全 文 ： 2006, Vol. 27, No. 12 食品科学 ※基础研究182
收稿日期：2006-08-10
作者简介：熊何健(1968-)，男，副研究员，硕士，主要从事天然活性物质的分离与功能研究。
荔枝壳中多酚氧化酶活性研究
熊何健，卢玉兰
(集美大学生物工程学院，福建 厦门 361021)
摘 要：本文对荔枝壳中多酚氧化酶(PPO)的活性及不同抑制剂的抑制效果进行研究。结果表明：荔枝壳多酚氧
化酶的最佳底物浓度为0.04mol/L，最适pH为7.0，最适温度为40℃；柠檬酸、抗坏血酸、硫代硫酸钠对PPO
活性表现出较好的抑制效果，三种抑制剂联合作用的最佳条件为0.01mmol/L的柠檬酸+0.04mmol/L的抗坏血酸
+0.004mmol/L的硫代硫酸钠，PPO活性的抑制率达85.8%。
关键词：荔枝壳；多酚氧化酶；活性；抑制
Characteristics of Polyphenol Oxidase in Lichi Hull
XIONG He-jian，LU Yu-lan
(School of Bioengineering, Jimei University, Xiamen 361021, China)
Abstrace ：Th activity of PPO of lichi hull and the control effect for different inhibitor were studied in this paper. The result
showed that the fine substrate consistence was 0.04mol/L, the proper pH was 7.0, the optimum temperature was 40℃ for PPO
of lichi hull;citric acid, ascorbic acid,hyposulphite display better inhibition effect on PPO activity. The optimum inhibition
condition was 0.05mmol/L citric acid add 0.2mmol/L ascorbic acid add 0.02mmol/L hyposulphite, the PPO residual activity was
14.2%.
Key words：lichi hull；polyphenol oxidase；activity；inhibition
中图分类号：O629.8 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2006)12-0182-04
多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)是植物体中
广泛分布的核基因编码的质体铜金属酶，在细胞质中合
成。在大多数的果蔬中，PPO存在的活力较高。目前
已在菠萝、小麦、燕麦、大豆、马铃薯、蘑菇、番
茄、茄子、茶叶等作物上分离出PPO[1,2]。荔枝是我国
特有的珍果，以色、香、味、形皆美而驰名中外，
但由于荔枝盛产于夏季高温季节，生理代谢旺盛，易
褐变腐烂，极难贮藏，有“若离本枝，一日色变，
二日香变，三日味变，四日色、香、味尽去”之说，
荔枝果壳中含有大量的多酚类物质，荔枝褐变主要缘自
多酚类物质的酶促和非酶促氧化、降解[3,4]。褐变是荔
枝保鲜最突出的问题，而有关荔枝壳中多酚类物质的开
发应用亦涉及原料褐变的控制问题。本文通过荔枝果皮
中PPO的活性分析，考察不同抑制剂对荔枝壳PPO的
抑制效果，为荔枝保鲜和荔枝壳贮藏的防褐变措施提供
依据。
1 材料与方法
1.1材料
当日采摘的漳州蓝竹荔枝， 0～4℃以下贮藏备用。
试剂均为分析纯。
1.2方法
1.2.1PPO酶液的制备
取 100g鲜荔枝壳，清洗干净、切碎，加200ml
0～4℃ 0.01mol/L磷酸缓冲液 (pH7.0)于组织捣碎机中充
分捣碎(使用点动键，以防温度升高的太快)后，放在
4℃的冰箱中浸提18h，再在10000r/min、4℃的冷冻离
心机中离心20min，弃沉淀，得上清液．将上清夜分
装到分子量为12K的透析袋中对蒸馏水和磷酸缓冲液进
行充分透析24h后，用聚乙二醇20000对透析袋进行浓
缩至一定的体积，即获得多酚氧化酶粗酶液，将收集
好的多酚氧化酶粗酶液分装于小试管中并保存于－20℃
下备用。
