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pH和氮素形态对紫花苜蓿根瘤特性的影响



全 文 :pH和氮素形态对紫花苜蓿根瘤特性的影响
俞 艳,刘晓静,齐敏兴,张晓磊,付 萍,王巧玲,张晓玲,李鸿燕
(1.甘肃农业大学 草业学院/草业生态系统教育部重点实验室/甘肃省草业工程实验室/中-美草地畜牧业
可持续发展研究中心,甘肃 兰州730070)
  摘要:采用砂培方法,在营养液条件下研究了pH和不同氮素形态对接种中华根瘤菌的甘农3号紫
花苜蓿根瘤特性的影响。结果表明,苜蓿对碱性条件的耐受性强于酸性条件。过低或过高的pH对苜
蓿与根瘤菌的共生固氮效果具有抑制作用;同时,铵态氮下培养的紫花苜蓿根瘤数、根瘤重、固氮酶活
性、根系全氮含量和生物量均高于硝态氮下培养。表明pH接近于中性和铵态氮条件更有利于紫花苜
蓿的结瘤固氮和植株的正常生长。
  关键词:pH;氮素形态;紫花苜蓿;结瘤固氮
  中图分类号:S 144.5  文献标识码:A  文章编号:1009-5500(2012)05-0007-05
紫花苜蓿(Medicago sativa)素有“牧草之王”的美
称,是一种蛋白质含量高的优质豆科牧草。在其生长
过程中受到多种因素的影响,土壤pH 是主要的因素
之一。苜蓿在我国主要分布于北方中性和微酸性土壤
中,但其适宜的土壤pH为6.5~7.5。紫花苜蓿接种
根瘤菌可以提高其产量和品质[1],但苜蓿根瘤菌一般
不耐酸,酸性土壤降低了根瘤菌与宿主植物之间的亲
和性,抑制了根瘤菌的存活,致使豆科牧草生物固氮受
阻[2,3],同时土壤pH 影响紫花苜蓿根系铁离子的吸
收[4]。氮是植物生长发育不可缺少的营养元素,是植
物体内许多重要有机化合物的组成成分[5],对植物的
生命活动以及产量的形成与品质的优劣均有着极为重
要的作用[6]。施氮对紫花苜蓿的早期生长具有积极意
  收稿日期:2012-06-19;修回日期:2012-09-12
  基金项目:甘肃省自然基金项目“甘肃省秦王川灌区苜蓿
草地施肥制度及其对环境的影响研究”
(1010RJZA157),草业生态系统教育部重点实
验室(甘肃农业大学)项目“供氮水平及氮素形
态对紫花苜蓿养分吸收及根瘤特性的影响研
究”(CYZS-2011012)和甘肃农业大学本科生科
研训练计划项目(SRTP)资助
  作者简介:俞艳(1990-),女,甘肃酒泉人,学士。
E-mail:liuxj@gsau.edu.cn
刘晓静为通讯作者。
义[7]。硝态氮与铵态氮均能被植物吸收,但不同形态
的氮素对植物生理特性和生长发育的影响不同[8]。为
进一步探讨pH和不同氮素形态对紫花苜蓿根瘤特性
的影响,采用砂培方法,通过营养液控制pH梯度和氮
素形态,排除其他外部环境的影响,更加客观直接的反
应试验结果,以期为紫花苜蓿最适的pH 范围和氮素
供应提供理论依据。
1 材料和方法
1.1 供试品种
供试苜蓿品种为甘农3号紫花苜蓿(Medicago
sativa var.Gannong No.3),由甘肃农业大学草业学院
提供。选取大小均匀,颗粒饱满种子,先用95%乙醇
浸泡5min,再用0.1% HgCl2溶液灭菌6~10min,然
后无菌水冲洗5~6次。
1.2 供试根瘤菌菌株
中华根瘤菌(12531),由甘肃农业大学草业学院提
供。将菌株进行平板划线培养,挑起单菌落接种于
YMA培养基上,在28℃培养箱中培养72h,用无菌
水洗下根瘤菌体,装入无菌三角瓶中。
1.3 营养液配制
  Fahraeus无氮植物营养液配制方法:Na2HPO4·
12H2O 0.15g,MgSO4·7H2O 0.12g,柠檬酸铁
0.005g,CaCl2·2H2O 0.1g,KH2PO40.1g,Gibson
7第32卷 第5期           草 原 与 草 坪2012年
DOI:10.13817/j.cnki.cyycp.2012.05.008
微量元素1mL,H2O 1 000mL。Gibson微量元素液:
H3BO32.86g,ZnSO4·7H2O 0.22g,CuSO4·5H2O
0.08g,MnSO4·4H2O 2.03g,Na2MoO4·2H2O
1.26g,H2O 1 000mL。
1.4 实验设计
采用砂培方法,选用直径7.0cm、高8.5cm 的塑
料杯,装入高温灭菌的粗砂230g。每杯播种10粒已
消毒的种子,覆盖干沙50g。pH设5、6、7、8、9共5个
梯度;设氮素形态为硝态氮和铵态氮2种,以Fahraeus
无氮植物营养液为基本营养液,分别以Ca(NO3)2和
(NH4)2SO4为氮源配制所需营养液,用 HCl和NaOH
溶液把营养液pH分别调成5、6、7、8、9,一次性施入。
待种子发芽时,每个塑料杯接种新培养的苜蓿根瘤菌
液2mL。每6个塑料杯为1个重复,放入水培盒中,
每个处理设3次重复,随机排列。营养液每水培盒
500mL,使液面保持一致,并标出液面线。实验均在
实验室条件下进行,期间每隔4d补充1次蒸馏水,处
理60d后测定各项生理指标。
1.5 测定指标与方法
  根瘤数 数每个植株的根瘤总数;根瘤重 将摘
下的根瘤在电子天平上称鲜重;固氮酶活性 采用乙炔
还原法测定[9,10]。称取0.2g的新鲜根瘤置于7mL
玻璃瓶中,加盖橡皮塞后,从中吸出0.7mL空气,注
入0.7mL乙炔,室温下反应30min,待机器稳定,用
微量注射器抽取混合气体25μL注入气相色谱仪
