全 文 ：37※基础研究 食品科学 2008, Vol. 29, No. 06
苦丁茶冬青叶多糖的分离纯化及
其对羟自由基的清除作用
王 新1，何玲玲2，刘 彬1,*
(1.辽宁大学药学院，辽宁 沈阳 110036；2.沈阳化工学院应用化学学院，辽宁 沈阳 110142)
摘 要：苦丁茶冬青叶经乙醇脱脂、水提醇沉和Sevag法除蛋白，得苦丁茶冬青叶粗多糖KPSⅡ。KPSⅡ经DEAE-
纤维素阴离子交换层析柱分离纯化，得到两个纯化多糖组分KPSⅢa和KPSⅢb。KPSⅢa和KPSⅢb经过硫酸水
解，还原乙酰化，用气相色谱方法测定了其组成及相对含量。KPSⅢa与KPSⅢb均主要由阿拉伯糖、木糖、甘
露糖、半乳糖和葡萄糖组成，其摩尔比分别为10.2:1.0:1.2:8.0:5.4和17.7:1.0:1.1:1.8:4.1。以Fenton反应为产生·OH
模型，用紫外分光光度法实验了苦丁茶冬青叶多糖(KPSⅡ、KPSⅢa、KPSⅢb)对模型中产生的·OH的清除作
用。结果表明，KPSⅡ、KPSⅢa、KPSⅢb对·OH都具有一定的清除作用，且清除率与多糖的浓度存在一定
的量效关系。苦丁茶冬青叶粗多糖KPSⅡ对·OH的清除作用均比纯化多糖(KPSⅢa、KPSⅢb)强。
关键词：苦丁茶冬青叶；多糖；分离纯化；羟自由基
Study on Extraction, Purification and Scavenging Activity to Hydroxyl Radicals of
Polysaccharides from Leaves of Ilex kudinchaC. J. Tseng
WANG Xin1，HE Ling-ling2，LIU Bin1,*
(1. School of Pharmaceutical Sciences, Liaoning University, Shenyang 110036, China；
2. School of Applying Chemical, Shenyang Institute of Chemical Technology, Shenyang 110142, China)
Abstract ：The leaves of Il x kudincha C. J. Tseng were defatted with 95% EtOH， xtracted with water and deproteined three
times by Sevag method, and from them, crude polysaccharide noted as KPSⅡwas obtained. The crude polysaccharide KPSⅡ
was purified by DEAE-cellulose column, and two refined polysaccharides noted as KPSⅢa and KPSⅢb w re obtained. KPS
Ⅲa and KPSⅢb were hydrolyzed by 2 mol/L H2SO4, reduced with NaBH4, and were then acetylated with Ac2O. The consequent
alditol acetate derivatives were analyzed by GC. The results indicated that KPSⅢa an KPSⅢb are bot composed of ar binose,
xylose, mannose, galactose and glucose with the molar ratio of 10.2 : 1.0 : 1.2 : 8.0 : 5.4 and 17.7 : 1.0 : 1.1 : 1.8 : 4.1, respectively.
The scavenging effects of the polysaccharides of Ilex kudincha C. J. Tseng (KPSⅡ, KPSⅢa and KPSⅢb) on hydroxyl radicals
were studied by UV-Visible spectroscopy. The hydroxyl radicals were produced by Fenton reaction. The results showed that
KPSⅡ, KPSⅢa and KPSⅢb have the scavenging activity to hydroxyl radicals, in a concentration-dependent manner. The
scavenging capacity of the crude polysaccharide of Ilex kudincha C. J. Tseng to hy roxyl radicals is higher than that of the refined
polysaccharides.
