全 文 ：星点设计－效应面优化法优选连钱草中总黄酮超声提
取工艺＊
杨菁，潘金火＊，梅馨 （南京中医药大学药学院，江苏 南京 ２１００４６）
摘要：目的 星点设计－效应面优化法优选连钱草中总黄酮的提取工艺。方法 以甲醇浓度、超声时间和溶剂用量为考察因
素，以连钱草总黄酮的含量为评价指标，借助紫外分光光度法，运用效应面法优化超声波提取连钱草总黄酮的工艺条件。结
果 连钱草的最佳提取条件为甲醇浓度５５％、超声９０ｍｉｎ及８倍量溶剂。结论 星点设计－效应面优化法可用于连钱草总黄
酮提取工艺的优化，模型预测性良好，提取条件稳定，实验设计方法有较高的可靠性。
关键词：连钱草；总黄酮；紫外可见分光光度法；星点设计－效应面优化法
中图号：Ｒ２８３．６ 文献标志码：Ａ 文章编号：１６７２－０４８２（２０１２）－０２６９－０３
Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｏｎ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｏｔａｌ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｌｏｎｇｉｔｕｂａ ｗｉｔｈ Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ Ｗａｖｅ ｂｙ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｄｅｓｉｇｎ－Ｒｅ－
ｓｐｏｎｓｅ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｍｅｔｈｏｄ
ＹＡＮＧ Ｊｉｎｇ，ＰＡＮ Ｊｉｎ－ｈｕｏ＊ ，ＭＥＩ Ｘｉｎ
（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，Ｎａｎｊｉｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｎａｎｊｉｎｇ，２１００４６，Ｃｈｉｎａ）
ＡＢＳＴＲＡＣＴ：ＯＢＪＥＣＴＩＶＥ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｌｏｎｇｉｔｕｂａ ｂｙ ｃｅｎ－
ｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄ．ＭＥＴＨＯＤＳ Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｗｅｒｅ ｍｅｔｈａｎｏｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ
ｔｉｍｅ ａｎｄ ｓｏｌｖｅｎｔ，ｗｈｉｌｅ ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｖａｒｉａｂｌｅｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ．Ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ－ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ
ｍｅｔｈｏｄ（ＣＣＤ－ＲＳＭ）ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｎｇ ｐｒｏｃｅｓｓ．ＲＥＳＵＬＴＳ Ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ｗａｓ ５５％
ｍｅｔｈａｎｏｌ，ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ ９０ｍｉｎ ａｎｄ ８ｔｉｍｅｓ ｔｈｅ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ ｓｏｌｖｅｎｔ．ＣＯＮＣＬＵＳＩＯＮ ＣＣＤ－ＲＳＭ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
