全 文 ：四川 大学学报 ( 自然科学版 )
J o
u n ra l oi f Seha u nU ni ve rsi ty Na tua rlSei n e e e Edi ti on V ol
`
28 No
。
1 1 91 9
荆豆U ( e Ixu e o rpa eu sL. )凝集素 I` 的研究
曾仲奎 刘荣华
(生 物 系 )
摘 要
用硫酸按分级沉淀 , 当饱和度达 4 0% 时 , 荆 豆 种子中的荆豆凝集素 I 就被
沉淀出来 , 再经处理 , 获得冻千的无盐制剂 . 当凝集素浓度为7 . 8仰 / m L 时 , 就
能凝集人 O 型血细胞 , 浓度分别为 1 2孙郎 m L 或 50 环g / m L 时 , 对人 B 或 A 型
血发生凝果反应 . 其凝集 0 型血的凝集作用可被 F cU 所抑制 · 上述制剂可 通过
C M一纤维素柱和 S eP 五ad ex c 一 2 c0 柱 2 次分子筛过滤而纯化 , 此纯化的凝集素
在 P A G E 中显示一条蛋白带 , 浓度为 t . 25 环g / m L 时可使 0 型 血 和牛精细胞发
生凝集反应 ; 浓度为4 0拼郭 m L 或 5 00拼叮 m L 时 , 可分别使 B 型和 A 型血发生凝
集反应 。
关键词 凝集素 , 0 型血专一疑集素 , 欧洲荆豆凝集素 , 糖蛋白 .
中图法分类号 5 8 5 2 . 4 5 , Q 9 4 9 . 7 3 .
豆科植物中的荆豆 ( lU xe e “ r oP ae su L . ) , 其种子中含有两种凝集素 . 一种的抑 制
糖是 L 一岩藻糖 ( L 一 F cu ) , 另一种 的抑制糖是甲壳素水解后的低聚糖 [` 一 4 ] . 前者称 荆 豆
凝集素 I ( U E H I 或 lU Xe )I , 它对人类 0 型血发生专一性凝集 , 后 者称荆豆凝集素 亚
(认 xe eu or aP eu s 幻 , 对人类 A B o 型血的凝集是非专一性的 . 两者的物化 性 质 和 生
物学性质各不相同卜 ` ] . 由于人类 0 型血无天然抗 0 血清 , 因而鉴别 O 型血时只 能使
用抗 H 血清 , U E H I 则 因其对 Q 型血的专一凝集 , 故在法医工作中广泛使用 , 除鉴 别
血型外 , ’ 还用于检测已知血型 的唾液 、 唾液斑 、 精斑 , 以及实验 研 究 . 现今 U E H I 是
国际上公认的一种鉴别 。 型血的标准凝集素 , 用以代替抗血清 , 在国外已广 泛 使 用 .
我们对四川省城 口荆豆中的凝集索 I 的性质行进了研究 .
1 材料和方法
荆豆 ( lU e x eu 1’o p ae su L . ) 种子得自四川省城 口 县 ; 正常人 A B O 型血得自中国 医
学科学院成都输血研究所 , 红细胞经 0 . 14 m ol / L N a CI 洗涤 3 次 , 用 相 同溶液 配 制 成
2%的血球悬液 , 冰箱放置备用 ; 牛精细胞得自成都市奶牛研究所 ; L 一岩藻糖 ( L 一 F cu )
得自 s e r v a , N 一 乙酞半乳糖胺 ( G a l N A e ) 、 N 一 乙酞葡 萄 糖 胺 ( G l e N A e ) 、 D 一半 乳 糖
( n
一
o a z ) 和 s e p h a d e x o 一 2 0 0购 自 S i g m a , e M一纤维素为上海试剂二厂 产 品 . 其余试
剂均为国产分析纯或化学纯 .