Key words：leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng；polysaccharides；extraction and purification；hydroxyl radicals
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2008)06-0037-04
收稿日期：2007-06-28
作者简介：王新(1976-)，男，讲师，硕士，主要从事天然产物活性成分研究。E-mail：wangxinlnu@yahoo.com.cn
*通讯作者：刘彬(1970-)，女，副教授，博士研究生，主要从事天然生物活性成分研究。E-mail：liubinzehao@163.com
苦丁茶冬青(Ilex kudincha C. J. Tseng)是冬青科
(Aquifoliaceae)冬青属乔木植物，主产于湖南、湖北、
广东、广西、海南等省。叶(苦丁茶)苦、甘、凉，
能清热解毒、祛暑，主要用于治疗头痛、齿痛、目
赤、热病烦渴、痢疾等症[1]。近年来，已有人对苦丁
茶冬青叶(苦丁茶)的化学成分和药理作用作了一些研究，
为其临床应用提供了一定的理论依据[2]。本实验在前期
工作[3-5]的基础上，研究苦丁茶冬青叶多糖的部分理化性
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质及其对羟自由基的清除活性。
1 材料与方法
1.1材料、试剂与仪器
苦丁茶冬青叶水提物精粉和苦丁茶冬青叶由海南澄
迈万昌苦丁茶场提供，经晾干、粉碎后，用水于80℃
浸提，提取液经浓缩后喷雾干燥得红棕色粉末，密封
保存备用。
所用化学试剂均为国产分析纯。
UV-2501PC紫外-可见吸收光谱仪 日本岛津公司；
EQUINOX 55傅里叶变换红外光谱仪 德国Bruker公司；
Vatio EL元素分析仪 德国Elementar公司；CP3800气
相色谱仪 美国Varian公司。
1.2方法
1.2.1多糖的提取
苦丁茶冬青叶多糖KPSⅡ的提取及Sevag法脱蛋白
参考文献[4]。
1.2.2多糖的分级纯化
将二乙胺基乙基纤维素用大量去离子水浸泡悬浮，
倾泌除去细碎粉末；然后用4倍量0.5mol/L的盐酸溶液
浸泡搅拌处理30min，滤去酸液，加入去离子水洗至中
性；再用0.5mol/L的氢氧化钠溶液浸泡搅拌处理30min，
滤去碱液，用去离子水洗至中性后，填充5.0×30cm层
析柱，用2倍量去离子水平衡。
取1.0g KPSⅡ溶解后上样，去离子水洗脱后分别用
0.1、0.3、0.5mol/L氯化钠溶液梯度洗脱，洗脱液流速
为60ml/h，分部收集，每管10ml，隔管取0.2ml洗脱
液用苯酚-硫酸法检测洗脱液中多糖的含量，以482nm
处吸光度为纵坐标，分部收集的管数为横坐标，作出
多糖的洗脱曲线。将柱层析分出的各个组分分别合并收
集，浓缩，自来水流水透析48h，去离子水透析24h，
每4～6h换一次水。离心除去不溶性杂质后，用4倍体
积的95%乙醇进行沉淀，固体部分用少量无水乙醇洗涤
2次，再用无水乙醚洗涤2次，自然晾干后放入真空干
燥箱干燥4h(50 ℃，－0.096MPa)，得苦丁茶冬青叶纯
化多糖(KPSⅢa、KPSⅢb)。
1.2.3多糖的光谱分析
1.2.4蛋白质含量及多糖含量测定
采用元素分析仪测定含氮量，换算得出蛋白质含量
(换算因子为6.25)；苯酚-硫酸法测定多糖含量，以葡
萄糖为标准品，校正因子为0.9[6]。
1.2.5多糖的糖基组成及含量分析
1.2.5.1完全酸水解
多糖样品10mg，加入1mol/L硫酸2.0ml，充氮气
后封管，100℃反应5h，再以固体碳酸钡中和，滤去
沉淀，用去离子水洗涤沉淀2次，合并滤液，减压浓
缩至干。
1.2.5.2还原乙酰化衍生
水解糖样溶解在2.0ml的0.05mol/L氢氧化钠溶液
中，加入50mg的硼氢化钠，80℃反应5h进行还原。
加乙酸至无气泡逸出为止，减压抽干。加入2.0ml冰醋
酸-无水甲醇(5:95，V/V)并振荡溶解后，减压抽干。这