ｏｆ ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｏｆ Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｌｏｎｇｉｔｕｂａ，ａｎｄ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｕｍ ｍａｔｈｅｍａｔｉｃ ｍｏｄｅｌ ｉｓ ｈｉｇｈｌｙ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｄｅｓｉｇｎ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｈａｖｅ ｈｉｇｈｅｒ ｒｅｌｉａｂｉｌｉｔｙ．
ＫＥＹ ＷＯＲＤＳ：Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｌｏｎｇｉｔｕｂａ；ｔｏｔａｌ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ＵＶ；ＣＣＤ－ＲＳＭ
本实验结合紫外－可见分光光度法，利用效应面
优化法（ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｓｕｒｆａｃｅ ｍｅｔｈｏｄ，ＲＳＭ）优选连钱
草中总黄酮的提取工艺［１－２］，采用非线性数学模型拟
合的方式，使自变量和因变量的关系扩展到曲面，从
而使实验数据更加精密，比传统的正交设计法更具
可信性。
１ 材料
１．１ 仪器
ＵＶ－７５２型紫外－可见分光光度计；ＦＡ－１１０４型
电子分析天平；ＫＨ－５００Ｂ型超声波清洗仪；ＦＷ１００
型高速万能粉碎机。
１．２ 试药
芦丁对照品（中国药品生物制品检定所，批号：
０８０－９３０３）；水为蒸馏水；其他试剂均为分析纯。
连钱草药材，采于江苏及其周边地区，经南京中
医药大学中药系药用植物教研室炮制教研室巢建国
教授鉴定为唇形科植物活血丹Ｇｌｅｃｈｏｍａ ｌｏｎｇｉｔｕｂａ
（Ｎａｋａｉ）Ｋｕｐｒ．的地上部分。粉碎，备用。
２ 方法和结果
２．１ 对照品溶液的制备
精密称取芦丁对照品２２．８５ｍｇ，置于１００ｍＬ
量瓶中，加甲醇约６０ｍＬ，密塞，超声使其溶解，放
冷，加甲醇至刻度，摇匀，得芦丁对照品溶液（即每
ｍＬ溶液中含芦丁对照品为０．２２８ ５ｍｇ）。
２．２ 供试品溶液的制备
取连钱草粉末约０．５ｇ，精密称定，置具塞锥形
瓶中，精密加入５５％甲醇４０ｍＬ，密塞，称定质量，
室温下超声提取（功率２５０Ｗ，１００ｋＨｚ）９０ｍｉｎ，放
—９６２—
南京中医药大学学报２０１２年５月第２８卷第３期
ＪＯＵＲＮＡＬＯＦ ＮＡＮＪＩＮＧ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ ＯＦ ＴＣＭ Ｖｏｌ．２８ Ｎｏ．３ Ｍａｙ２０１２
收稿日期：２０１１－１２－１０；修稿日期：２０１２－０３－０５
基金项目：江苏省中医药局科技项目（ＬＢ０９０１２）
作者简介：杨菁（１９８６－），女，江苏常州人，南京中医药大学２００９级硕士研究生。＊通信作者：ｐａｎｊｉｎｈｕｏ＠１６３．ｃｏｍ
DOI:10.14148/j.issn.1672-0482.2012.03.025
冷，补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
２．３ 最大吸收波长的选择
分别精密吸取上述供试品溶液２ｍＬ和芦丁对
照品溶液２ｍＬ，置２５ｍＬ量瓶中，加水至６ｍＬ，加
５％亚硝酸钠溶液１ｍＬ，摇匀，放置６ｍｉｎ，加１０％
硝酸铝溶液１ｍＬ，摇匀，放置６ｍｉｎ，加入氢氧化钠
试液１０ｍＬ，再加水至刻度，摇匀，放置１５ｍｉｎ，分别
作为供试品溶液和对照品溶液，并以相应的试剂为
空白，照紫外－可见分光光度法（《中华人民共和国药
典》２０１０年版一部附录 ＶＡ），于２００～８００ｎｍ 扫
描，结果在５１０ｎｍ处有最大吸收，故以５１０ｎｍ为测
定波长。
２．４ 方法学考察
２．４．１ 标准曲线的测定
精密量取上述芦丁对照品溶液１．０、２．０、３．０、
４．０、５．０、６．０ｍＬ，分别置于２５ｍＬ量瓶中，各加水
至６ｍＬ，加５％亚硝酸钠溶液１ｍＬ，摇匀，放置６
ｍｉｎ，加１０％硝酸铝溶液１ｍＬ，摇匀，放置６ｍｉｎ，加
入氢氧化钠试液１０ｍＬ，再加水至刻度，摇匀，放置
１５ｍｉｎ，以相应的试剂为空白，在５１０ｎｍ处测定吸
