全 文 ：ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.22No.102006October
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基金项目:河北省自然科学基金项目“外源CBF基因导入对苹果抗寒性的影响”(C2005000192)；“苹果主栽品种几丁质酶和β-1,3葡聚糖酶基因转化”
(C2006000451)；河北农业大学博士、回国人员科研资助项目。
第一作者简介:张丽丽，女，1980年出生，在读硕士研究生，主要从事果树基因转化研究。Tel：0312-7528322，E-mail:biotech@hebau.edu.cn。
通讯作者:师校欣，女，1966年出生，教授，主要从事果树生物技术研究。通信地址：071001河北保定市河北农业大学园艺学院。Tel：0312-7521817，E-mail:
shixx@hebau.edu.cn。
收稿日期:2006-07-14，修回日期：2006-07-18。
苹果叶盘法基因转化中抗生素种类和浓度的筛选
张丽丽,师校欣,杜国强,冯莎莎,张俊阁
（河北农业大学园艺学院，河北保定071001）
摘 要:以苹果品种嘠拉试管苗为试材,研究了卡那霉素(Km)、潮霉素(Hm)对继代苗生长和离体叶片再
生的影响,以确定叶盘法基因转化的选择压和转化体的筛选浓度;同时研究了不同浓度的头孢霉素
(Cef)和羧苄青霉素(Carb)对苹果离体叶片再生的影响及对农杆菌 EHA105和 LBA4404的抑菌效果;
以确定侵菌共培养后合适的抑菌抗生素种类和浓度。结果表明:Km10mg/L、Hm4.0mg/L完全抑制了叶
片不定芽的分化,可作为苹果叶盘法转化时抗性芽的选择压;Km50mg/L、Hm5.0mg/L达到继代苗的半
致死浓度,可作为转化后抗性苗的筛选浓度;由于抗性芽再生的选择压与抗性苗筛选浓度相差较小,Hm
相对于Km更适合作为苹果基因转化的选择标记;培养基中附加Cef300mg/L能完全抑制农杆菌生长,
对叶片不定芽的再生影响不大;而附加Carb则需400mg/L以上才能抑制农杆菌生长,同时严重抑制了
叶片再生。因此,宜选用Cef作为苹果基因转化的抑菌抗生素。
关键词:苹果;基因转化;农杆菌;抗生素
中图分类号:S661 文献标识码:A
TheSelectionofAntibioticsandTheirConcentrationduringGeneTransformationvia
LeafDiscRegenerationSysteminApple
ZhangLili,ShiXiaoxin,DuGuoqiang,FengShasha,ZhangJunge
(ColegeofHorticulture,AgriculturalUniversityofHebei,Baoding,Hebei071001)
Abstract:ItwasstudiedthattheefectofKanamycinandHygromycinonthegrowthofsubculturedex-
plantsandtheeficiencyofadventitiousbudregenerationfromleafdisc,andtheefectoftheconcentration
ofCefotaximeandCarbenicilinontheeficiencyofregenerationandthepreventinggrowthofAgrobacteriua
strainsEHA105andLBA4404.TheresultsshowedthatthesupplyingofKanamycin10mg/LorHy-
gromycin4.0mg/Linthemediacouldrestricttheadventitiousbudregenerationinagreatestextent,andit
couldbeusedasaselectingpressurefortheregenerationofadventitiousbudswithantibiotic-resistant.The
supplyingofKanamycin50mg/LorHygromycin5.0mg/Linthemediacouldledhalfofthesubculture
plantletstodeath,anditcouldbeusedfortheselectionoftransgenicplantletswithantibiotic-resistant.
TheHygromycinisconsideredtobemoreusefulthanKanamycinasaselectingmarkerduringgenetrans-
formationinapple,sincethediferenceoftheconcentrationsofHygromycinusedfortheadventitiousbud
regenerationandtheplantletsselectionislessthanthatofKanamycin.ThesupplyingofCefotaxime300
mg/LcouldeliminatedthegrowthofAgrobacteriaeventualywithoutafectingtheadventitiousbudregenera-
tionfromleave.ButthesupplyingofCarbenicilinshouldbemorethan400mg/Ltoobtainthewelcon-
troling,andthatseriouslylimitedtheadventitiousbudregeneration.Then,itsuggeststhatCefotaxime
shouldbeusedfortheeliminatingofAgrobacteriastrainsEHA105andLBA4404.