1.2.2酶作用生成产物最大吸收波长的测定
于试管中加0.6ml PPO酶液，0.6ml 0.1mol/L邻苯二
183※基础研究 食品科学 2006, Vol. 27, No. 12
酚溶液，1.8ml 0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)，用酶液加
2.4ml磷酸缓冲液做对照，在紫外分光光度计中扫描其最
佳吸收波长。
1.2.3PPO的活力测定
取一管酶液放于4℃下解冻，移取1.8ml 0.01mol/L
磷酸缓冲液 (pH7.0)于试管中，加入0.6ml 0.1mol/L邻苯
二酚溶液和荔枝壳PPO粗酶液0.6ml，将酶液与底物和
缓冲液混合均匀。用可见光分光光度计在波长420nm处
测定吸光度。从酶液加入后开始计时，每30s读一次 OD
随时间的变化值。一个酶活力定义为：在测定条件下，
吸光度值每分钟增加0.001所需要的酶量定义为一个酶活
力单位(U)。
1.2.4底物浓度与PPO活力的关系
取2.0ml酶活反应体系包括：0.4ml PPO酶液、
0.8 ml 0.1mol/L邻 苯二酚、0.8ml 0.01mol/L磷酸缓冲液。
在2.0ml反应体系中，分别取梯度为0.2ml的0.2～1.4ml
0.1mol/L邻苯二酚及0.4ml的酶液 ，以0.01mol/L磷酸缓
冲液(pH7.0) 补足至 2.0ml。水浴40℃下加热5min测定
PPO活力。
1.2.5温度对PPO活力的影响
根据上面最佳底物浓度的结果来决定酶液、邻苯二
酚和磷酸缓冲液之间的关系。取0.4ml PPO酶液、0.8ml
0.1mol/L邻苯二酚、0.8ml 0.01mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)混
合液，分别在温度梯度为5℃的25～65℃温度下水浴加
热5min，从酶液加入后开始计时测定PPO活力。
1.2.6pH对PPO活力的影响
配制同一浓度不同pH值的磷酸缓冲液。取0.4ml
PPO酶液、0.8ml 0.1mol/L邻苯二酚、0.8ml 0.01mol/L磷
酸缓冲液，将磷酸缓冲液改成不同pH值缓冲液。分别
水浴40℃下加热5min后，再将其混合均匀。测定PPO
活力。
1.2.7抑制剂对PPO活力的影响
在2.5ml的反应体系中，加入0.4ml PPO酶液、
0.8ml 0.1mol/L邻苯二酚、0.8ml 0.01mol/L磷酸缓冲液，
以及分别加入0.5ml柠檬酸、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、
植酸、、硫代硫酸钠、氯化钠、盐酸溶液为抑制剂，
分别考察它们对多酚氧化酶的抑制效果。在单因素分析
的基础上，选择三种最佳抑制剂，并选用L9(33)正交设
计(见表1)，进行抑制剂联合抑制效果实验，最终确定
水平 A 柠檬酸(mmol/L)B 抗坏血酸(mmol/L)C 硫代硫酸钠(mmol/L)
1 0.002 0.016 0.0012
2 0.004 0.02 0.002
3 0.01 0.04 0.004
表1 正交试验因素水平表
Table 1 Design form of orthogonal test
三种抑制剂的最佳浓度。
2 结果与分析
2.1酶作用生成产物最大吸收波长的测定
由紫外分光光度计扫描结果得知，荔枝壳PPO作用
生成产物最大吸收波长为420nm。此结果与汤凤霞等[5]在
枇杷果浆多酚氧化酶活性抑制的研究和郑宝东等[6]等对建
莲中多酚氧化酶动力学特性的研究中使用的波长一致。
2.2PPO活力的测定
以30s的时间间隔测定15min内的荔枝壳PPO活性
(用吸光度表示)，做出反应曲线，结果见图1。
0.4
0.3
0.2
0.1
0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1
0
1
1
1
2
1
3
1
4
1
5
吸
光
值
时间(min)
图1 荔枝壳 PPO的活力曲线
Fig.1 Activity curve of PPO
如图1所示，反应产物的吸光度随着时间的延长
几乎成线性增长，说明荔枝壳PPO的活性在初始的8～
10min内始终维持在最初的水平，之后随着时间的延长
而下降。荔枝壳PPO活力在5min之内呈线性关系，
R2=0.9999。根据酶活力的定义，以5min内吸光值的变
化率计算酶活力值。
2.3底物浓度与PPO活力的关系
底物浓度在0.01～0.07mol/L范围内对PPO活力的影
