全 文 ：中国药物应用与监测 2008年第 5卷第 1期
论 著
藤茶双氢杨梅树皮素对人肝癌BEL-7404细胞增殖的抑制作用
郑作文 1,唐云丽 2,张玉萌2(1广西中医学院,南宁,530001;2广西中医学院在读硕士研究生,南宁,530001)
摘要 目的:探讨藤茶双氢杨梅树皮素(APS)的抗肿瘤作用。方法:以 MTT法、生长曲线法、克隆形成法观察 APS对人肝癌
BEL-7404细胞的体外抑制作用。结果:MTT法中,APS对BEL-7404细胞的IC50为22.99μg/mL;细胞生长曲线法提示其对 BEL-
7404细胞生长有明显抑制作用;克隆形成法中,药物浓度在 9.88μg/mL以上时抑制率为 100%,药物浓度为 6.58μg/mL时抑制
率为 69.65%。结论:APS对 BEL-7404细胞的增殖有明显的抑制作用。
关键词 藤茶双氢杨梅树皮素;抗肿瘤;人肝癌 BEL-7404细胞
中图分类号:R966 文献标识码:A 文章编号:1672-8157(2008)01-0004-03
Inhibition effect of ampelopsin on proliferation of BEL-7404 human liver cancer cell
ZHENGZuo-wen1, TANGYun-li2, ZHANGYu-meng2(1 Guangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning, 530001; 2 Graduate
Student ofGuangxi Traditional Chinese Medical University, Nanning, 530001)
ABSTRACT Objective:Toinvestigate the anti-tumor effect ofampelopsin in vitro.Methods:Th gr wth inhibition was analyzed
by MTT, cell colony and cell growth curve measurement in the liver carcinoma BEL-7404.Re ults:The ampelopsin could obvi usly
inhibit the growth ofcultured BEL-7404 cells, the IC50in MTTassay is 22.99μg/mL; Ampelopsin could obviouly affect on the tumor
cells’growth; The repressive ratio in cell colony assay is 100% when medicine density is over 9.88μg/mL, the repressiv rat o in cell
colonyassayis 69.65% when medicine densityis 6.58μg/ L.Con lusion:Ampelopsin can inhibit the growth ofBEL-7404 in vitro.
KEY WORDSAmpelopsin;Anti-tumor;BEL-7404 human liver cancer cell
APS(3,5,7,3,4,5-六羟基-2 3-双氢黄酮醇)又名
蛇葡萄素[1,2],广泛存在于葡萄科植物中,尤其是在显齿
蛇葡萄的茎、叶中含量较高。显齿蛇葡萄也称藤茶[3],主
要分布于广西、云南、广东、贵州、湖南、湖北、江西、福
建等省,为瑶族民间常用的草药之一。其性凉,味甘、
淡,具有清热解毒、消肿止痛、祛风湿、强筋骨等功效,
主治黄疸型肝炎、感冒风热、咽喉肿痛、急性结膜炎
等[7]。近年研究表明其体外对人胃癌细胞SGC-7901、
白血病细胞 HL-60、K562、肝癌细胞 BEL-7402、人鼻
咽癌HK-1细胞、人乳腺癌MCF-7细胞的增殖及体内
对小鼠移植性 B16黑色素瘤的生长均有显著的抑制
作用[5-7]。本文研究APS对人肝癌BEL-7404细胞增殖
的抑制作用,现报告如下。
1材料
1.1药物
APS由本院中药化学教研室从藤茶提取分离而
得,为粉状白色结晶,纯度为98.5%。
1.2细胞
人肝癌细胞BEL-7404,由广西中医学院分子生物
学实验中心惠赠。
1.3试剂
RPMI-1640干粉(美国 Gibco公司) ;新生牛血清
