盐缓冲溶液中进行微分脉冲伏安扫描 ,发
现随着 pH值增大 ,峰电位逐渐负移 ,而且峰电流变小。这是
因为芦丁在电极表面的氧化还原反应有 H+参与 ,较大的酸
度有利于反应 ,可得较高灵敏度。为此测定选用在 pH值为
4.5的磷酸盐缓冲溶液中进行。
2.2.3　线性范围和检出限。以芦丁浓度分别为 1.0×10-5 、
1.5×10-5、2.0×10-5、2.5×10-5 mol/L的 PBS作微分脉冲
伏安测定。曲线峰电流出现在 0.43 V(图 3)。峰高随芦丁
注:1～ 5的浓度分别为 0、0.8×10-5、1.6×10-5、2.4×10-5、3.2×
10
-5 mol/L。
Note:1-5are0, 0.8×10-5 , 1.6×10-5 , 2.4×10-5 and3.2×10-5
mol/L.
图 2　玻碳电极在试液及加入不同浓度芦丁标准溶液的微分脉冲
伏安曲线
Fig.2　Diferentialpulsevoltammogramsinextractsolutionand
standardsolutionaddingdiferentrutinconcentrations
15290 　　　　　　　　　　安徽农业科学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　2008年
浓度增大而增大 ,在 8.0×10-7 ～ 5.0×10-5 mol/L芦丁浓度
与其峰电流呈良好的线性关系 ,线性回归方程为 Ip(μA)=
1.16 +18.8×C(10-5mol/L),相关系数 r=0.999 63,检出
限为 3.0×10-7 mol/L。
注:1～ 6的浓度分别为 0、0.5×10-5、1.0×10-5、2.0×10-5、3.0×
10
-5、3.5×10-5 mol/L。
Note:1-6are0, 0.5×10-5 , 1.0×10-5 , 2.0×10-5 , 3.0×10-5 and
3.5×10-5 mol/L.
图 3　不同浓度芦丁标准溶液的微分脉冲伏安曲线
Fig.3　Differentialpulsevoltammogramsindifferentconcentra-
tionsofrutinstandardsolution
2.2.4　电极的再生和测定的精密度。由于芦丁在电位扫描
过程中可固定在玻碳电极表面 [ 11] ,这将对测定的结果产生
很大影响 ,故在每次扫描测定后要将电极再生。方法是将电
极置于 pH值为 4.5的磷酸盐缓冲溶液中在 -0.5 ～2.0V扫
描至氧化还原峰消失 ,再用于下次测定。按该方法处理电
极 ,对含有芦丁 2.0×10-5 mol/L, pH值为 4.5的磷酸盐缓冲
溶液连续用微分脉冲法测定 5次 ,平均峰电流为 27.5μA,相
对标准偏差为 3.1%。
2.2.5　试样中黄酮含量的测定。由于试样成分较复杂 ,可
能含有少量影响峰电流的物质 ,对试样测定时采用标准加入
法进行 ,每次测定分别取 5份 1.0 ml试液 ,从 1号试液起依
次加入标准溶液 0、0.1、0.2、0.3、0.4ml,按前述步骤测定 ,测
得黄酮含量分别为 17.3、18.1、18.3、17.4、18.6 mg/g,平均值
为 17.9mg/g, RSD值为 3.2%。按 “1.4.2”光度法测定结果
为 26.0mg/g,比以上测定结果大。这主要可能是由于黄酮
类物质中参与显色反应的物质更多。
3　结论
将玻碳电极活化处理后 ,可在 pH值为 4.5的磷酸盐缓
冲溶液用微分脉冲法测定植物叶子中的黄酮。微分脉冲伏
安曲线在 0.43 V(vsSCE)的峰电流与黄酮浓度呈良好的线
性关系 。该方法操作简单 ,电极不须特别修饰处理 ,所用样
品量少 ,灵敏度较高 ,重现性好等特点。
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(上接第 15282页)
　　假定尺度参数 a的验前超参数分别取 c=1, d=5,形状
参数 b服从 0.4 ～ 0.6的均匀分布 ,那么参数 a和 b的极大似
然估计分别为:a =0.961 5, b =0.577 7,试验结束时 , MTBF
的估计为:θ (1 000)=33.3 h。利用该文所采用的 Bayes估计
方法 , 相应的有: a=0.950 9, b= 0.570 3, θ(1 000)=
37.16h,所得结果与极大似然估计法所得结果非常接近 ,这
说明 Bayes估计法的可行性较好。同样 ,根据参数的后验密度
函数 ,通过计算可以很方便地得到参数的区间估计及置信
限 ,计算过程较极大似然估计法简单 [ 6] 。
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