(GC)进样柱中,测定C2H2、C2H4峰值。然后,在同样
条件下用标准乙烯测定并绘制乙烯的标准曲线,由此
计算根瘤样品的固氮酶活性。每个处理3次重复。测
定仪器为GC-7890F气相色谱仪,柱温180℃,进样器
150℃,FID检测器170℃。气体压力N2为0.3mPa,
H2为0.08mPa,空气为0.15mPa。
  C2H4水平[μmol/(g·h)]=hx(样品峰面积)×C
(标准 C2H4水平,μmol/mL)×V(培养容器体积,
mL)/hs(标准C2H4峰面积)×24.9×t(C2H2反应时
间,h)×m(瘤重,g)。
  植株根系全氮含量 植株的全氮含量采用浓
H2SO4-H2O2法测定[11]。
  地上、地下生物量 采用105~110℃杀青30min,
70~80℃烘至恒重,称重。
1.6 数据处理
采用Excel 2003进行数据处理和图表绘制,并采
用SPSS 16.0进行单因素方差分析(one-way ANO-
VA)和新复极差法(Duncan法)进行多重比较。
2 结果与分析
2.1 pH和氮素形态对紫花苜蓿根瘤数的影响
根瘤数的多少可以直接反映根瘤菌固氮效率的强
弱,结果表明(图1),在其他营养供应充分的条件下,
pH和不同氮素形态均对紫花苜蓿根瘤数目有显著影
响。在给定的pH 范围,对于不同氮素形态处理的紫
花苜蓿,均以pH 为7时根瘤数最多,过高或过低的
pH对结瘤的形成均存在抑制作用。同时,氮素形态的
不同也直接影响紫花苜蓿根瘤的形成,铵态氮培养下
的根瘤数显著大于硝态氮培养。表明中性pH和铵态
氮更有利于紫花苜蓿根瘤的生长与形成。此结果与严
君[12]在大豆上的施氮效果一致。
图1 pH和氮素形态下的紫花苜蓿根瘤数
Fig.1 Effect of pH value and nitrogen forms on root nodule
number of alfalfa
2.2 pH和氮素形态对紫花苜蓿根瘤重的影响
pH和氮素形态对紫花苜蓿根瘤重具有显著影响
(图2)。在给定的pH梯度下,不同氮素形态处理的紫
花苜蓿,pH均为7时根瘤重达到最大值,低pH 和高
pH对根瘤重的增大均具有抑制作用。同时,铵态氮培
养下的根瘤重显著大于硝态氮。
图2 pH和氮素形态下的紫花苜蓿根瘤重
Fig.2 Effect of pH value and nitrogen forms on nodulation
of alfalfa
8       GRASSLAND AND TURF(2012)            Vol.32No.5
2.3 pH和氮素形态对紫花苜蓿固氮酶活性的影响
铵态氮培养下紫花苜蓿的固氮酶活性要显著高于
硝态氮培养(图3),说明铵态氮更有利于紫花苜蓿固
氮酶活性的提高。同时,在给定的pH 范围内,在pH
为7时,2种不同氮素形态培养下紫花苜蓿的固氮酶
活性都最高。pH=5和pH=9时,固氮酶活性最低,
说明偏酸和偏碱的环境对固氮酶活性均有抑制作用。
而处理在pH=6时的固氮酶活性强于pH=8时的固
氮酶活性,说明偏酸的环境下固氮酶活性比偏碱环境
下更高,表明甘农3号紫花苜蓿对偏酸环境具有一定
的耐受性。
图3 pH和氮素形态下的紫花苜蓿固氮酶活性
Fig.3 Effect of pH value and nitrogen forms on
nitrogenaseactivity of alfalfa
2.4 pH和氮素形态对紫花苜蓿根系全氮含量的影

pH和氮素形态对紫花苜蓿根系全氮含量具有显
著影响。在5个pH处理中,pH为7时根系全氮含量
最高,pH为5时最低(图4)。同时,碱性处理下的根
系全氮含量要显著高于酸性处理,说明这个处理对偏
碱性环境有一定的耐受性,这可能与根瘤菌产酸的生
理特性有关,由于根瘤菌在共生固氮过程中分解营养
物质产生酸,降低了根际周围的pH。从氮素形态对其
影响来看,铵态氮培养下紫花苜蓿根系全氮含量要显
著高于硝态氮培养,说明铵态氮更有利于紫花苜蓿固
氮酶活性的提高。
2.5 pH和氮素形态对紫花苜蓿地上、地下生物量的
影响
对不同pH和氮素形态处理下的植株生物量进行
方差分析,各个处理间差异显著(表1)。pH 为7时,
紫花苜蓿地上和地下生物量均为最高。pH小于7时,
生物量随pH的增加而增加,pH大于7时,生物量随
pH的增加而减少。pH 大于7时的地上和地下生物
量均高于pH值小于7时,这可能是由于在根瘤菌与
植株的共生过程中,分离了其他营养物质产生酸,降低
了根际周围的pH 值,从而减弱了pH 对根瘤菌侵染
的抑制作用。同时,铵态氮处理下的植株地上和地下
生物量都高于硝态氮处理,表明铵态氮更有利于紫花
苜蓿植株生物量的积累。司江英等[8]的研究也表明,
以NH4+-N为氮源的白羽扇豆生物量积累和根冠比
也高于NO3--N。
图4 pH值和氮素形态下的紫花苜蓿根系全氮含量
Fig.4 Effect of pH value and nitrogen forms on root
total nitrogen content of alfalfa
表1 pH值和氮素形态对紫花苜蓿地上、地下生物量的影响
Table 1 Effects of pH value and nitrogen forms on aboveground
and underground biomass of alfalfa
pH
地上生物量
铵态氮 硝态氮
地下生物量
铵态氮 硝态氮