Keywords:Apple,Genetransformation,Agrobacterium,Antibiotics
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基因工程技术在果树品种改良中显示了巨大的潜
力，农杆菌介导法以其简便、高效的特点成为应用最广
泛的基因转化方法。在农杆菌介导的叶园片基因转化
法中，选择培养基中须加入两类抗生素，抑菌抗生素用
于叶片与农杆菌共培养后杀死或抑制农杆菌生长，头
孢霉素（Cefotaxime，Cef）、羧苄青霉素（Carbenicilin，
Carb）等被广泛用于转化研究；选择抗生素用以抑制非
转化植物细胞生长，在培养基中产生一种选择压力，把
转化体选择出来。常用的选择标记基因有新霉素磷酸
转移酶基因（NptⅡ）和潮霉素磷酸转移酶基因（HPT），
可使转化细胞具有卡那霉素(Kanamycin，Km)或潮霉
素（Hygromycin，Hm）抗性，淘汰非转化细胞或植株[1]。
选择适宜浓度的抗生素对获得转化体和抑制农杆
菌是至关重要的。虽然已有关于Km、Hm、Cef等抗生
素对植物（苹果、梨、杨树、菊花、大白菜、悬铃木等）离
体再生影响的研究报道[2~7]，但不同种类、品种的植物
对不同抗生素的敏感性不同，筛选浓度就不一样；不同
的农杆菌菌株类型侵染能力不同，抗生素的抑制效果
也不同。转化前，必须检测出该种植物对某种抗生素的
敏感性浓度，确定合适的选择压力和抑菌抗生素种类、
浓度。为此，研究分别进行苹果继代苗和离体叶片再生
对Km和Hm的敏感性试验，以确定选择压和转化体
的筛选浓度；同时研究不同浓度的Cef和Carb对离体
叶片再生的影响以及对不同农杆菌菌株的抑菌效果，
以确定合适的抑菌抗生素种类和浓度，为建立苹果叶
盘法基因转化系统提供依据。
1材料和方法
1.1试材
选用苹果品种嘎拉试管苗，试验于2005年3月—
2006年4月在河北农业大学园艺学院生物技术实验
室进行；农杆菌菌株 EHA105、LBA4404由美国
OregonStateUniversityDr.TonyChen提供。
1.2方法
1.2.1Km和 Hm对继代苗生长的影响 在MS+BA1.
0mg/L+NAA0.05mg/L+白砂糖 35g/L+琼脂 6.0g/L
培养基中，分别附加0、10、30、50、80和 100mg/L的
Km；或0、3、5、10、15、20和30mg/L的Hm接种嘎拉
继代苗，每瓶6株丛苗，重复5次。培养温度 (25±
2)℃，每天光照14h，光照强度2000lx。
1.2.2Km和Hm对叶片离体再生的影响 切取30d苗
龄的继代苗上部较嫩的叶片，沿主脉横切2刀，但不切
断，远轴面向下接种在 MS+BA5.0mg/L+NAA
0.2mg/L+白砂糖 35g/L+琼脂 6.0g/L叶片再生培养
基中，培养基附加 0、5、8、10、15、20和 30mg/L的
Km；或附加0、1、1.5、2、2.5、3.0和4.0mg/L的Hm，每
瓶8~9片叶子，重复5次。先暗培养20d，然后光培养，
培养条件同上。
1.2.3抑菌抗生素的抑菌效果及对叶片离体再生的影
响 挑取农杆菌 LBA4404和 EHA105单菌落，接入
YEP营养液中，28℃、170~180rpm悬浮24h。
将切好的试管苗叶片置于OD≈0.8新鲜菌液中，
侵染10min左右，用无菌滤纸吸干附着的菌液，接种
在叶片再生培养基中。共培养2d，待叶片底部和周围
出现微小农杆菌菌落时，转入含有抑菌抗生素Cef：0、
100、200、300、400、500和 600mg/L；或 Carb：0、100、
200、300、400、500和600mg/L的培养基中。培养条件
同上。
1.2.4结果调查与统计 接种后对继代苗生长、叶片再
生情况、菌落生长情况进行观察记录。50d时，对下列
指标进行调查，并对结果利用DPS软件进行统计分
析，再生率统计时先进行反正弦转化，显著水平0.05。
不定芽再生率（%）=出芽叶片数
接种数
×100%
平均不定芽数=不定芽数
接种数
继代出苗数=出苗总数
接种数
继代成苗数=有效苗数
接种数
(有效苗的标准：长度>
1.5cm的新梢)
继代苗白化率（%）=白化苗
接种数
×100%
继代苗褐化率（%）=褐化苗
接种数
×100%
再生叶片白化率（%）=白化叶片
接种叶片数
×100%
再生叶片褐化率（%）=褐化叶片 接种叶片数×
100%
2结果与分析
表1卡那霉素对继代苗生长及白化的影响
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在含有不同浓度的Hm培养基上接种嘎拉苹果离
