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榨前分离苹果皮多糖的鉴定
及抗氧化活性研究
窦 姣，郭玉蓉* ，薛战锋，陈玮琦，李锦运，孟永宏
( 陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710062)
摘 要:以榨前分离苹果皮为原料，采用超声波辅助法提取多糖，通过改变洗脱液的极性对多糖进行分离纯化，并对各
组分的抗氧化活性进行分析。结果表明:多糖样品经过 DE－52 纤维素柱梯度洗脱得到三个含量较大的洗脱峰，分别
为水、0.3mol /L NaCl和 0.9mol /L NaCl洗脱组分。采用 Sephadex G－200 凝胶柱对洗脱组分进一步纯化，得到 APPS－
H2O、APPS－0.3mol /L和 APPS－0.9mol /L三种不同组分的多糖纯品。抗氧化实验表明:三种不同组分多糖均有一定的
还原力、清除·OH、DPPH·，O －2·的能力，但其抗氧化能力均小于粗多糖和 VC。
关键词:苹果皮，多糖，分离纯化，抗氧化活性
Purification and antioxidative activity of polysaccharides from
cold－extracting apple peel
DOU Jiao，GUO Yu－rong* ，XUE Zhan－feng，CHEN Wei－qi，LI Jin－yun，MENG Yong－hong
( Shaanxi Normal University，College of Food Engineering and Nutritional Science，Xi’an 710062，China)
Abstract: Apple polysaccharides were extracted from cold－extracting apple peel.The isolation and purification of
apple polysaccharides were studied by changing the polarity of eluent and the antioxidative activity of
polysaeeharides were analysed.The results indicated that apple polysaccharides of apple peel through DE－ 52
cellulose column chromatography obtained three main elution peaks. The main elution components of water，
0.3mol /L NaCl and 0.9mol /L NaCl were further pured by Sephadex G－200 medium and were named as APPS－
H2O、APPS－0.3mol /L and APPS－0.9mol /L.The antioxidation experiments showed that all of three polysaccharides
had the reducing powers and the scavenging activity of·OH，DPPH·and O －2·，but the antioxidative activities were
lower than the crude polysaccharides and VC.
Key words: apple peel; polysaeeharides; isolation and purification; antioxidative activity
中图分类号:TS201.2 文献标识码:A 文 章 编 号:1002－0306(2014)01－0111－05
收稿日期:2013－07－09 * 通讯联系人
作者简介:窦姣( 1990－ ) ，女，硕士，主要从事食品功能成分开发及利
用方面的研究。
基金项目:农业部现代苹果产业技术体系建设专项基金资助
( CAＲS－28) 。
