全 文 ：浙江农业学报 ActaAgriculturaeZhejiangensis22(4):521 ～ 526, 2010
响应曲面法优化微波辅助提取柿叶总黄酮的工艺
董江涛＊ ,李　燕 ,徐慧强 ,蒋橙华
(上海海洋大学食品学院 ,上海 201306)
收稿日期:2010-04-27
基金项目:上海海洋大学骆肇荛大学生科技创新基金(G7101000
00737)
作者简介:董江涛(1983-),男 ,硕士 ,山东威海,主要从事天然产
物研究与开发。 E-mail:dongjiangtao2007@126.com;Tel:15121048986
＊通讯作者 ,董江涛 , E-mail:dongjiangtao2007@126.com
摘　要:采用响应曲面法优化微波辅助提取柿叶中总黄酮的工艺 ,以提高柿叶黄酮的提取得率。结果表明:
微波辅助提取柿叶总黄酮的最佳工艺为:微波功率 422.360 W、提取时间 20.970 min、液料比 20.660∶1,此时
柿叶总黄酮的得率达 6.15%。说明响应曲面法是一种很好的优化柿叶黄酮提取工艺的方法。
关键词:柿叶;总黄酮;响应曲面;微波辅助提取
中图分类号:TS201.1　　　　　文献标识码:A　　　　　 文章编号:1004-1524(2010)04-0521-06
Optimizationofmicrowave-assistedextractionprocessoftotalflavonoidsfrom
persimmonleavesusingresponsesurfacemethodology
DONGJiang-tao＊ , LIYan, XUHui-qiang, JIANGCheng-hua
(ColegeofFoodScience＆Technology, ShanghaiOceanUniversity, Shanghai201306 , China)
Abstract:Theprimarygoalofthisresearchwastoimprovetheratiooftotalflavonoidsextractedfrompersimmon
leaves.Thetechniqueappliedwasreferredtoasresponsesurfacemethodologywhichisagoodexperimentaldesign
methodcommonlyusedintheoptimizationofextractiontechnology.Themethodusedinthisstudywasmicrowave-as-
sistedextraction.Theresultsshowedthattheoptimalextractionconditionsoftotalflavonoidsfrompersimmonleaves
wereasfolows:microwavepower422.360 W;extractiontime20.970 min, andliquid-solidratio20.660∶1.Inthis
case, theextractionratecouldreach6.15%.Fromtheexperiments, itwasconcludedthatresponsesurfacemethod-
ologywasagoodmethodforimprovingtheratiooftotalflavonoidsextractionfrompersimmonleaves.
Keywords:persimmonleaves;totalflavonoids;responsesurfacemethodology;microwave-assistedextraction
　　柿叶中含有酚类 、鞣质 、黄酮 、生物态碱 、维
生素 C、胡萝卜素等多种活性物质 [ 1] 。柿叶中的
有效成分为黄酮类化合物[ 2] ,含有黄芪甙 、紫云
苷 、异槲皮苷 、槲皮素 、异槲皮素 、山萘酚 、杨梅树
皮甙 、芦丁 、金丝桃甙等黄酮单体;具有明显的抗
氧化 、抗衰老 、增强机体免疫力 、抗溃疡 、软化血
管 、降血糖 、血脂等生理活性作用[ 3-4] 。因此 ,柿
叶黄酮的开发与应用受到广泛关注与重视 。
微波辅助提取技术是利用微波场的生物效
应 、热效应及 “扰动 ”效应来加速物质的扩散溶
解 ,有效地提高化合物的提取得率与含量 。微波
辅助提取技术用于黄酮类化合物提取时具有选
择性高 、提取时间短 、溶剂用量少 、后处理方便耗
能低 、对环境安全无害等优点[ 5] 。本文以黄酮的
提取得率为指标 ,应用响应曲面法对微波辅助提