(杭州四季青公司,批号031101) ;四甲基二氮唑蓝(北
京拜尔迪生物公司分装,Amresco 0793) ;二甲基亚砜
(博大泰克公司);0.25%胰蛋白酶(美国Hyclone Lab公
司);注射用生理盐水(徐州莱恩药业公司,批号0511-
22);顺铂(齐鲁制药有限公司,批号701003CF)。
1.4仪器
SUNRISE自动酶标仪(奥地利 TECAN公司) ;
二氧化碳培养箱(美国ThermoForma公司);DLF560型
[基金项目] 广西科学基金资助项目(桂科基0639052)
[作者简介] 郑作文,男,教授,硕士生导师,研究方向:中药药理。
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中国药物应用与监测 2008年第 5卷第 1期
超净工作台(荷兰clearAirTechniekbv公司);细胞培
养瓶(加拿大 BIOFIL公司);96孔板(上海 Sunub科技
发展公司);倒置显微镜(德国 Leica);微量移液器(法
国Pipetman公司);电子天平(德国赛多利斯)。
2方法
2.1BEL-7404细胞培养
细胞用含 10%新生牛血清的 1640培养液培养。
取对数生长期细胞,用 0.25%胰酶消化,1∶3传代,置
37℃、5%CO2培养箱中培养,3d~5d长满。
2.2MTT法测定[8,9]
取对数生长期的细胞消化,用含 10%血清的培养
液调配成1×104个/mL细胞悬液,接种于96孔培养板,
每孔180μL。设6个药物浓度组(用含血清培养液稀释)
和细胞对照组,每组3个复孔。药物组每孔加APS20μL
(终浓度为 75、50、33.33、22.22、14.81、9.88μg/mL),细胞
对照组加培养液 20μL。培养 48h后,加 5mg/mLMTT
(生理盐水配制)10μL/孔;继续培养4h,弃上清,加不含
血清的1640培养液 150μL/孔,洗板。弃上清,加二甲
基亚砜150μL,振荡。在550nm波长处用酶标仪测OD
值,计算抑制率,用对数回归方程求出半数抑制浓度
(IC50)。肿瘤细胞生长抑制率=(1-实验组平均 OD值/
对照组平均OD值)×100%。
2.3生长曲线法测定[8,9]
取对数生长期的细胞消化,用含 10%血清的培养
液调配成 1×104个/mL细胞悬液,接种于 96孔培养
板,每孔180μL。设6个药物浓度组(用含血清培养液
稀释)和细胞对照组,每组 4个复孔。药物组每孔加
APS20μL(终浓度分别为50.00、33.33、22.22、14.81、9.88、
6.58μg/mL),细胞对照组加培养液20μL。置 37℃、5%
CO2培养箱中培养,分别于用药后0、24、48、72、96h用
台盼蓝拒染法进行活细胞计数。以每毫升活细胞数为
纵坐标,时间为横坐标绘制细胞生长曲线图。
2.4克隆形成法[8,9]
取对数生长期的细胞,用0.25%胰酶溶液消化,进
行活细胞计数,用含10%血清的培养液稀释成100个/
mL细胞,接种于24孔板,每孔1mL。设4个药物浓度
组(用含血清培养液稀释)和细胞对照组,每组设 3个
复孔。药物组每孔加APS1mL(终浓度为22.22、14.81、
9.88、6.58μg/mL),细胞对照组加培养液 1mL,做十字
摇动,混匀后将24孔板移入CO2箱,在37℃、5%CO2培
养箱中静止培养8d。8d后弃培养液,用姬姆萨应用液
染色,镜下计数大于50个细胞的克隆数。
抑制率(%)=(1-实验组克隆数/对照组克隆数)×
100%。
3结果
3.1MTT法
结果如表1所示,当APS浓度为75.00、50.00、33.33、
22.22、14.81μg/mL时,抑瘤率与细胞对照组相比差异有
显著性,IC50为22.99μg/mL,提示APS对BEL-7404细
胞的增殖有明显的抑制作用。
3.2生长曲线法
采用生长曲线法观察不同浓度APS对BEL-7404
细胞增殖的影响,结果如图 1所示,APS对 BEL-7404
细胞的增殖有明显的抑制作用,且随药物浓度增加,其
抑制作用增强。
注: 空白组; 药物组 6.58!g/mg; 药物组 9.88!g/mg; 药物组 14.81!g/mg;
药物组 22.22!g/mg; 药物组 33.33!g/mg; 药物组 50.00!g/mg。
图1双氢杨梅树皮素对BEL-7404的抑制作用
3.3克隆形成法
论 著
表2 APS对BEL-7404细胞增殖的抑制作用(x±s,n=3)