样反复处理5次以除去硼酸根。将2.0ml吡啶和2.0ml乙
酸酐加入到干燥的盛有还原糖样的反应瓶中，在100℃
反应60min。加水5.0ml破坏乙酸酐后，用三氯甲烷萃
取，再分别以0.5mol/L盐酸和去离子水清洗，最后加
入适量的无水硫酸酸钠除去残余的水。滤出清液，即
得糖的还原乙酰化产物，减压浓缩至所需体积进气相色
谱仪分析。
1.2.5.3气相色谱分析条件
色谱柱为HP-5MS石英毛细管柱；升温程序：150℃
保温3min，以10℃/min升至200℃并保持8min，再以
10℃/min升至250℃并保持3min；进样口温度220℃；载
气为高纯氮，流速1.0ml/min；分流进样，分流比10:1；
进样量0.5μl。
1.2.6多糖对羟自由基的清除作用
采用邻二氮菲-Fe2+氧化法检测H2O2/Fe2+体系产生的
羟自由基[7]。以去离子水将50mmol/L的邻二氮菲无水乙
醇溶液稀释至5mmol/L，取此液1.5ml，加入0.75mol/L
磷酸盐缓冲液(pH7.4)4.0ml，充分混匀后加入7.5mmol/L
硫酸亚铁溶液1.0ml，每加一管立即混匀，加入不同浓
度多糖样品溶液2.5ml后，加1% H2O2 1.0ml，反应液
在37℃保温1h，于536nm处测定吸光度A样品。空白组
以等体积的去离子水代替样品溶液测定A空白；对照组以
等体积的去离子水代替1% H2O2和样品溶液测定A对照。
实验结果以清除率E表示：
A样品－A空白
E(%)=——————— ×100
A对照－A空白
本实验所提供的数据为5次平行测定的平均值。
2 结果与分析
2.1分离纯化与组成分析
图1 苦丁茶冬青叶粗多糖KPSⅡ在DEAE-Cellulose柱层析上的洗脱曲线
Fig.1 Elution curve of KPSⅡ from leaves of Ilex kudincha C. J.
Tseng on DEAE-Cellulose column
A与B分别表示0.1与0.3mol/L NaCl溶液洗脱组分。
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0.0
200 400 600 800
A
A
管数
B
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苦丁茶冬青叶粗多糖KPSⅡ经DEAE-纤维素柱分离
纯化后，于0.1、0.3mol/LNaCl洗脱液中分别得到一个
纯化多糖组分(KPSⅢa和KPSⅢb)，KPSⅢa 为51.67mg、
KPSⅢb 为35.85mg。结果见图1。
苦丁茶冬青叶多糖KPSⅢa和KPSⅢb的红外谱图
见图2、3。可见，3600～3200cm-1出现的宽峰为糖类物
质中分子内和分子间氢键的O-H伸缩振动；2935cm-1附近
一小尖峰为C-H伸缩振动；1400～1200cm-1的一些峰为
C-H的变角振动；1250～950cm-1间比较大的吸收峰是由
两种C-O的伸缩振动引起的，一种是属于C-O-H的，另
一种是吡喃糖环的C-O-C；另外，KPSⅢa在896cm-1、
KPSⅢb在894cm-1(891±7cm-1)处有明显吸收，是吡喃
糖β-端基差向异构的C-H变角振动的特征峰；KPSⅢ
a在859cm-1(858±7cm-1，呋喃糖衍生物C型特征吸收)
处有明显吸收，是由环和取代基的伸缩振动以及次甲基
的横向振动造成的；KPSⅢb在816cm-1(799±17cm-1，
呋喃糖衍生物D型特征吸收)处有明显吸收，是呋喃糖
C-H的变角振动[8]。
图3 苦丁茶冬青叶多糖KPSⅢb红外光谱图
Fig.3 IR spectrogram of KPSⅢ b from leaves of Ilex kudincha C.
J. Tseng
100
80
60
40
20
0
4000350030002500200015001000500
透
光
率
(
%
)
波数(cm-1)
3
3
8
8
.
5
2
9
3
7
.
3
1
6
1
0
.
9
1
4
2
3
.
8
1
0
9
7
.
2
7
7
6
.
3
5
3
9
.
