全 文 ：四川大学学报 ( 自然科学版 )
Jou
r nal o f Si e hu a nU i n
v er si y tN a tu r al 歇 i e n e eEdi ti o n Vo l . 1 3 No . 1 1 9 94
岩豆凝集素寡糖链的研究 *
曾仲奎 郑 建 周 红
(生物 系 )
摘要 用拼解法释放了岩豆凝集素伍。 L )的寡糖链 ,经离子交换柱层析和滤纸层析除去肤
链和其它小分子物质 ,所获得的寡糖部分 , 以 N aB H 。还原 ,得到还原末端为 N 一乙酞氨基葡萄糖醇
的寡糖链 . 再经 iB -o G el -P 4 凝胶柱过滤 ,可以从 M D L 分离出两个寡搪链 . 此纯化的两个寡糖链
经甲醇一盐酸水解 ,最后制备三甲基硅醚衍生物 ,用气相色谱法分析其搪基组成。 分析结果表明 ;
MD L 分子中含有 以 N 一型塘普键连接的两条寡搪链 ,其糖基组成分别为 : M aZ 1 6uF cl GI 南 A C: 和
M a」1 . uP
e ,G l e N A e Z
。
关键词 糖组成 ,糖蛋白 ,岩豆凝集素 ,寡搪·
中图法分类号 Q s l3 .
糖蛋 白是糖复合物中很重要的一类 。 山于糖蛋白在生物体内十分活跃 ,其分子中的寡
糖 链部分可以作为分子识别的标志 , 启动和调节一系列生物学反应 , 因此对寡糖链 的研究
一 直是糖 蛋白研 究领 域 中的一个重 点 。 我们在文 [ 1一 1 1 ]的基 础上 , 研究了岩豆凝集素
(珑 l l e t i a d i e ls ian a H以r ms · lea t i n ,简称 M D L )的寡糖链的分离纯化及糖基组成测定 。
1 材料和方法
实 验 用 三 甲 基 氯 硅 烷 ( itr m et h yl hc l or os il an e , 简 称 T卜ICS ) , 六 甲 基 硅 胺 烷
( H e x am
e th y ld is i laz an
e ,简称 H M D S ) , N 一 乙酸葡萄糖胺 ( G l e N A e ) 为 s i s m a 产 品 , N 一乙酸半乳糖
胺 ( G a lN A e ) 为 J . T . 玩 k e r e h e m i ca l e o . 产品 , 岩 藻糖 ( F u e ) 为 se r v a 产品 , 甘 露糖 (M an ) 为
lF u k a 产品 , N aB H ` 为 A ld r ie h C h e m i ca 一C o L t d 产品 , D o w e x 5 0W ( H + 型 )为 D o w e h e m i ca l e o .
产品 , iB 。 一 C el P 一组为 iB o R ad C O . 产品 。 其余试剂为分析纯 ,并根据需要对试剂作进一步纯化
处理 。
1
.
1 岩豆凝集素的纯化 岩豆 (M i l le t ia d ie ls i a an aH r n : 5 . )种子按作者所报道的方法纯化 [” 】。
纯化的 M O L 在 P A G E 或 s D s 一 P A G E 上均呈现单一蛋白带 。
1
.
2 麟解反应及寡糖链的纯化 l[, 〕 无水脱系以水合脐经 甲苯和 氯化钙处理 , 无水条件下
回流 如 , 然后蒸馏收集 93 一 94 ℃ 馏分 . 待分层后取下层无水脱装于试管 内封 口 , 刁“ c 干燥条
件下暗处保存 。
本文于 1 9 9 2 年 3 月 1 4 口收到
. 国家自然科学基金资助项日
1 1 4四川大学学报 ( 自然科 学版 )第 3 1 卷
M DL 的脐解及寡糖链的纯化参照 T a kas i k等 的方法 [ls , `月 。 取 M D L 0 . 8一 1 . Zm g , 经
P 20 5 在干燥器内干燥过夜 ,与 I n止 新蒸无水拼 , 在 1 0 ℃ 下封 口反应 1 h0 。 冷却后 , 以 H多仇
为干燥剂真空干燥 , 至过量的无水饼全部抽净后 ,样品用 甲苯洗涤数次 , 减压抽干 。 加人饱和
N aH C O
: 和乙酸醉 ,进行乙酞化反应 (室温反应 Zh ) , 反应液通过 oD w e x 50 w ( H + 型 )离子交
换柱 , 以五倍柱床体积的双蒸水洗柱 , 合并流出液 ,减压蒸发至干 。 此样品用少量双蒸水溶
解 , 转移至 w ha ltn an 3号层析滤纸上 , 以正丁醇 : 乙醇 : 水 (刁 : 1 : l) 为展层剂 , 下行展层
2d
, 滤纸吹尽溶剂后 ,从点样处算起 , 剪下 0 . 0一 0 . sc m ,浸入双蒸水中 ,洗下寡糖链 ,冷冻干
燥 。
寡糖链用 N a3J H `还原 上述冻干的寡糖链样品 ,加人 2 0如L N aB H ; 溶液 ( 3 o m ol N -aB H `
溶于 2 0 0林L 0 . 0 5m o l / L N a o H 中 ) , 3 0o e 反应 一h , 再 加入 0 . 7 m g N aB H ` (溶解在 7 0件L 0 .