5 0.030 6±0.04c 0.012 1±0.02c 0.015 0±0.01d 0.013 8±0.01d
6 0.101 7±0.05b 0.087 9±0.02bc 0.047 1±0.02c 0.015 1±0.01cd
7 0.147 6±0.03a0.124 2±0.03a0.078 2±0.02a0.027 4±0.02a
8 0.137 4±0.02ab0.114 5±0.04ab0.077 7±0.02ab 0.019 8±0.01b
9 0.115 7±0.04ab 0.098 7±0.03b 0.066 4±0.03b 0.016 7±0.02c
  注:表中同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)
3 讨论
  研究结果表明,紫花苜蓿是对pH 胁迫敏感的植
物,过低或过高的pH 对苜蓿与根瘤菌的共生固氮效
果具有抑制作用。氮素是植物体内蛋白质、核酸、叶绿
素和一些激素等的重要组成部分,是限制植物生长和
产量形成的重要因素[12,13]。紫花苜蓿与根瘤菌的有效
共生作用除了受品种、菌系影响外,往往受到生态环境
与肥力的影响[14]。总之pH为7或略微偏碱性条件较
适宜紫花苜蓿的生长,苜蓿对碱性条件的耐受性更强
于酸性条件。根瘤菌的生长有一个最适的pH 范围,
pH过高或过低时,根瘤菌生长速率较低,导致总根瘤
数相对较少。关于低pH抑制根瘤菌和苜蓿根生长的
9第32卷 第5期           草 原 与 草 坪2012年
机理,可能是由于低pH 导致信号分子(NF)量减少,
降低了信号分子的活性并使根瘤菌对植物的信号分子
的修饰、分解作用受到影响,甚至抑制nod基因的表
达,降低了根瘤菌对苜蓿根毛的侵染能力;在强酸条件
下,苜蓿根系质膜 H+-ATPase酶的活性会发生变化,
以减轻苜蓿根系受到伤害[15]。同时,低pH胁迫下,苜
蓿对水分和养分的吸收能力下降,致使苜蓿的光合作
用降低,影响结瘤过程中根瘤菌糖类和 ATP的供应,
从而导致苜蓿根系结瘤减少和生长受阻。而在高pH
下紫花苜蓿的结瘤固氮强于低pH 下,可能与苜蓿根
瘤菌产酸的生理特性有关,降低了根际周围的pH,使
紫花苜蓿的生长状况比实际pH 梯度时生长的好,相
关机理还有待进一步研究。
同时在本研究中,铵态氮下培养的紫花苜蓿根瘤
数、根瘤重、固氮酶活性、根系全氮含量和生物量均高
于硝态氮下培养。分析原因,一方面是硝态氮使宿主
根毛形成受阻遏或弯曲,硝态氮在呼吸消耗过程中减
少了光合产物向根瘤的运输,延迟了根瘤的形成和增
大,从而进一步抑制固氮酶活性和根瘤固氮[16-19],另
一方面由于同化硝态氮的关键酶-NR与固氮酶对钼
具有竞争性,减少了钼铁蛋白的形成,从而降低了共生
固氮的固氮酶活性[17]。同时严君[12],宋海星[17]研究
也表明,NO3--N与NH4+-N均不同程度地抑制根瘤
固氮酶活性,但NH4+-N对根瘤固氮的抑制作用明显
低于NO3--N。而具体机理还有待进一步研究。
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Effect of pH value and nitrogen forms on root
nodule characteristics of alfalfa
YU Yan,LIU Xiao-jing,QI Min-xing,ZHANG Xiao-lei,FU Ping,
01       GRASSLAND AND TURF(2012)            Vol.32No.5
WANG Qiao-ling,ZHAGN Xiao-ling,LI Hong-yan
(College of Pratacultural Science,Gansu Agricultural University/Key Laboratory of Grassland
Ecosystem,Ministry of Education/Pratacultural Engineering Laboratory of Gansu Province/Sino-U.S.
Centers for Grazingland Ecosystem Sustainability,Lanzhou730070,China)
  Abstract:To study the interaction of pH value and different nitrogen forms to root nodule characteristics of
“GAU-III”alfalfa under the inoculation of rhizobia,alfalfa was grown in sand nutrient culture.The results
showed that when pH value reached 7or little higher,alfalfa grew wel.And the tolerance in alkaline conndition
of alfalfa was better than in acidic condition.Too low or too high pH value,the effect of symbiotic nitrogen-fix-