0
图4 苦丁茶冬青叶多糖KPSⅢa紫外光谱图
Fig.4 UV-Visible spectrogram of KPSⅢ a from leaves of Ilex
kudincha C. J. Tseng
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
200 250 300 350 400
A
波长(nm)
图5 苦丁茶冬青叶多糖KPSⅢb紫外光谱图
Fig.5 UV-Visible spectrogram of KPSⅢ b from leaves of Ilex
kudincha C. J. Tseng
0.10
0.08
0.06
0.04
0.02
0.00
200 250 300 350 400
A
波长(nm)
KPSⅢa和KPSⅢb的紫外光谱图见图4、5。可
见，260nm与280nm处吸光度均较低，说明经分级纯
化后，多糖样品中的蛋白质、核酸的含量已大大降低。
KPSⅢa和KPSⅢb的蛋白质与多糖含量测定结果见表
1。可见，经分级纯化后，多糖样品中仍含有少量的
蛋白质，说明它们与多糖结合紧密，KPSⅢa和KPSⅢ
样品 N(%) 蛋白质含量(%) 多糖含量(%)
KPSⅢa 0.435 2.72 72.31
KPSⅢb 0.523 3.27 67.26
表1 苦丁茶冬青叶多糖KPSⅢa和KPSⅢb的蛋白质含量及多糖含量
测定结果
Table 1 Determination results of contents of proteins and polysaccha-
rides of KPSⅢ a and KPSⅢ b from leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng
b可能是蛋白质结合多糖。KPSⅢa和KPSⅢb中多糖
的含量分别为72.31%和67.26%，多糖与蛋白质的比率
分别为96.4:3.6与95.4:4.6。
KPSⅢa、KPSⅢb及各单糖标准品经水解，还原
乙酰化后进气相色谱分析，结果见图6、7。其保留时
间与标准单糖乙酰化产物的保留时间对照分析(表2)，可
图2 苦丁茶冬青叶多糖KPSⅢa红外光谱图
Fig.2 IR spectrogram of KPSⅢ a from leaves of Ilex kudincha C.
J. Tseng
100
80
60
40
20
0
4000350030002500200015001000500
3
3
8
9
.
5透
光
率
(
%
)
波数(cm-1)
2
9
3
2
.
4
1
6
1
3
.
6
1
0
2
8
.
6
1
4
2
1
.
5
1
2
4
3
.
0
8
9
6
.
0
6
3
8
.
8
5
3
6
.
0
图6 苦丁茶冬青叶多糖KPSⅢa水解物乙酰化衍生物气相色谱图
Fig.6 GC analysis of alditol acetate derivatives of KPSⅢ a from
leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng
12.5
10.0
7.5
5.0
2.5
0.0
6 7 8 9 10 1112
相
对
丰
度
(
%
)
保留时间(min)
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图7 苦丁茶冬青叶多糖KPSⅢb水解物乙酰化衍生物气相色谱图
Fig.7 GC analysis of alditol acetate derivatives of KPSⅢ b from
leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng
30.0
20.0
10.0
0.0
6 7 8 910 11 12
相
对
丰
度
(
%
)
保留时间(min)
单糖名称
标准单糖衍生物 KPSⅢa水解样衍生物 KPSⅢb水解样衍生物
保留时间(min)保留时间(min) 保留时间(min)
阿拉伯糖 7.918 7.923 7.927
木糖 8.130 8.109 8.106
甘露糖 11.328 11.321 11.321
半乳糖 11.512 11.523 11.509