1
。
1 荆豆凝集素的浸取 称取荆豆种子 (约 1 0 0 9) 去 杂 后 磨 粉 , 用 5倍体积的
O
。
14 m ol / L N
a
CI 浸取 , 置冰箱间歇搅拌过夜 , 取出后用数层纱布过滤 , 滤渣重行浸取
本文于1 98 年 9月 5日收到
第 1期 曾仲奎等 :荆豆 ( U le x e r uoP e s a uL .)凝集素 I的研 究
一次 .合并所得滤液 , 在 4℃ 、 8。。。 r/ m in 离心 3 Om in , 得浸取液 .
1
·
2 荆豆凝集素 I 的分级沉淀 t3 ’ 向离心 的上清液中加入固体硫酸钱 ,使饱和度达一
40 %
, 加完后继续搅拌半小时 , 冰箱放置过夜 , 然后 4℃ 、 8 0 o o r/ m in 离心 3 0m in 得沉一
淀 。 将此沉淀用蒸馏水透析去硫酸铁离子 , 再对 0 . 1月m ol / L N a CI 透 析 , 离心 (条件同
前 ) 去沉淀 , 清液再行透析除盐 .
.1 3 U E H I 的无盐冻千粉末制剂 取上述制备的 u E H I , 用 oF il n 一酚法测定 蛋 ’
白质浓度 I’ J. 根据蛋白质浓度进行安瓶分装 , 使每支安瓶含 U E H 1 10 m g , 经冷冻千爆
后封管 , 得 U E H I 冻干无盐粉末制剂 .
1
.
4 凝集活性测定 [ 8 1 用 2 倍系列稀释法在血清微量稀释板上进行 . 精确称取 冻
千的无盐 u E H I 粉末 , 用生理盐溶液配制成 l m g / m L 的样品液 , 在 微量稀释板上对生
理盐水进行系列稀释 , 然后加入等体积的血球悬液 , 在微量振荡器上振摇 10 m i n , 室温
(2 5℃左右 ) 放置 Z h后 , 在显微镜下观察凝血.情况 .
1
.
5 糖抑制实验 I’ 〕 同凝血活性测定法 . 即在样品经系列稀释后 (每孔2郊 )L , 加
入经煮沸冷却的生理盐浪配制的 , 浓度为 s c m m ol / L 的 L 一 F uc , D 一 G lc 、 D 一 M “ n’ D 一 g al ,
G al N A c
,
lG
c N A c
, 木糖 、 麦芽糖 、 棉子糖 、 乳糖 、 纤维二糖和甲壳素水解后的低聚糖
(浓度为 3% ) 各 2印 L , 振摇 ZOm in 后 , 于每孔内加入血球悬液 2尔 L , 再次振摇 10 m in ,
室温 ( 2 5℃左右 ) 放置 Z h 后显微镜下检查抑制结果 .
1
·
6 U E H I 的纯化 (1 ) C M 一纤维素柱层析 . 基本按 H or ej is 等的方法进 行 2[] ,
将冻干的 U E H I 用 p H 3 . 8 , s m m ol / L 的柠檬酸缓冲液溶解和平衡透析 , 施 于用相同
缓冲液平衡的 C M一纤维素柱 , 再用同一缓冲浪洗柱 , 至流出液在 2 8 0n m 处吸收值小于
。 . 02 时 , 改用 p H 3 . 8 , 弓m m ol / L 的柠檬酸缓冲液和 p H 6 . 8 , 0 . 2m ol / L磷酸缓冲液进行
连续离子梯度洗脱 , 分部收集 , 经 721 型分光光度计测定并检查凝血活性 , 收集 有 凝血
活性的部分 , 除盐冷冻干燥 . (2 ) 凝胶过滤 . 冷冻干燥样品 在 S eP h a de x G 一 20 0 柱 上进
行凝胶过滤 , 用 p H 6 . 8 , 0 . 2 m ol / L 的磷酸盐缓冲液平衡并洗脱 , 分部收集和测定后 ,
收集有凝血活性的部分 , 再次进行凝胶过滤 , 最后获得有凝血活性的样品 , 除盐并冷冻
干燥 。
1
. 了 电泳纯度检查 按 p e a e o k 等的 方 法 [“ I用 ; H 8 . 9 , T r i S一 E D T A N a : 一 b o r a t e 电
泳缓冲液 , 凝胶浓度为 7 . 5% , 电泳完毕后凝胶用 10 %三氯醋酸固定 , 考马斯亮兰 R 一 2 5 0
染色 , 7%乙酸脱色保存 .