组别 药物浓度(μg/mL) 细胞个数 抑制率(%)
细胞对照组 - 33.37±7.51 -
APS组 22.22 0** 100.00
14.81 0** 100.00
9.88 0** 100.00
6.58 11.33±2.89** 69.65
表1 APS对BEL-7404细胞增殖的抑制作用(x±s,n=3)
注:*表示与细胞对照组比较P<0.05,**表示与细胞对照组比较 P<
0.01,下同。
组别 药物浓度(!g/mL) OD值 抑制率(%)IC50 r对
细胞对照组 - 1.779±0.083 -
顺铂阳性组 3.00 0.940±0.022** 47.16
APS组 75.00 0.172±0.008** 90.33
50.00 0.204±0.014** 88.53
33.33 0.350±0.062** 80.33 22.9993.6
22.22 1.046±0.050** 41.20
14.81 1.527±0.049* 14.17
9.88 1.706±0.072 4.10
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中国药物应用与监测 2008年第 5卷第 1期
ADR病例
1临床资料
患者,女,33岁,因不慎摔伤,造成腕、踝部挫伤,
口服云南白药胶囊0.5g,数分钟自觉身体松软,咽喉部
感觉发痒,胸闷不适,随后胸闷慢慢加重,呼吸困难、
心慌气短、大汗、头晕、四肢软弱无力。立即送到我院
抢救。血压10.7/18.0kPa,脉搏120次/min。呼吸23次/
min,体温36℃,重症病容表情淡漠,神志模糊,呼吸短
促,额部冷汗,口唇及指端发绀,四肢末端发凉,双肺可
闻及哮鸣音,心音正常,律齐,心率120次/min,未闻杂
音,余正常:诊断为过敏性休克。治疗氧气吸入,肌肉
注射异丙嗪25mg,静脉推注50%葡萄糖20mL+地塞米
(下转第31页)
云南白药胶囊口服引起过敏休克1例
韩东晓(山东省济宁市任城区中医院,济宁,272000)
关键词 云南白药胶囊;口服;过敏反应
中图分类号:R966 文献标识码:B 文章编号:1672-8157(2008)01-0006-02
论 著
当APS浓度为9.88μg/mL以上时,抑制率为100%,
当 APS浓度为 6.58μg/mL时,抑制率为 69.65%,与细
胞对照组比较均有明显差异(P<0.01) ,提示其对BEL-
7404细胞的增殖有明显的抑制作用。
4讨论
20世纪80年代以来,恶性肿瘤发病率以年均3%
到 5%的速度递增,WHO报告 1997年癌症死亡数约
620万,居传染病和心血管之后列入人类死亡第三位。
在我国,随着人口的老龄化,城市人口的比例逐年增
高,城镇工业生产迅速发展,环境污染日益严重及吸烟
等不良生活习惯导致肿瘤的发病率和死亡率都有增
加[10]。广西居民恶性肿瘤死亡率也呈上升趋势,恶性
肿瘤死亡率由过去的 37.33/10万已上升到目前的
80.02/10万,上升幅度高达 109.01%[11],其中肝癌死亡
率高居第三位[12]。目前的治疗手段毒副作用大,患者的
生存质量差,而天然中草药具有毒性低而来源广泛、提
取率高的优点,因此研究中草药的抗癌作用十分必要。
MTT法是运用 MTT显色剂被活细胞线粒体中的
琥珀酸脱氢酶还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臢,而
间接反映出活细胞数量,该方法有灵敏度高、重复性
好、操作简便、经济等特点;生长曲线法以细胞数的对
数与培养时间作图可得一条生长曲线,加药后药物对
细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来,可较直观
看到药物的作用效果;克隆形成法反映单个细胞的增
殖潜力,能较灵敏的测定抗癌药的活性。本文采用
MTT法、细胞生长曲线法、克隆形成法观察了 APS对
人肝癌BEL-7404细胞增殖的抑制作用。以上三种方
法结果均显示,APS对人肝癌 BEL-7404细胞的增殖
有明显抑制作用,但其体内抑瘤作用及抗肿瘤的机制
有待进一步研究。
参考文献
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(收稿日期:2007-01-09)
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