多糖又称多聚糖(polysaccharides)，由 10 个以上
单糖残基通过糖苷键连接而成，是一类广泛存在于
动植物、微生物细胞中的重要的生物大分子物质［1］。
随着对多糖生物活性研究的深入及其在医药领域的
广泛应用，消费者对多糖的需求日趋增加［2－3］。苹果
多糖是植物多糖的重要种类之一，苹果渣可以作为
苹果多糖来源之一，我国作为世界的苹果浓缩汁生
产大国，每年都有上百万吨的苹果渣资源急需再利
用［4］。榨前分离技术是采用冷破碎设备在果汁压榨
前实现果皮、果核、果籽与果肉的分离，从而提高果
汁的外观品质，方便苹果皮、肉的分别利用［5］。苹果
果皮是苹果的重要组成部分，其中多糖含量丰富，是
一种有开发前景的提取多糖的材料。目前，粗多糖
中常含有单糖、低聚糖、游离蛋白质、色素等杂质，不
但会影响多糖生物活性，还会影响多糖的定量、定性
分析及结构测定，因此多糖的分离纯化成为多糖研
究和利用的重要内容之一［6］。另外，多糖的生物活性
也是研究的热点之一，国内外对苹果多糖生物活性
的研究主要集中在降血脂、抗癌、预防肥胖和降低胆
固醇水平等方面［7］，但对苹果皮多糖的研究尚未见报
道。本实验主要通过对榨前分离苹果皮中的多糖进
行提取、分离、纯化并进一步研究其不同组分的抗氧
化活性，旨在对我国苹果皮资源的开发利用提供一
些新思路。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
苹果皮 陕西师范大学冷破碎制汁生产线提
供;透析袋 华美生物工程公司上海分公司;
Cellulose DE － 52 纤维素柱填料、Sephadex G － 200
medium凝胶柱填料 北京索莱宝科技有限公司提
供;无水乙醇、石油醚、乙醚、NaCl、苯酚、浓硫酸、邻
苯三酚、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、1，1－二苯基－2－
DOI:10.13386/j.issn1002-0306.2014.01.065
112
三硝基苯肼(DPPH)、三氯乙酸、Na2HPO4、NaH2PO4、
硫酸亚铁铵、铁氰化钾、邻二氮菲、H2O2 均为分
析纯。
实验 DBS－100 部分自动收集器、DHL－B 电脑横
流泵 上海沪西仪器厂;ＲE 52－99 旋转蒸发仪 上
海亚荣生化仪器厂;LGJ－18C 冷冻干燥机 北京四
环科学仪器厂;WFJ2100 型分光光度计 尤尼科仪
器有限公司上海分公司;TU－1810 紫外可见分光光
度计 北京普析通用仪器厂;PHS－3C 精密 PH 计
上海精密科学仪器有限公司;高速万能粉碎机 北
京科伟永兴仪器有限公司;SGW－1 自动旋光仪 湖
北省自动化研究所。
1.2 实验方法
1.2.1 榨前分离苹果皮多糖的提取制备 苹果皮→
55℃干燥→粉碎( 过 60目筛) →乙醚 ∶石油醚( 1∶4) 回流脱脂
→超声辅助提取 ( 120min，料液比 1 ∶ 40，70℃，超声功率
200W) → 95% 乙醇沉淀 ( 4℃，静置过夜 ) →离心 20min
( 4000r /min) →沉淀物用无水乙醇、丙酮洗涤 2 次→真空冷冻
干燥→苹果皮粗多糖。
1.2.2 榨前分离苹果皮多糖的分离纯化 苹果皮多
糖的分离:苹果皮粗多糖→用蒸馏水溶解→过 DE－52 纤维
素柱→不同浓度 NaCl溶液梯度洗脱→收集不同组分苹果皮
多糖→浓缩( 原体积的 1 /6) →透析→浓缩→真空冷冻干燥→
不同组分苹果皮多糖半纯品。
苹果皮多糖的纯化:苹果皮多糖半纯品→用蒸馏水
溶解→过 G－200 凝胶柱→蒸馏水洗脱→收集不同组分苹果
皮多糖→浓缩( 原体积的 1 /4) →透析→浓缩→真空冷冻干燥
→不同组分苹果皮多糖纯品［8］。
1.2.3 不同组分苹果皮多糖的鉴别反应
1.2.3.1 多糖的纯度鉴定 将分离纯化得到的不同
组分多糖纯品配制成 10mg /mL 溶液，以化学方法进
行淀粉、多肽、蛋白质和氨基酸等杂质的检验。茚三
酮反应鉴别是否含氨基酸、肽类或蛋白质等杂质;苯
酚－硫酸法鉴定是否为糖类物质;三氯化铁反应鉴别
是否含酚类物质;碘－碘化钾反应鉴别是否含淀粉类
杂质;硫酸－咔唑法鉴定是否含有糖醛酸［9］。
1.2.3.2 比旋光度的测定 不同种类的多糖在相同