体叶片，结果表明离体叶片对Hm的耐受力相对继代
苗要高。Hm的浓度为1.5~3mg/L时离体叶片不定芽
再生率和出芽数明显降低，但仍有不定芽的分化，直至
Hm4.0mg/L时叶片不再分化不定芽且完全褐化。因此
4.0mg/LHm可作为苹果叶盘法转化时抗性芽的选择
压(表4)。
2.5羧苄青霉素对叶片离体再生的影响及抑菌的效果
2.1卡那霉素对继代苗生长的影响
在含有不同浓度的Km培养基中接种嘎拉苹果继
代苗，结果如表1所示：附加Km10~30mg/L对苹果继
代苗芽分化和成苗没有明显影响，到50mg/L时差异
明显。Km10mg/L时继代苗即出现白化现象，随着
Km浓度的增加，幼苗逐渐停止生长，叶片白化逐渐加
重直至死亡，Km50mg/L时继代苗的白化率已达
94.4%，可以作为基因转化后苹果抗性苗的筛选浓度。
2.2潮霉素对继代苗生长的影响
在含有不同浓度的Hm培养基上接种嘎拉苹果继
代苗，结果发现苹果继代苗对Hm非常敏感，在含Hm
5mg/L的培养基上，继代苗芽的分化和成苗数即显著
下降，且植株全部褐化；Hm超过10mg/L时继代苗全
部褐化死亡。因此，Hm5mg/L可作为基因转化后苹果
表2潮霉素对继代苗生长及褐化的影响
抗性苗的筛选浓度（表2）。
2.3卡那霉素对叶片离体再生的影响
由表3可以看出，接种在不同浓度Km培养基上
的苹果离体叶片对Km的敏感程度比继代苗大得多，
附加5mg/LKm对出芽率影响差异不显著，但出芽数
明显下降；8mg/LKm时虽有极少数不定芽再生，但叶
片和芽几乎完全白化；10mg/LKm完全抑制了不定芽
分化，因此，Km10mg/L可作为苹果叶盘法转化时抗
性芽的选择压。
2.4潮霉素对叶片离体再生的影响
表3卡那霉素对叶片离体再生及白化的影响
表4潮霉素对叶片离体再生及褐化的影响
将侵菌后的叶片共培养两天后接种在含有Carb
的培养基上，结果如表5所示，附加Carb对苹果离体
叶片再生不定芽有明显抑制作用，表现叶片愈伤组织
增多，出苗数减少，Carb400mg/L虽仍有少量不定芽
产生，但有褐化现象，Carb浓度高于500mg/L后不再
有不定芽分化。Carb对农杆菌LBA4404和EHA105
均有抑制作用，只是低浓度时抑制效果不佳，Carb
300mg/L仍有明显菌落出现，Carb400mg/L能完全抑
制农杆菌生长。
2.6头孢霉素对叶片离体再生的影响及抑制农杆菌的
效果
在含有Cef的培养基上接种共培养2d后的叶片，
结果表明Cef浓度在200mg/L内对不定芽的再生影
响不大（Cef100mg/L因有菌的存在，再生受到一定影
响），Cef浓度达到或超过300mg/L后显著抑制苹果叶
片不定芽再生。Cef对农杆菌的抑制作用好于Carb，附
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加 100mg/L的 Cef时菌落明显减少，浓度达到 200
mg/L时就能完全抑制农杆菌LBA4404的生长，这时
EHA105菌落也不十分明显，只是后期少量叶片下出
现菌落，300mg/L时完全抑制了EHA105生长（表6）。
3讨论
3.1嘎拉苹果对Km和Hm的敏感性
在构建基因表达载体时，常用的标记基因有Npt
Ⅱ或HPT，NptⅡ基因编码的新霉素磷酸转移酶可使
卡那霉素、新霉素等氨基糖苷类抗生素代谢失活，从而
解除毒性；HPT基因产物通过酶促磷酸化作用使潮霉
素失活，从而产生抗性。试验证明，嘎拉苹果组培苗生
长和叶片再生对Km和Hm都很敏感，在附加一定浓
度的Km或Hm的培养基上，继代苗表现不同程度的
白化或褐化甚至死亡，叶片不能再生，所以苹果叶盘法
基因转化时这两种选择标记都是适用的。其中苹果继
代苗对 Hm更为敏感，抗性芽的筛选浓度很低为
5mg/L，与Hm4mg/L的选择压相差很小，这样更利于
抗性芽的发生和转化体的筛选。故作者认为单从选择
和筛选效果看Hm比Km更适合作为苹果基因转化的
选择标记，这与Noreli和Bondt看法一致[8,9]，张明洲
等也认为筛选高梁转化体Hm比Km更合适[10]。不过
Hm比Km价格高很多，也是需要考虑的。
3.2不同抑菌剂对叶片不定芽分化的影响及抑制农杆
菌的效果
研究比较了两种抗生素的抑菌效果，表明Cef比
Carb的抑菌效果好，Cef浓度在200~300mg/L范围内
能完全抑制农杆菌生长，Carb400mg/L时才能抑制农
杆菌EHA105的生长。除抑菌效果外，Cef和Carb等
抗生素与生长素2,4-D和NAA有相似的化学结构，因
而在组织培养中具有激素效应，尤其与细胞分裂素(如
6-BA)混用时，改变了植物体的激素平衡，会对外植体