0 5m o l / L N a o H )连续反应 Zh , 以 l m o l / L H ^ e 中止反应 . 反应 混合液通过小体积的 D o w e x
50 w ( H
十 型 )离子交换柱 ,五倍体积的双蒸水洗涤 ,合并洗涤液 ,减压蒸发至干 , 再以甲醇洗
涤数次 ,减压至干 。 样品经上述步骤处理 , 即获得还原末端为 N 一乙酞氨基葡萄糖的 N 一连接
的寡糖链混合物 。
上述寡糖链混合物 ,用 B io 一 o e一P一 凝胶柱作进一步纯化 [ , `〕。 B io 一 e e 一P一 4 (月0 0 目以下 )溶
胀后装柱 ( 1 . S X I Oc0 m ) , 25 oC 下恒 温层析 , 双蒸水洗脱 , 分 部收集 ( 4一 6 滴 /而 n , 9一 n m in /
ut be
,
0
.
9
一
1
.
3 m L / ut be )
. 用 D u ib os 〔` 幻等的方法测定各收集管的糖含量 ,分别合并各糖峰 , 冷
冻干燥 ,得纯化的寡糖链 。
1
.
3 M D L 寡糖链的糖基组成测定 参照 R i e h e r t [ ` 6〕 , S w e l y [ , 7〕、 War d [ , 8〕等人的气相色谱法 。
用 G c 一 7 A G 型气相 色谱仪 ( 日本岛津公司 )和 c hor m at 0 aP C c 一 R 3 A 积分仪 ( 日本岛津公司 )
作数据采集处理 。 层析柱 为 : o v 一 1 01 + s E 一 3 0 , 3M 石英 毛细柱 ; 层析 条件 : N : 为载 气 ;
4 0 n t L / m in
,氢火焰检测器 ; T n (检测器温度 ) = T , (进样 口温 度 ) = 2 6 0 o C ; T c (柱温 )为程序升
温 :
坦些丫仃万石而 2。。℃ / ( 3、 。 )
样品的制备 ( l) 寡糖链的盐酸甲醇解系将纯化的 M D L 寡糖链样品 , 真空干燥 ( P 20 5 为
干 燥剂 )过夜 , 加入 e H 3 o H 一 H e L (含 0 . 7 5 m o 一/ L H e L ) 3 . s m L ,试管封 口 后 , 加热至 8 0 o e 反应
20 h
,冷却后 以干澡过夜的 固体 A g Zc o 3 中和 、 离心后取 出上清液 , 其沉淀用 Zm L 甲醇洗 、 离
心 (重复两次 ) , 合并清液和洗涤液 ,减压蒸发至干 , 以 P Zo s 和 N a o H 为 干燥剂进行真空 干
燥 。 向干燥样品中加入 甲醇 , 毗陡 、 和乙酸醉 ,进行重乙酞化反应 ( 20 ℃反应 l h ) ,用 N : 吹干 ,
再以 zP o s 为干燥剂真空干燥过夜 。
( 2) 糖 的三 甲基硅醚衍生物的制 备 甲醇解的样品 ,加入硅烷化试剂 (毗嘴 s m L 、 H M D S
ZmL
、
T 卜ICS l m L 混匀 ,放置 1 h2 , 离心 ,将上清液转移至另一干燥的带塞试管中 , 4℃干燥下
避光备用 l)[ 6〕 ,室温反应 h2 ,即可进行气相色谱分析 。
2 结果和讨论
2
.