1
.
8 纯化的 U E H I 对血细胞和牛精细胞的凝集作用 在微量稀释板上 对 纯 化 的
u E H I 进行系列稀释后 , 分别加入 0 、 A 、 B 型血细胞和牛精细胞 (精 细胞经镜检游动活
力并用 D 一H a n k, s 液稀释成适当浓度 ) 2琳 L , 振摇 , 肠℃保温 Z h后 , 在显微镜下观察凝
集结果 。
2 结果和讨论
1) 荆豆种子经磨粉 、 氏 州 m d / L N “ C l 浸取 , 再用硫酸铁分级沉淀 , 在 硫 酸 馁
饱和度为 40 % 时 , 荆豆凝集索被沉征出来 , 经 i麦析除盐后 , 可制少戈无盐冻干粉末 , 此制
剂对 O 、 B 、 A 型血的凝集作用结果见表 1 .
土面 四川大学学报 ( 自然科学版 ) 第2 8卷
表 1 无盐冻午的 U E H I 的凝集活性
细胞类型
0 型
B 型
A 型
U E H I 的最低浓度
7
.
8拜g / m L
12 5拌g / m L
5 0 0林g / m L
血H 丈浓度为 7 . 8绍 /m L 时 , 对 o 型细胞 的凝集反应 , 肉眼都能观察出来 , 但在 此 浓
度下 , 色和 A 型血则完全不发生凝集反应 , 只有当 U E H I 的浓 度 高 达 1 2尔 9 2” L 或
5 0 拼盯m L 时 , B 型和 A 型血才分别发生凝集反应 . 因此在低浓度下 U E H I 就能特异
地凝集o 型血的特性 , 用来鉴别 0 型血比之于用抗 H 血清鉴别 0 型血更为灵敏更为准
确 。 因此公安法医 、 血库和实验研究单位广为采用 。
`
2) 在众多的糖类实验中 , 仅有 L 一 F cu 能抑制 u E H I 对 0 型血的凝集作用 , 而其
它搪类则完全不发生抑制作用 . L 一 F uc 之所 以发生抑制作用 , 是由子 0 型血的血 型 物
质的搪链末端搪残基是 L 一 F uc . 当向反应系统中加入岩藻糖后 , 就使 L 一 F uc 与 U E H I
的结合位点结合 , 因而导致 U E H I 不能与血型物质结合 , 结 果 0 型细胞处子分散状态 ,
而不皇现凝集反应 .
3) u E H I
一经 c M 一纤维素柱 , 并用连续离子梯度洗脱法 , 其层 析结果见 图 1 .
经 C M 一纤维素柱层析后 的 U E H I , 再用 eS p ha de r G 一 2 0 两次重复过 滤 , 其结果
见图 : 2和 3 · 将有凝血活性的部分合并 , 透析除盐 冷冻干燥 , 得纯 化 的 U E H I 样品 .
’
4) 纯化的 u E H I 聚丙烯酞胺凝胶电泳结果见图 4 , 从图中可见 , 当冻干的 无 盆
备J笼l尸selwee
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t U 孟J 4 0 o Q 邑0 1 0 0
图 i U F H I 的层析
准 , C M一纤维素 , 2 、 4 0c m
溶液 : p H 3 。 8 , s m m o l / L C i t r a t e b u f f e r
和 P H 6 . 8 , 0 . 2m o l / L Ph o s Ph a t e b u f f e r
进行连续离子梯度洗脱 , 20 m L h/ , 4 m L /
每管 .