的分化和再生产生影响[11]。很多研究发现Cef对白菜、
甘蓝、高梁等组织块的芽分化有抑制作用，Carb则有
促进作用[10,12,13]，试验在苹果上的结果与此相反，Carb
能促进叶片愈伤组织发生但对不定芽再生有严重的抑
制作用，Cef对不定芽再生的抑制作用较小，低浓度
200mg/L时没有不利影响，James曾报道添加250mg/L
Cef可促进苹果叶片再生[14]，试验未发现这样的结果。
综合两种抗生素对抑菌和叶片再生的作用效果，作者
认为苹果叶盘法基因转化不适合选用羧卞青霉素作为
抑菌抗生素，头孢霉素是比较适宜的。
参考文献
[1] 秦玲,李明,王永熙,等.根癌农杆菌介导苹果遗传转化研究进展.西
北农林科技大学学报,2002,30(4):135~140
[2] HammerschlagFA,ZimmermanRH,Yadava,UL,etal.Efectof
antibioticsandexposuretoanacidifiedmediumontheelimination
ofagrobacteriumtumefaciensfromappleleafexplantsandonshoot
regeneration.J.Amer.Soc.Hort.Sci.,1997,122(6):758~763
[3] 赵瑞华,刘庆忠,孙清荣,等.抗生素对梨离体叶片不定芽再生的影
响.山东农业大学学报(自然科学版),2004,35(2):304~306
[4] 于志水,苘胜军,赵继梅,等.杨树转化受体系统再生初步研究及卡
那霉素敏感性测定.辽宁林业科技,2003,(5):9~10
[5] 龚学臣,季静,王罡,等.应用农杆菌介导法进行菊花的遗传转化.北
方园艺,2005,(2):66~67
[6] 杨广东,朱祯,李燕娥,等.几种抗生素对大白菜种子发芽及离体子
叶再生的影响.华北农学报,2002,17(1):55~59
[7] 范国强,赵振利,曹艳春.抗生素对悬铃木体外植株再生影响的研
究.河南农业大学学报,2004,38(3):279~284
[8] NoreliJL,AldwincHS.Theroleofaminoglycosideantibiticsin
the regeneration and selection of neomycin
phosphotransferase-transgenicappletissue.J.Amer.Soc.Hort.Sci.,
1995,118(2):311~316
表5羧苄青霉素对叶片离体再生的影响及抑制农杆菌的效果
表 6头孢霉素对叶片离体再生的影响及抑制农杆菌的效果
农业生物技术科学 83· ·
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htp:/www.casb.org.cn
[9] BondtAD,EggermontK,PenninckxI.Agrobacterium-mediated
transformationofapple(MalusdomesticaBorkh.):anassessmentof
factorsafectingregenerationoftransgenicplant.PlantCelRep.,
1996,15:549~554
[10] 张明洲,崔海瑞,舒庆尧,等.抗生素对高粱离体培养反应的影响.核
农学报,2004,18(2):113~117
[11] LinJJ,NacyraAG,JonathanK.Planthormoneefectofantibiotics
on transformation eficientofplanttissuebyAgrobacterium
tumefacienscels.PlantSci.,1995,109:171~177
[12] 佘建明,蔡小宁,朱祯,等.普通不结球白菜抗虫转基因植株的获得.
江苏农业学报,2000,16(2):79~821
[13] 方宏筠,李大力,王关林,等.转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因抗虫甘蓝
植株的获得.植物学报,1997,39(10):940~951
[14] JamesDJ,PasseyAJ,BarbaraDJ,etal.Genetictransformation]of]
apple（Malus]pumila]Mil）usingadisamedTi-binaryvector.Plant
CelRep.,1989,(7):658~661
（责任编辑：陶冶之）
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