响，结果如图2。
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
酶
活
性
(
U
)
底物浓度(mol/L)
图2 底物浓度对 PPO活性的影响
Fig.2 Relationship between catechol concentration and PPO
activity
0 0.010.020.030.040.050.06.07
由图2可以看出，在供试反应体系中，当邻苯二
酚浓度为0.01～0.04mol/L时，酶活力呈上升增长趋势，
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当浓度为0.04～0.06mol/L，酶活力几乎没有变化，超过
0.06mol/L时 ，酶活力反而降低，出现底物抑制现象。
因此该酶促反应存在一个适宜的邻苯二酚用量范围，在
此范围内，底物对酶活没有明显的抑制作用．当底物
浓度为0.04mol/L时，酶活表现最高；超过此值，酶活
反而降低。与刘振宇等[7]在羊栖菜多酚氧化酶特性研究
中的变化趋势相一致。
2.4温度对PPO活力的影响
温度对多酚氧化酶活性有双重影响，一方面，温
度升高加快酶催化反应速度；另一方面，促使酶蛋白变
性，因此温度对多酚氧化酶的影响是以上两种对抗效应
的综合反映。在25～65℃温度范围内，对PPO活性进
行检测。结果见图3。
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
酶
活
性
(
U
)
温度(℃)
图3 温度对 PPO活性的影响
Fig.3 Effect of temperature on the activity of PPO
253035404550556065
由图3可知：荔枝壳PPO活力在 25～40℃范围内
呈上升趋势，其最适温度为 40℃；在25～60℃温度下，
酶均能保持较高的活力；但温度超过60℃时，其活力
则迅速下降， 60℃时的酶活力是40℃的是74.6%，而
65℃时的酶活力则降为21.68%，说明荔枝多酚氧化酶的
耐高温能力较差。刘振宇等[7]羊栖菜多酚氧化酶特性研
究中认为，羊栖菜PPO的最适温度为40～45℃；张桂
芝等[8]在马铃薯多酚氧化酶特性的研究中指出，马铃薯
PPO的最适温度为25℃，汤凤霞等[5]研究的枇杷果浆PPO
的最适温度为40℃；秦卫东等[9]在仙人掌多酚氧化酶的
特性及抑制研究中认为仙人掌PPO的最适温度为50℃，
说明PPO最适温度随植物种类表现出一定的差异。
2.5pH对PPO活力的影响
实验对多酚氧化酶在pH5～12的范围内的活性进行
研究，结果见图 4。
结果表明，在试验反应体系中，酶活力的适宜pH
呈中性，pH7.0时酶活最高，达到90U；在酸性条件
下，酶活力甚小，当pH超过6.0时，荔枝壳PPO活
力迅速上升， pH6.8时酶活力是pH7.0的 68.89%；酶活
力在 pH7.0时出现峰值，随着pH值的继续增大，荔枝
壳的酶活力呈下降趋势。
2.6抑制剂对PPO活力的影响
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
酶
活
性
(
U
)
pH
图4 pH对 PPO活力的影响
Fig.4 Effect of pH on the activity of PPO
5 6 7 8 9 10 11 12
汤凤霞等[5]在枇杷果浆多酚氧化酶活性抑制的研究中
指出，柠檬酸、抗坏血酸、亚硫酸氢钠、植酸等都
能够抑制PPO活性；詹嘉红等[10]在橄榄果实的研究中也
发现一定浓度的抗坏血酸、亚硫酸钠、对PPO活性有
明显的抑制作用。黄浩[11]在抑制剂对红豆杉多酚氧化酶
活性影响的研究中也发现氯化钠 (NaCl)强烈抑制多酚氧
化酶的活性。吴明江等[12]对苹果梨的研究中发现抗坏血
酸(VC)、亚硫酸氢钠(NaHSO3)、氯化钠(NaCl)、柠檬
酸均抑制 PPO的活性，并且以多种抑制剂综合使用的效
果最佳。
单一抑制剂的抑制实验结果表明，柠檬酸、抗坏
血酸、亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、植酸、盐酸、氯
化钠对荔枝壳PPO有一定的抑制作用，其中柠檬酸、抗
坏血酸、硫代硫酸钠三种抑制剂的抑制效果明显优于其
他抑制剂。因此，采用L9(34)正交试验分析它们对PPO
活性的联合抑制效果。结果见表2和图5。