ing of alfalfa and rhizobia would restrain.Meanwhile,root nodule number,nodulation,nitrogenaseactivity,root
total nitrogen content,aboveground and underground biomass of alfalfa in ammonium nitrogen were higher than
in nitrate nitrogen.It indicated that the condition of pH value close to neutral and ammonium nitrogen were
more conducive to root nitrogen-fixing and regular growing of alfalfa.
  Key words:pH;nitrogen forms;alfalfa;root nitrogen-fixin
檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪檪

(上接6页)
The effect of different ridge-furrow types on water
content of soil in semi-arid region of China
GU He
(Management of Water Conservancy Bureau of Department of Water Resources in
Gansu Province,Lanzhou,730000,China)
  Abstract:To study the probability of soil water increase in furrow profiles in water harvesting system with
ridges and furrows for potato production,it is necessary to find the differences of soil water content and the
differences of leak rate in furrow profiles between MR(mulching ridge-ridge covered with plastic film),SR(soil
ridge-ridges with compacted soil)and traditional cultivation(flat planting).Different ridge,furrow ratios and
different ridges covered materials,using plat planting as control and ridges serving as rainfal harvesting zones
and furrows serving as planting zones,were designed to study the effect of different ridge-furrow types on soil
water content and soil water permeation in semiarid region of China.The results showed that the differences of
soil water content were insignificant between MR(mulching ridge)treatments.Insignificant differences of soil
water content were also found between SR(soil ridge)treatments.At early growth stage,the difference of soil
water content between SR and plat planting was insignificant for the thin thickness of soil crust on ridges while
it became significant with increase of thickness of soil crust on ridges at medium growth stage,but it became in-
significant with decrease of rainwater and high evapotranspiration at late growth stage.Soil water storage of
MR treatments was significantly higher than that of SR treatments,soil water storage of SR treatments was sig-
nificantly higher than that of controls.
  Key words:ridge covered with plastic film;ridge with compacted soil;soil water;permeation rate
11第32卷 第5期           草 原 与 草 坪2012年