1 M D L 寡糖链的分离纯化 应用 T ak as ik 等的脱解法 l[ “口从 M D L 分子 中可以释放 出与
第 1 期 曾仲奎等 : 岩豆凝集素寡糖链的研 究 1 1 5
户` n连接的寡糖链 , 经乙酸化反应 ,寡糖链的末端糖基被 乙酞化 , 可以应用 D o w ex 50 w ( H +
型 )离子交换柱对寡糖链进行初步纯化 ,经纸层析进一步去除小分子物质 ,此法虽然费时较
长 ,但其操作容易 , 不需 昂贵试剂 ,其效果好 , 因此是一种纯化寡糖链的有效方法 . Y am as hi at
等报道 iB -o G el P 一 4 凝胶过滤用于分离 3一 24 葡萄糖单位的寡糖链效果很好 l[ `〕 ,故本实验用
iB -o G el P
一
4 柱对 M O L 的寡糖链进行纯化 , 结果见图 1 。 图中有两个寡糖峰 , 以其出峰顺序分
别称为寡糖 I 和寡糖 I 。
了
8切
分部 管 数
1 2 0 16 0
图 1 M D L 寡糖链在 iB 。 一 G el P 一 4 柱上的洗脱
5一 6滴 /而 n 1 0~ / ut 比 l m L / ut 比
2
.
2 M D L 寡糖链糖基组成的测定
应用毛细管气相层析法对痕量的寡糖
进行测定是一种有效的测试手段 . 当寡糖
链盐酸甲醇解后 , 乙酞化恢复 乙酸氨基糖
的乙酞基 ,再制成单糖的硅烷化衍生物 ,即
可进行色谱分析 。 此法简便 ,结果准确 。
在糖基组成测定前 ,作者选用在糖蛋
白分子中常见的几 种单糖 : F ac 、 G al 、 M a n 、
o 一e N ^ C 、 o a 一N ^ c 和 x y l (木糖 ) , 以肌 醇作
内标 ,对 各种标准单糖及其混合样作出色
谱图 (图 2 ) 。 根据图中各峰的自动积分值 、
出峰时间 , 求出各单糖的相对保持时 I’-lJ , 见
表 1 , 与此同时 , 对各个标准单糖的层析谱
也进行了测定 ,从而确定图 2 中各峰是 由
哪种单糖所致 。
图 2 几种标准单糖的 甲基硅醚衍生物
的混合样在气相 气谱上 的 分离
1
.
uF
e ; l
.
X y l ; 3
.
M a n ; 4
.
G al ;
5
.
G al N A c ; 6
.
G l e N A e ; 7
.
nI 璐 i r ul .
1 16 四川大学学报 ( 自然科学版 )第 3 1卷
表 1各种单糖的三甲基硅醚衍生物的相对保持时间
Xy 1 M加 1 Ga lGa l NA e G le NA e G le NA七 O H
Rt0
.
3 71 0
.
2 4 90
.
5 270
.
3 8 90
.
7 9 90
.
80 5 9
.
0 91
表内数据系以皿醇作内标相比较得出
t R
:相对保持时间
从 M DL 纯化 出来的两个寡糖链样品 , 经甲醇解 、 乙酞化后 ,制成三 甲基硅醚衍生物 , 同
时以肌醇作内标 ,在相同条件下进行气相色谱分析的结果见图 3 和图 4 。 参照层析图谱和 自
动积分仪所得结果 ,通过校正 ,得到两个寡糖链的糖基组成 ,见表 2 。
图 3 寡糖链 I 的 三 甲硅醚衍 生物 的
毛细 管气相 色谱
1
.
uF e ; 3
.
h妞 n ; 6 . G le N A e ; 7 , I n os i t o l
图 4 寡糖链 l 的三 甲基硅醚衍 生物
的毛 细 管气相 色谱
1
.
F u e ; 3
. 卜了an ; 6 . G le N A e ; 7 . I n osj ro l
表 2 入幻〕 L 寡糖链的糖基组成
G Ic N A e G l e N A e O H
伪m P.粥 j一
it o n
C o n P0 s l一
t i o n
C o m lxj s i一
t i o n
肠 m OP is 一
t io n
P ae k 1 9
.
9 0 1
.
1 6 4
.
0 5
.
8 1 2
.
9 0
.
9 13
.
2 1
.
1
P ca k 1 1 2
.
4 1
.
0 5 4
.
2 3
.
9 1 6
.
6 1
.
0 1 6
. 只 1 . 0
0
.
3 7 0 0
.
5 2 7 0
.
8 9 5 0
.