阴影部分为有活性的部分 .
图 2 经 C M 一纤 维素柱层 析后 的U E H I 的
se p h
“ d ex G
一 2比 第一次遗滤
柱 : S e p h a d e x G一 200 , 1 . 2 x 110 e m ,
溶液 : p H 6 . 8 , 0 。 Z m o l / L p h o s p h a t e b u f f e r (含
0
.
1 4 m o l / L N a C I )
,
1 5m L / h
,
4 m L /每管 。
U E H I 粉来经 C M 一纤维素柱层析后 , 样品纯度较差 , 电泳中至少有两个蛋 白 带 . 此样
品经两次凝胶过滤后 , 就可获得纯度较高的 U E H I 样品 .
5 ) 纯化的 U E H I 的凝集活性的测定 结果见表 2 ,
第 1期 曾仲奎等: 并,l豆 ( U l e x e u r o p a e u s 1 . ) 凝集素 I 的研 完 1 0 1
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图3 U E H I 的第二次凝胶 过滤
柱 : S e p h a d o x (丁一 三。() , 1。 2 又 1 1 0 e m ,
馆液和条什同第 一 二之’ 创吮过滤 .
图 4 U E H I 的聚丙 烯配胺凝胶 电泳
缓冲液 : pH S 。 9 , T r i s 一 E D T A N a Z一 b o r a t e bu f e r -
凝胶浓度 : 7 . 5% , 3二 A /每管 , 电泳 2小时 , J 电泳后
经 10 %三氯醋酸固定 , 用 7%醋酸退色保存 .
a 为 u E H I 冻干无盐粉末 , b 为 C M一纤维素层析后
样品 , c 为第一次凝胶过滤后的样品 , d 为第二次 过
滤的样品 。
表 2 纯化 U E H I 的凝集活性
细胞类型
O 型细胞
B 型细胞
A 型细胞
牛精细胞
凝集素最低浓度
1
.
2 5拼g / m L
4 0井g / m L
5 0 0拜g / m L
1
.
2 5件g / m L
纯化的 u E H I 对 0 、 B 、 A 型血.细胞的凝集作用的测定结果与已有的报道 相 符 3[] , 表
明我们纯化的 U E H I 生物活性是完好的 , 并未因纯化过程而失活 , 纯化的 U E H I 对牛
精细胞也表现较强的凝集活性 , 这表明牛精细胞膜表面有较丰富的 U E H I 受体存在 。
已有的报道表明 , 在凝集素的研究中对 o 型血专一的凝集素 , 为数不多 〔` “ ] . 而已经
分离纯化的仅欧洲荆豆 ( U l e X e u f o p a e u s L . ) 、 百 脉 根 ( L o t u s T e t r a g o n o b u s ) 、 e y t i s u s
s se is h fo h su 〔“ 1等少数几种 , 在世界范围内 , 目前应用得最为广泛的是欧洲荆豆 , 但荆豆
的产地仅限于少数几个地 区 , 我国仅四川省城 口县稀有分布 . 经研究 四川产的荆豆与欧
洲荆豆 已有很大差异 , 可能属于 中国荆豆 ( U掩 x C hi ne s e ) . 因此对我国的荆豆进行分子
生物学研究 , 不仅在理论上而且在实践上也有重要意义 .
参 考 文 献
M
a t s u m o t o 1
. a n d o s a w a T
. ,
A r e九. B io e人e舰 . B i o P瓦y s . 1 97 ) , 14 0 * 4 8 4 .
H o r ej s i V
. ,
B i o e h i沂n . 刀了o P h夕5 . A c t a . 1 9 7 9 , 5 7 7 : 3 8 9 .