条件下的比旋光度不同，通过测定不同组分多糖溶
液的比旋光度来鉴定分离出的多糖是否是同一多
糖［10］。每一组分多糖的比旋光度测定 8 次取平
均值。
［α］20D =
100α
lc
式中:［α］20D 为 20℃钠光谱 D 线测定;α 为测得
的旋光度;l为旋光管的长度(1dm)，c 为多糖溶液浓
度 1.0g /100mL。
1.2.3.3 不同组分多糖紫外光谱扫描 蛋白质、多
肽、核酸等物质在 260～280nm处有明显吸收峰，通过
紫外扫描鉴别多糖中是否含有蛋白质类杂质［11］。
1.2.4 榨前分离苹果皮多糖体外抗氧化活性研究
1.2.4.1 测定不同组分多糖对·OH 的清除能力 应
用邻二氮菲－Fe2 +－H2O2 法检测
［12］。以不同组分苹果
皮多糖为自由基清除剂，测定苹果皮多糖对·OH 的
清除能力。反应体系中分别加入邻二氮菲、pH7.4 的
磷酸缓冲液、FeSO4 溶液、不同组分和浓度的苹果皮
多糖。苹果皮多糖的浓度设定为 1.0、2.0、4.0、6.0、
8.0、10.0mg /mL。实验设置加样管、氧化管、对照管，
37℃水浴锅中保温 60min，在 510nm 处测定吸光值，
每个处理进行三次重复，以 Vc 作对照，计算清除率。
邻二氮菲－Fe2 +－H2O2 反应体系组成见表 1。
清除率(%)=
A2 － A0
A1 － A0
× 100
式中:A0 表示氧化管的吸光值;A1 表示对照管的
吸光值;A2 表示加样管的吸光值。
表 1 邻二氮菲－Fe2 +－H2O2 反应体系组成表
Table 1 The composed table of the
1，10－phenanthroline－Fe2 +－H2O2 reaction system
反应试剂
对照管
(mL)
氧化管
(mL)
加样管
(mL)
pH7.4 磷酸盐
缓冲液(0.2mol /L)
2.0 2.0 2.0
邻二氮菲(0.1mmol /L) 2.0 2.0 2.0
dH2O 2.0 1.0 0
FeSO4 溶液(0.15mmol /L) 1.0 1.0 1.0
苹果皮多糖 0 0 1.0
H2O2 溶液(0.01%) 0 1.0 1.0
总体积(mL) 7.0 7.0 7.0
1.2.4.2 测定不同组分多糖对 O －2·的清除能力 应
用邻苯三酚自氧化法，在该反应体系的氧化过程中
有 O －2·的生成，O
－
2·与多糖作用，产生有特定吸收波
长的化合物［13］。邻苯三酚在弱碱性条件下迅速自氧
化，该过程中产生 O －2·，同时产生中间有色物质，该
产物在 325nm处有强烈的光吸收。不同组分多糖的
浓度设定为 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg /mL，利用紫
外可见分光光度计在 325nm 处测定吸光值，每个处
理进行三次重复，以 VC 作对照，计算清除率。邻苯
三酚自氧化反应体系见表 2。
清除率(%)=
A0 － A1
A0
× 100
式中:A0 表示自氧化管氧化速率;A1 表示加样管
氧化速率。
表 2 邻苯三酚自氧化反应体系组成表
Table 2 The composed table of the self－oxidation of
1，2，3－phentriol reaction system
反应试剂
对照管
(mL)
自氧化管
(mL)
加样管
(mL)
pH8.24 Tris－HCl
缓冲液(0.05mol /L)
2.5 2.5 2.5
dH2O 0.5 0.5 0
邻苯三酚(0.01mol /L) 0 0.1 0.1
苹果皮多糖 0 0 0.4
总体积(mL) 3.0 3.0 3.0
1.2.4.3 测定不同组分多糖对 DPPH·的清除能力 分
别配制浓度为1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg /mL 的不
同组分多糖溶液。移取各浓度的糖溶液 2.0mL 于小
113
试管中，分别加入 0.2mmol /L的 DPPH溶液 2.0mL并
摇匀，静置 40min，以体积分数为 50%乙醇作空白调
零［14］，在 525nm处测定吸光值，每个处理重复三次，