92 0
tR
: 为相对保持时间
根据各种单糖 的分子量和表 2 中自动积分仪给出的各种单糖的相对百分含量 ,可 以计
算 出 M D L 分子中的两个寡糖链 部分的组成分别为 : 寡糖链 I : 〔M an 。 uF c l lG c N A cz 〕。 , 寡糖
链 l : [M a ll ; F u e , G l e N A e Z〕n . 参考 M D L 的分子量和糖含量 [` 2口,可以 确定 m 和 n 的值均为 1 ,
由此得 出 M D L 的两条寡糖链组成 分别 为 : M a n 。 F u e 、 o 一e N A e Z 和 随 n ` F u e l e l e N A c : 。 这 种寡
第 1 期 曾仲奎等 : 岩豆凝集素寡糖链的研究 1 17
糖链属 N一型糖昔键连接的高甘露型寡糖链 ,这是 s B A 等凝集素的主 要类型 ,链 内主要 含甘
露糖和 N 一乙酞氨基葡萄糖 。 在此高甘露糖型糖链 中 ,也可见到糖链核心结构上连有岩藻糖
或木糖 , 而 M D L 的寡糖链连接有岩藻糖 , 因此其糖链结构是 比较特殊的 。
在表 1和表 2 中所出现的 lG c N A c O H 是 N 一乙酞氨基葡萄糖醇 , 它是寡糖链的还原末端
G lc N A c 经 N aB H `还原所得 。 在气相 色谱中 , lG c N A c 与 lG c N A c o H 表现了一定差异 , 因而 出
现两个很接近的峰 ; 同时 , 由于 N aB H ; 仅对还原性末端的半缩醛经基发生还原反应 , 因此在
一条寡糖链上 , 只有一个 lG c N A c 糖基被还原成 lG c N A c O H 。 从图 3一」和表 2 中 , 可以看 出
lG c N A 。 和 Ol c N A c 0 H 的峰高和相对百分含量大体相 同 ,根据这些结果都表明 M D L 分子 内
的两条寡糖链的糖基组成 ,分别为 入I a n 。 F u e 、 G l e N A e : 和 M a n ; F u c 、 c l c N A e Z 。
在 寡糖链 的糖 基组 成 测 定 中 , 多 采 用气 相 色谱 s[, ` 3〕 , 也 有 采 用 高效 液 相 色 谱法 测
定 .s[ ` ’ , ’ 。口, 虽然这 些方法可以对糖基组成进行有效地测定 , 但对 于寡糖链的结构研 究 ,还不
适用 ,正因为糖类结构的复杂性 , 又加以方法学上的很多困难 ,致使糖类的研究比较缓慢 ,而
目前对于糖蛋白的研究 ,对糖链的结构测定都提出了许多新的要求 ,也是重组产生糖链结构
测定关卡之一 , 因此有待于工作的深入 。
参 考 文 献
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2 0 T
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CO入 I PO SI nO N AN AL Y SI SO FT H E
MIL L T ET I A DL E I SI AN A
O L I G《万 AC CH AR工 E DO SF
H AR 侧 1 5L T E C IN
肠峥 乙切刀妙面 刀油嵘油 nZ瓜测 刀咖夕
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o l o s y D ea P
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A加 r ta C tI n th es r tu e tur a l s u td i s o ef o li g o sa e e har i d es
r Po l b
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o o ba ti n t h e Pu r if id e
s u s ar e ha i ns
.
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us d ef o r r el eas i ns t h e A
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Par
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l i n kd esu s ar
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I n、 V e
i ng ly eo Pr o t eis n
, o n e o f t h e b i g g e s t
r e OP r t ed t h a t h y d r az i n o l y s is h a d b
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一 e x c h an s an d aP ep
r c h r o m a ot g ar P h y f o r
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N a B H ` t o o b at in 0 119 ` ` a e e h ar id es w i t h N
一 a e e t y l 一 an 飞i n o g l u e
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o o li g o sa e e h r id e s e o u ld b e s e Pa r a t ed
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o ly s ed an d f in a l ly tr a sn f o rm ed in t o d e r i v a ti v es o f tr im e t h y l s il a n e
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g as e h r o ma
to g r a Ph y o f th es e t w o d e r i
v a t i
v e s s h o w ed t h a t t h e se t w o o l ig O S a e e h a r id es w e r e
N巨 n 6 F u e l G le N A e Z an d M an ; F u e l G le N A e Z r e s ep e t i v e l y
·
K e y w o r ds e ar bo h y d r a te e
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o l i g o sa e e h ar i d
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