H o r e js i V
.
a n d K o e o u r e k J
. ,
B i o e九i肌 . B ￡o 刀12 , 5 . A e t a . 1 9 7 4 , 336 : 32 9 .
M
a t s u r n o t o 1
. a n d 0 5 a w a
,
T
. ,
B io c h i肌 . B io P几夕5 . A C t a , 1 96 9 , 1 9 4 t 1 80 .
曾仲奎 、 吴洽庆 、 曾光耀 , 四川大学学报 (自然科学版 ) 1 9 9 0 . 27 : 33 .6
陈秀兰 、 尹海林 , 用 v B L 和u Icx l 研究精卵细胞结合位点的性质 , 待发表 .
L o 万 r y o 。 H . e t a l . , J . B 公o l . C瓦e了n . 1 95 1 , 1 9 3 : 26 5 .
曾仲奎 、 邓俊休等 , 生物化学杂志 , 19 85 , 1 : 73 .
,J ., .JJ1J卫1ō舀,上山,J415了h门8
r.J. Lr苦Lr.
在 02 四 川大学学报 (自然科学版 ) 第2 8券
. . . . . . . . 口. . . . . . 口
1 6 95
,
14 7 : 14 5 1
.
L公c 艺玄n s一B i o Zg夕, B io e几e m 了s t r夕一 C不f玲玄e a不 B 玄o e九e机云S t r夕-
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. ,
1 98 2
,
2 * 113
。 -
M a t s u m o t
o , 1
. 而d o s a w a T . , B i o e 九e m i , 才r夕 , 1 9 74 , 1 3 : 5 8 2 。
S T U DY O N T H E L E C T I N F R O NI U L E X E U R O P A EU S L
.
e 儿 9 Z h o 儿g无友 1 L i u R o , 29人u a
( D e r a r t m e n t o f B i o l o g y )
A B S T R A C T、 、 ` 、 ’ 汀 : ` ,仁
厂 一珑H 丈礴口` 此 t a 呈n e d by ( N H 4 ) :匀 4 f r a e t i o n a t i o n o f u 一e x e u r o p a e u s s e e d s a t t h e ` 州旧欢` 扣n
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` · T h 。 : 之卜 f咖 p r 6 d u e t w a s g o t a f t e r xy o p h i l s z a t i o n . u EH 1 e a n _ a g g l u t i n a t e h u m a n o应示阮面 y t e压。 t 。 : o n e e 。 二t io n o r 7 . 5 拌g / 。 L a 。 d 。 。。 l u t s n a t e B 。 : A e r y t h ; o e y t e : a : 。 o n c e。滋*拓抽 讨 22 5 ; 。 / m L a 耐 , o 拜g /m L r e s p ce t i v e zy . Th e 。 g: l u t s n a t i o n o f h u m a n 0 er y t h or e y ,
t e s e o u l d b e i n h i b i t e d b y L
一
F u e o s e
。
T h e U E H 1 w a s P u r i f i e d b y e h r o m a t o g r a Ph y s uc e e s s i v e l y
o n C M
一
C e l l u l o s e a n d S e Ph a d e x G
一
2 0 0 t w i e e
。
T h e P u r i f i e d l e e t i n e x h i b i t e d a s i n g l e b a n d o n
p弃G月 a孕d c a n s p e c i f i c a l l y a g g l u , i” a , e h u m a n 0 e r y t h or c y t e s a n d b o v 主n e s p er m C e JJs , , 。
e o n c e n t r a t i o n o f 1
.
2 5 拜 g / m L w h i l e B a n d A c r y t h r o e y t e s a t 4 0私 g /田工 a 互d 50即 g / m L r es P e e t ly 七】y .
K e y W o r d s L e e t i n
,
G l y e o p: o Le i n
,
B ]o o d g r o u p 0 s P e e i f i e 王e e t i n , U lex e u r o P a e u s l ec t i n -
州尽