以 VC 作对照，计算清除率。
自由基清除率(%)=
1－(Ai－Aj)
A0
× 100
式中:A0 为未加苹果皮多糖 DPPH 溶液的吸光
值;Ai 为加苹果皮多糖后 DPPH 溶液的吸光值;Aj 为
对应多糖溶液自身的吸光值。
1.2.4.4 不同组分多糖总还原力的测定 分别配置
浓度为 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0mg /mL的多糖溶液。
取 1mL 多糖溶液，加入 2.5mL pH6.6 的磷酸盐缓冲
液，再加入 2.5mL 1% 的铁氰化钾混匀，50℃ 水浴
20min，立即加入 2.5mL 10% 的 TCA 终止反应，
4000r /min离心 10min。取上清液 2.5mL 于试管中，
先加入 2.5mL 无水乙醇，再加入质量分数 0.1% 的
FeCl3溶液 0.5mL，混匀，以蒸馏水作空白调零，以 VC
作对照，在 700nm处测定吸光值［15］。
2 结果与分析
2.1 榨前分离苹果皮多糖的分离纯化
苹果 皮 粗 多 糖 (apple peel polysaccharides，
APPS)过 DE－52 纤维素柱，利用不同浓度的 NaCl 溶
液梯度洗脱得到三个含量较大的洗脱峰，分别为蒸
馏水洗脱峰、0.3mol /L NaCl 洗脱峰、0.9mol /L NaCl
洗脱峰，0.1、0.5、0.7mol /L NaCl洗脱未得到明显的洗
脱峰，将各组分再过 Sephadex G－200 层析柱进一步
纯化后，分别得到单一的洗脱峰，说明得到的三个组
分均为分子量相同的同一组分，将其依次命名为
APPS－H2O(水洗组分)、APPS－ 0.3mol /L(0.3mol /L
NaCl 洗脱组分)和 APPS－0.9mol /L(0.9mol /L NaCl
洗脱组分)。APPS－0.3mol /L、APPS－H2O 和 APPS－
0.9mol /L 三种组分多糖的得率分别为:19.3%、
12.1%、8.2%。
2.2 三种不同组分多糖的纯度鉴定结果
对分离得到的三种不同组分苹果皮多糖进行紫
外光谱扫描，结果见图 2。发现在 260～280nm 处没
有明显的吸收峰，且茚三酮反应结果为阴性，说明分
离得到的三种多糖均不含蛋白质和核酸类物质;苯
酚－硫酸法和硫酸－咔唑反应结果均为阳性，说明三
种组分由糖醛酸类糖组成;三氯化铁反应和碘－碘化
钾反应均呈阴性，说明三种组分不含酚类物质，是非
淀粉多糖。
不同多糖具有不同的比旋光度，利用这一原理
可以鉴定三种多糖是否为同一多糖。此外，不同多
糖在不同浓度的乙醇溶液中具有不同的溶解度，多
糖水溶液经不同浓度的乙醇沉淀，如所得沉淀物具
有相同的比旋光度则证明该多糖为均一组分。通过
对 APPS－H2O，APPS－0.3mol /L和 APPS－0.9mol /L三
种多糖的比旋光度测定，发现三种多糖具有不同的
比旋光度，说明分离纯化得到的三种组分不是同一
种多糖。经不同浓度的乙醇沉淀，所得沉淀物的比
旋光度基本相同，说明三种多糖均为均一多糖。
2.3 榨前分离苹果皮多糖体外抗氧化能力测定结果
图 1 苹果皮多糖过 Sephadex G－200 的洗脱曲线
Fig.1 The Sephadex G－200 medium chromatogram of APPS
注:A－水洗组分;B－0.3mol /L NaCl洗脱组分;
C－0.9mol /L NaCl洗脱组分;图 2 同。
2.3.1 三种不同组分多糖对·OH 的清除能力 由图
3可以看出，粗多糖及分离纯化得到的三种组分多糖
均具有一定的清除·OH 能力，其清除能力与多糖浓
度在一定范围内呈正相关，浓度越高其清除能力越
强。APPS－H2O 清除·OH 能力强于 APPS－0.3mol /L
和 APPS－0.9mol /L，而后两者清除·OH 的能力相当。
原因可能是多糖对·OH的清除能力与多糖的极性有
关，而水洗组分 APPS－H2O 为复合有酚类基团的弱
极性组分，所以其抗氧化活性强于盐洗组分 APPS －
0.3mol /L和 APPS－0.9mol /L［9］。
2.3.2 三种不同组分多糖对 O －2·的清除能力 由图4
可以看出，分离纯化得到的三种不同组分多糖对O －2·