取柿叶黄酮的条件进行了优化 ,得出微波辅助提
取的最佳工艺参数 ,为后续研究工作提供参考。
1　材料与方法
1.1　材料与试剂
柿叶:河北大磨盘三年生柿树 11月霜后叶
子 ,自然晾干;芦丁标准品 ,中国药品生物制品检
定所;无水乙醇 、NaNO2 、Al(NO3)3、NaOH均为分
析纯 ,国药公司。
1.2　仪器与设备
WFZ-UV2000紫外可见分光光度计 ,尤尼柯
仪器有限公司;XH-MC-1微波催化合成萃取仪 ,
北京祥鹄高科技发展有限公司;德国 sartorius
BS210S电子天平 ,北京塞多利斯天平有限公司;
多功能粉碎机 ,广东佛山市方胜电器有限公司;
高速冷冻离心机 , H2050R-1长沙湘仪离心机仪
器有限公司 。
1.3　方法
1.3.1　提取液制备
取已干燥的柿叶粉碎 ,过二十目筛 ,准确称
取块状碎片 1.0 g,加入 60%乙醇 ,微波辅助提
取 ,提取液经抽滤 、离心后于 50 mL容量瓶中以
60%乙醇定容 ,摇匀待用。
1.3.2　芦丁标准曲线制作
准确称取 0.01 g芦丁标准品以 60%的乙醇
溶解后 ,定容到 50 mL容量瓶中得到 0.2 mg/mL
的芦丁标准液。分别准确量取 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7
mL此标准液于 8个 25 mL容量瓶中 ,依次分别
加入 1mL5%的 NaNO2溶液 ,摇匀后静置 6 min;
1 mL10%的 Al(NO3)3溶液 ,摇匀后静置 6 min;
10 mL4%的 NaOH溶液 ,用 60%的乙醇稀释到
刻度 , 静置 15 min。在 510 nm处测定吸光度
(A),以浓度(mg/mL)为横坐标 , A为纵坐标作标
准曲线 [ 10] 。
1.3.3　总黄酮含量测定与计算
黄酮含量测定采用硝酸铝络合分光光度法 ,
其原理是黄酮类化合物经亚硝酸钠还原后 ,与硝
酸铝络合生成稳定的红橙色化合物 ,此化合物在
510nm波长处有最大吸收 ,然后以芦丁作标准 ,
通过测定吸光度计算含量 。
准确移取 1 mL的样品液于 50 mL容量瓶
中 ,其余操作同 1.3.2节标准曲线制作 。根据标
准曲线换算 ,按以下公式计算总黄酮得率 。
总黄酮得率(%)=C×V×1000m ×100
式中:C为黄酮溶液浓度(mg/mL);V为溶液
体积(mL);m为柿叶质量(g)。
1.3.4　单因素试验设计
分别考察了微波功率 、液料比 、提取时间等 3
个因素 ,在各自 5个水平上的提取得率 。
(1)微波功率对提取得率的影响
在液料比 20∶1、提取时间 20 min、乙醇浓度
60%的条件下 ,考察微波功率在 300 ～ 600 W的
条件下 ,对柿叶黄酮提取得率的影响 。
(2)提取时间对提取得率的影响
在液料比 20∶1、乙醇浓度 60%、微波功率为
450 W的条件下 ,考察提取时间在 5 ～ 35 min的
条件下 ,对柿叶黄酮提取得率的影响 。
(3)液料比对提取得率的影响
在提取时间 20 min、乙醇浓度 60%、微波功
率为 450 W条件下 ,考察液料比在 5 ∶1 ～ 35∶1
的条件下 ,对柿叶黄酮提取得率的影响。
1.3.5　响应曲面设计
以单因素试验结果为基础 , 采用 Box-Be-
hnken设计方案做响应曲面研究 , 3个自变量微
波功率 、提取时间和液料比分别以 X1 , X2和 X3
代表 ,以 +1, 0, -1分别代表各自的不同水平 ,编
码因素及水平 、试验设计方案见表 1。
表 1　响应曲面法分析因素及水平
Table1　Analyticalfactorsandlevelsforresponsesurface
methodologyanalysis
水平 因素
微波功率 /W 提取时间 /min 液料比 /(mL·g-1)
-1 400 15 15
0 420 20 20
1 440 25 25
2　结果与分析
2.1　标准曲线
图 1　芦丁标准曲线图
Fig.1 Standardcurveofrutin
·522· 浙江农业学报　第 22卷　第 4期(2010年 7月)
从图 1中可以看出 ,芦丁标准曲线回归方程
为:A=9.4122C-0.0054(R2 =0.9997),其中 C
为黄酮浓度 (mg/mL), A为吸光度 ,线性关系良
好 。
2.2　单因素试验结果
2.2.1　微波功率对提取得率的影响
由图 2中可知:在较低的微波功率条件下 ,
黄酮的提取率随微波功率的增强而显著增加 ,但
微波功率达到 450 W后 ,黄酮提取率会降低 ,是
因为在过高的微波功率下温度升高明显 ,使提取