实验号
柠檬酸 抗坏血酸 硫代硫酸钠 D 对PPO的
(mmol/L)(mmol/L)(mmol/L)误差 抑制率
1 1 1 1 1 0.1282
2 1 2 2 2 0.4129
3 1 3 3 3 0.6968
4 2 1 2 3 0.2387
5 2 2 3 1 0.4452
6 2 3 1 2 0.6516
7 3 1 3 2 0.6194
8 3 2 1 3 0.3702
9 3 3 2 1 0.8258
K1 1.23790.9863 1.15 1.3992
K2 1.33551.2283 1.47741.6839
K3 1.81542.1742 1.76141.3057
k1 0.412630.328770.383330.46640
k2 0.445170.409430.492470.56130
k3 0.605130.724730.587130.43523
R 0.19250.395970.20380.12607
表2 正交试验表
Table 2 Results of orthogonal test
根据极差分析，三因素中对荔枝壳多酚氧化酶的影
响顺序是：抗坏血酸＞柠檬酸＞硫代硫酸钠，正交实验
185※基础研究 食品科学 2006, Vol. 27, No. 12
优化的结果是：A3B3C3，即硫代硫酸钠的浓度为
0.004mmol/L、柠檬酸的浓度为0.01mmol/L、抗坏血酸
的浓度为0.04mmol/L。
在最佳条件下测定联合抑制剂对荔枝壳多酚氧化酶
的抑制效果，抑制率达到85.8%。
3 结 论
3.1实验条件下，荔枝壳多酚氧化酶的最佳底物浓度
为0.04mol/L；荔枝壳多酚氧化酶的最佳温度为40℃；
荔枝壳多酚氧化酶的最佳pH值为7.0。
3.2柠檬酸、抗坏血酸、硫代硫酸钠对荔枝PPO活性
表现出较强的联合抑制效果，最佳抑制浓度为0.01mmol/
L的柠檬酸+0.04mmol/L的抗坏血酸+0.004mmol/L的硫代
硫酸钠，抑制率达85.8%。
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收稿日期：2006-09-08
作者简介：冯培勇(1977-)，男，硕士，主要从事微生物产酶的研究。
一株绿色木霉产纤维素酶的性质研究
冯培勇1，常 迪 2，杨立红1
(1.鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025；
2.鲁东大学大学英语教学部，山东 烟台 264025)
摘 要：摇瓶培养绿色木霉得到纤维素酶粗酶液，分别测定C1酶、Cx酶、β-葡萄糖苷酶的活力并测定温度、
pH、底物浓度、金属离子对不同酶组分活力的影响。结果表明不同反应条件对不同酶组分的活力影响各异。
关键词：绿色木霉；纤维素酶；性质
Properties of Cellulase Activity from Trichoderma ride
FENG Pei-yong1，CHANG Di2，YANG Li-hong1
(1.College of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China；
2.College English Department, Ludong University, Yantai 264025, China)
Abstract ：The crude cellulase of Trichoderma viride w s obtained by liquid fermentation, and the C1 activity, Cx activity and
β-glucanase activity were measured respectively. The results indicated that temperature, pH, substrate concentration and metallic
ions affect the activity of C1 activity, Cx activity and β-glucanase ctivity differently.
Key words：Trichoderma viride；cellulas；characteristics
中图分类号：Q814.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2006)12-0185-03