的清除能力都较弱，随着多糖浓度的增加，对 O －2·的
抑制率由7%增加到 17%左右，表明分离纯化出的三
种不同组分多糖对 O －2·的抑制率随浓度变化增加缓
慢。而粗多糖对 O －2·的清除能力高于经分离纯化得
到的组分多糖，且随浓度的变化，清除率呈上升趋
势。其他人的研究也证实了，许多植物多糖均具有
一定的清除 O －2·能力，但当多糖经分离纯化后，其清
除 O －2·能力有所降低
［16］。
2.3.3 三种不同组分多糖对 DPPH·的清除能力 由
114
图 2 三种不同组分苹果皮多糖的紫外扫描图谱
Fig.2 The ultraviolet spectrum of the
three homogeneous polysaccharides
图 3 三种不同组分多糖清除·OH的能力
Fig.3 The inhibitory capacity to·OH of
three homogeneous polysaccharides
图5可以看出，三种组分多糖均有一定的清除 DPPH·
能力，其清除 DPPH·能力与多糖浓度在一定的浓度
范围内呈正相关。APPS－H2O 清除 DPPH·能力强于
APPS－0.3mol /L 和 APPS－0.9mol /L。这可能与多糖
的极性有关，水洗组分 APPS－H2O 的极性比盐洗组
分 APPS－0.3mol /L和 APPS－0.9mol /L 低，极性越弱，
其清除能力越强，抗氧化活性越高。这一结果与前
人在多糖纯化中取得的结果相同［9］。
2.3.4 三种不同组分多糖的总还原力测定 由图 6
图 4 三种不同组分多糖清除 O －2·的能力
Fig.4 The inhibitory capacity to O －2·
of three homogeneous polysaccharides
图 5 三种不同组分多糖清除 DPPH·的能力
Fig.5 The inhibitory capacity to DPPH·
of three homogeneous polysaccharides
可以看出，三种组分多糖均有一定的还原力，但是
OD值均很小。在相同浓度下，APPS－H2O 的还原力
略高于 APPS－0.3mol /L和 APPS－0.9mol /L，而后两者
的还原力较接近，在一定浓度范围内表现出量效关
系，即随着多糖浓度的增加，其还原力也逐渐增加。
多糖经过纯化后，还原力均比粗多糖要低，且低于
Vc。原因可能为:在纯化过程中粗多糖中抗氧化能
力较强的酚类物质被滞留而与纯品组分分离，导致
纯品的总还原力降低［17］。
图 6 三种不同组分还原力测定结果
Fig.6 The reducing powers of
three homogeneous polysaccharides
3 结论
苹果皮经超声波辅助提取，除杂，过 DE－52 纤维
素柱和 Sephadex G－200 medium凝胶柱分离纯化后，
得到 APPS－H2O、APPS－0.3mol /L 和 APPS－0.9mol /L
三种较纯的多糖组分。三种不同组分多糖均有一定
的还原力、清除·OH、DPPH·和 O －2·的能力，但其抗氧
115
化能力均小于粗多糖和 Vc;而苹果皮多糖在降血脂、
抗癌等其他方面的生物活性还有待于更深入的
研究。
参考文献
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454－459.
( 上接第 110 页)
间越长，鸡骨高汤各理化指标越高，风味越好;当达
到一定程度后，对于常压而言温度、时间的变化对鸡
骨高汤各指标没有显著影响，而对于高压来说，随着
温度及时间的进一步变大各指标均有显著的下降;
此外高压熬煮所得高汤中各理化指标显著高于常
压，抽提更彻底，当熬煮方式为高压 115℃(0.07MPa)
熬煮 60min时，所得鸡骨汤中的营养物质含量最高，
感官品质最好;其中总氮含量 2.8mg /mL，氨基酸态氮
含量 63.9mg /100mL，胶原蛋白含量 25.07mg /mL，感
官评分达 23.46 分。
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