出的黄酮易被氧化 ,从而降低了黄酮的浓度。
图 2　微波功率对提取得率的影响
Fig.2 Efectofmicrowavepowerontotalflavonoidsextrac-
tionyield
2.2.2　提取时间对提取条件的影响
图 3　提取时间对黄酮提取得率的影响
Fig.3 Effectsofextractiontimeontotalflavonoidsextrac-
tionyield
由图 3可知 ,随着提取时间的延长 ,总黄酮
的得率不断升高 ,但从 20 min开始 ,提取得率变
化不大 ,考虑到试验周期的要求 ,选择 20 min为
柿叶黄酮提取的较佳时间 。
2.2.3　液料比对提取得率的影响
从图 4可以看出 ,当液料比从 10∶1扩大至
20∶1时 ,总黄酮的得率增加趋势非常明显 ,在
20∶1时达到最大值 ,之后开始减小 ,这是由于液
图 4　液料比对黄酮提取得率的影响
Fig.4 Efectsofliquid-to-solidratioontotalflavonoidsex-
tractionyield
料比扩大可以增加物料与溶剂的接触面积 ,使得
黄酮类物质更充分的溶解出来;但液料比过大也
会造成杂质过多溶出 ,不仅耗损了大量的试剂 ,
也给后来的纯化工作带来困难 ,所以确定最佳液
料比为 20∶1。
2.3　响应曲面优化试验
2.3.1　模型建立及显著性检验
响应面设计试验中 ,以微波功率 、提取时间
和液料比为参数 ,柿叶黄酮的提取得率为响应
值 ,进行了 3因素 3水平响应曲面分析试验。试
验结果见表 2。
表 2　响应曲面试验结果
Table2　Resultofresponsesurfacemethodologyexperiment
试验号 X1 X2 X3 实际黄酮
得率 /%
预测黄酮
得率 /%
1 -1 -1 0 5.72 5.73
2 1 -1 0 5.94 5.94
3 -1 1 0 5.88 5.88
4 1 1 0 5.94 5.93
5 -1 0 -1 5.67 5.65
6 1 0 -1 5.95 5.94
7 -1 0 1 5.89 5.90
8 1 0 1 5.85 5.87
9 0 -1 -1 5.84 5.86
10 0 1 -1 5.95 5.96
11 0 -1 1 5.98 5.96
12 0 1 1 6.03 6.02
13 0 0 0 6.14 6.14
14 0 0 0 6.14 6.14
15 0 0 0 6.13 6.14
16 0 0 0 6.18 6.14
17 0 0 0 6.14 6.14
·523·董江涛等:响应曲面法优化微波辅助提取柿叶总黄酮的工艺
由表 2可知 ,试验值与预测值很接近 ,模型
适应性高。
利用 DesignExpert7.0.0软件对数据进行二
次多元回归拟合 ,得到柿叶黄酮提取得率(Y)对
编码自变量:微波功率(X1)、提取时间 (X2)和液
料比(X3)之间的二次多项回归方程:
Y=6.13 +0.26X1 +0.09X2 +0.082X3 -
0.063X1X2 -0.090X1X3 -0.050X2X3 -0.50X21 -
0.30X22 -0.23X23。
回归方程系数及显著性检查见表 3。
从表 3黄酮得率回归模型方差分析(ANO-
VA)可以看出:F回 =91.18>F0.01(9.4)=14.8, P<
表 3　回归方程系数及显著性检查
Table3　Regressioncoefficientandsignificancetest
方差来源 自由度 平方和 均方和 F P
回归模型 9 0.350425 0.038936 91.17595 <0.0001
X1-微波功率 1 0.032587 0.032587 76.30903 <0.0001
X2-提取时间 1 0.011629 0.011629 27.23231 0.0012
X3-液料比 1 0.013704 0.013704 32.08969 0.0008
X1X2 1 0.006343 0.006343 14.85413 0.0063
X1X3 1 0.025512 0.025512 59.74169 0.0001
X2X3 1 0.000547 0.000547 1.279821 0.2952
X12 1 0.155114 0.155114 363.2271 <0.0001
X22 1 0.028506 0.028506 66.75261 <0.0001
X32 1 0.053158 0.053158 124.4793 <0.0001
残差 7 0.002989 0.000427