葡萄糖 11.616 11.688 11.676
表2 各标准单糖、KPSⅢa和KPSⅢb糖醇乙酸酯衍生物气相色谱分
析结果气相色谱分析
Table 2 Gas chromatography results of alditol acetate derivatives
of KPSⅢ a and KPSⅢ b from leaves of Ilex kudincha C. J. Tseng
and standard monosacchrides
以确定KPSⅢa和KPSⅢb的糖基部分均主要由阿拉伯
糖、木糖、甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成，其各糖
摩尔比分别为为10.2:1.0:1.2:8.0:5.4和17.7:1.0:1.1:1.8:4.1。
2.2多糖对羟自由基的清除作用
苦丁茶冬青叶多糖(KPSⅡ、KPSⅢa、KPSⅢb)
对·OH的清除作用结果见图8。可见，KPSⅡ、KPS
Ⅲa、KPSⅢb对H2O2/Fe2+体系通过Fenton反应产生
的·OH都具有清除作用，且随着多糖浓度的增加，清
除率上升，即清除率与多糖的浓度存在一定的量效关
系。KPSⅡ对·OH的清除率达50%时所需多糖浓度
(EC50)为314.90mg/L，KPSⅢa 的EC50为513.81mg/L，说
明在相同时间内KPSⅡ对·OH的清除作用比KPSⅢa
强。KPSⅢb 对·OH的清除作用相对较弱，浓度为
525.68mg/L时清除率为26.54%。
图8 不同苦丁茶冬青叶多糖对羟自由基清除作用趋势曲线
Fig.8 Curves of scavenging effects of polysaccharides of Ilex
kudincha C. J. Tseng (KPSⅡ, KPSⅢ a and KPSⅢ b) on
hydroxyl radicals
70
60
50
40
30
20
10
0 9
0
0
8
0
0
7
0
0
6
0
0
5
0
0
4
0
0
3
0
0
2
0
0
1
0
0
0－
1
0
0
消
除
率
(
%
)
浓度(mg/L)
KPSⅠ KPSⅢa
KPSⅢb
3 讨 论
多糖本身为大分子物质，且由于含有大量羟基不能
在高温下直接挥发而不适用于气相色谱，因而在测试前
应将大分子多糖降解为结构单糖或寡糖，并将其衍生成
具有易挥发且对热稳定的衍生物。目前常用于多糖降解
的方法有酶解及硫酸、三氟乙酸等酸水解，本实验采
用的硫酸水解具有操作简单、价格低廉等优点。适用
于气相色谱分析的糖的衍生化方法有三甲基硅烷衍生
化、糖醇乙酸酯衍生化、糖腈衍生化等，本实验采用硼
氢化钠将醛糖还原成糖醇，可有效地克服由于糖的异构化
而造成的多峰现象，使每个糖醇乙酸酯衍生物仅有一个
峰，并且衍生物十分稳定，有利于进行气相色谱分析。
Fenton反应是体内产生羟自由基的重要机理，羟自
由基是造成组织脂过氧化、蛋白质解聚与聚合，核酸
断裂、多糖解聚的重要活性氧。羟自由基清除率是反
应药物抗氧化作用的重要指标[7]。苦丁茶冬青叶多糖
(KPSⅡ、KPSⅢa 、KPSⅢb)对·OH均具有清除作
用，而且与苦丁茶冬青叶多糖的浓度呈正相关关系。经
纯化精制后的苦丁茶冬青叶多糖(KPSⅢa 、KPSⅢb)
对·OH的清除作用均小于苦丁茶冬青叶多糖粗品(KPS
Ⅱ)。此结果提示：(1)粗多糖中含有的与多糖无关联的杂
质可能具有较强的抗氧化活性，从而使粗多糖清除·OH
的能力强一些；(2)纯化处理过程中许多原本与多糖相结
合的成分被除去，如糖肽、结合蛋白质等，而这些成
分可能具有一些较强的抗氧化性，这些成分的除去可能
导致纯化多糖清除·OH的能力下降；(3)苦丁茶冬青叶
多糖的抗氧化性差异也可能是由于粗多糖中含有多种级
分多糖，它们的共同作用导致其清除·OH的能力比纯
化多糖强一些。
本实验采用的检测苦丁茶冬青叶多糖清除自由基活
性的模型方法，简便实用，虽然所得到的结论不能完
全代表药物在体内清除自由基的实际情况，然而对于离
体大面积筛选抗氧化药物有重要的价值。
采用气相色谱法研究了苦丁茶冬青叶多糖的糖基组
成和相对含量及其对羟自由基的清除作用，可为其进一
步研究与开发利用提供一定的科学依据。
参考文献：
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