失拟项 3 0.001718 0.000573 1.80287 0.2862
纯误差 4 0.001271 0.000318
总误差 16 0.353414
注:调整系数 R2 =0.9807
0.0001,表明模型极其显著 。黄酮得率 F失拟 =
1.800.05,
表明失拟不显著。柿叶黄酮得率模型一次项微
波功率(X1)(P<0.0001)、提取时间(X2)(P=
0.0012)、液料比(X3)(P=0.0008)极显著;二次
项均极显著;交互项 X1 X2(P=0.0063)、X1 X3(P
=0.0001)显著 , X2 X3(P=0.2952)不显著。
DesignExpert软件中 Box-Behnken法计算柿
叶黄酮得率回归模型的调整确定系数 (AdjR-
squared)AdjR2 =0.9807, 即该模型能 解释
98.07%响应值的变化 ,表示该模型拟合程度良
好 ,且试验误差小 ,说明响应曲面法优化柿叶总
黄酮的提取条件是可行的。
2.3.2　响应曲面分析
利用 DesignExpert7.0.0软件对表 2数据进
行二次多元回归拟合 ,所得到的二次回归方程的
等高线及响应曲面见图 5 ～图 7。根据二次模型
所得到的等高线及响应曲面可以评价试验因素
之间的交互作用强度 ,以及确定各因素的最佳水
平范围 。
由图 5可知:当液料比为 20∶1,提取时间不
变的条件下 ,微波功率在 400 W～ 420 W范围内
增大时 ,柿叶黄酮提取得率急剧增加 ,并在 420W
附近达到极大值而后缓慢降低 ,与单因素试验结
果吻合 。
由图 6可知:提取时间不变的条件下 ,固定
微波功率 ,曲线呈现陡峭增加后平滑递减的规
律 ,说明液料比在较低的水平下对柿叶黄酮提取
得率影响大于较高水平下的影响 。
图 5　提取时间 、微波功率的等高线和响应曲面图
Fig.5Contourandresponsesurfaceplotsfortheefectsofextractiontimeandmicrowavepowerontheyieldoftotalflavonoids
·524· 浙江农业学报　第 22卷　第 4期(2010年 7月)
图 6　微波功率 、液料比的等高线和响应曲面图
Fig.6 Contourandresponsesurfaceplotsfortheeffectsofmicrowavepowerandliquid-to-solidratioontheyieldoftotalfla-
vonoids
图 7　提取时间 、液料比的等高线和响应曲面图
Fig.7 Contourandresponsesurfaceplotsfortheefectsofextractiontimeandliquid-to-solidratioontheyieldoftotalfla-
vonoids
　　由图 7可知:微波功率固定的条件下 ,液料
比不变的情况下 ,柿叶黄酮提取得率受提取时间
的影响显著 ,表现为先升高后降低的较陡曲线 。
由图 5 ～图 7可以看出等高线呈椭圆 ,说明
提取时间和微波功率 、微波功率和液料比 、液料
比和提取时间之间交互影响显著 ,响应面陡峭说
明提取得率对提取时间 、微波功率和液料比的变
化敏感 [ 6 ～ 9] 。
对回归方程求导 ,并令其等于零 ,可以得到
曲面的最大点 ,即三个主要因素的最佳水平值 ,
转换后得到提取的最佳条件为:微波功率
422.360 W、提取时间 20.970min、液料比 20.660
∶1,此时柿叶总黄酮的提取得率达 6.15%。
2.4　模型验证
对试验进行验证 , 选择的条件为微波功率
425 W、提取时间为 20min、液料比 20∶1,黄酮的
得率分别为 6.09%, 6.08%, 6.11%, 6.06%,
6.12%,平均为 6.09%,数据重现性良好 ,偏差不
大 ,吸光度测量值稳定说明每次测定的黄酮含量
稳定 ,证明该结果是合理可靠的 。
3　结论
在单因素试验的基础上通过响应曲面法的
优化 ,获得微波辅助提取柿叶黄酮的最佳工艺条
件:微波功率 422.360 W、提取时间 20.970 min、
液料比 20.660 ∶1, 此时柿叶总黄酮的得率达
6.15%。模型经验证后结果稳定 ,表明响应曲面
法更好地反映了各因素对提取得率的影响 ,以及
因素间的相互作用强度 ,是一种比较好的优化工
·525·董江涛等:响应曲面法优化微波辅助提取柿叶总黄酮的工艺
艺的方法。
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(责任编辑　袁玉伟)
·526· 浙江农业学报　第 22卷　第 4期(2010年 7月)