光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲
线，得回归方程：Ａ＝１１．２７Ｃ＋０．００１（ｒ＝０．９９９ ５），
式中Ａ代表吸光度，Ｃ代表对照品浓度（ｍｇ／ｍＬ），
对照品浓度在０．００９ １４～０．０５４ ８４ｍｇ／ｍＬ范围内
呈良好的线性关系。
２．４．２ 精密度试验
取浓度为０．０３６ ５６ｍｇ／ｍＬ的对照品溶液，连续
测定６次，对照品溶液吸光度平均值为０．４１６，ＲＳＤ
为０．１３％，表明测定方法的精密度良好。
２．４．３ 稳定性试验
精密吸取同一份供试品溶液２ｍＬ，置于２５ｍＬ
量瓶中，照２．４．１项下的显色方法处理样品，于５１０
ｎｍ测定吸光度，每间隔５ｍｉｎ测定１次，在３０ｍｉｎ
内，吸光度平均值为０．４２３，ＲＳＤ为０．８１％，说明供
试品溶液在３０ｍｉｎ内显色稳定。
２．４．４ 重复性试验
取同一批次连钱草粉末，制得６份供试品溶液，
于５１０ｎｍ依法测定吸光度并计算出连钱草中总黄
酮的平均含量为３６．４９ｍｇ／ｇ，ＲＳＤ为１．１２％，表明
该方法的重复性良好。
２．４．５ 加样回收率试验
取已知含量连钱草粉末６份，每份约０．２ｇ，精
密称定，分别置于锥形瓶中，各加入新鲜配制的芦丁
对照品溶液（浓度为１．４２５ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬ，按２．２项
下供试品溶液的制备方法制备样品，于５１０ｎｍ处依
法测定吸光度，计算加样回收率，结果平均加样回收
率为９９．３２％，ＲＳＤ为２．３８％。
２．５ ＣＣＤ－ＲＳＭ 优化连钱草中总黄酮的提取工艺
２．５．１ 单因素考察
按２．２项下供试品溶液的制备方法提取连钱草
中总黄酮，其中影响提取效果的可能因素较多。为
了便于操作和保证实验精度，以连钱草总黄酮的含
量为指标，采用单因素试验，比较了超声法、加热回
流法及渗漉法的提取效率和操作步骤的繁易程度，
最后决定采用超声提取法；在溶剂的选用上，水、甲
醇、乙醇均是提取黄酮类成分的常用溶剂，尤其是甲
醇，提取效果较佳。（本实验从验证星点设计实验的
准确性出发，故而选之，并未考虑到工业化生产，可
以考虑用乙醇做替代实验。）进而分别对甲醇的浓度
（４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％），超声提取的时
间（２０、４０、６０、１２０、１８０ｍｉｎ），超声次数（１、２、３、４
次）以及溶剂的用量（３０、４０、５０ｍＬ）这些因素进行
了考察。实验发现，６０％的甲醇具有最佳提取效果，
超声时间在６０ｍｉｎ及１２０ｍｉｎ时提取总黄酮含量最
多，溶剂的用量以４０ｍＬ为宜，其他因素的影响作
用较弱，暂不予考虑。
２．５．２ ＣＣＤ－ＲＳＭ
根据单因素考察结果，选择提取工艺中对总黄
酮含量有影响的３个主要因素为考察对象，即甲醇
浓度（Ｘ１）、超声时间（Ｘ２）及溶剂用量（Ｘ３），同时以
连钱草中总黄酮的含量（Ｙ）为评价指标。根据ＣＣＤ
的原理，每个因素取５个水平，因素和水平见表１，
实验设计及结果见表２。
表１ ３个考察因素的代码水平及对应物理量
自变量
水平
－１．７３２ －１ ０ １ １．７３２
甲醇浓度Ｘ１／％ ４０ ５０．５７ ６５ ７６．３８ ９０
超声时间Ｘ２／ｍｉｎ ３０ ６１．７ １０５ １３９．１５ １８０
溶剂用量Ｘ３／ｍＬ ３０ ３４．２３ ４０ ４４．５５ ５０
以连钱草中总黄酮的含量（Ｙ）为因变量，使用
Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ ７．０软件，分别对Ｘ１，Ｘ２，Ｘ３进行多元线
性回归和二次多项式回归拟合，结果如下：
多元线性回归方程：Ｙ＝４６．９９９ １８－０．３６２
８３ Ｘ１＋０．０３８ ９２ Ｘ２＋０．０１０ ３１９ Ｘ３，ｒ＝０．９２１ ７；
—０７２— 南京中医药大学学报２０１２年５月第２８卷第３期
表２ 实验设计和结果
编号
水平
Ｘ１／％ Ｘ２／ｍｉｎ Ｘ３／ｍＬ
Ｙ１／％
１ ５０．５７ ４１．１３ ３４．２３ ５．９６
２ ５０．５７ ４１．１３ ４４．５５ ６．１５
３ ５０．５７ ９２．７７ ３４．２３ ６．５２
４ ５０．５７ ９２．７７ ４４．５５ ６．９４
５ ７６．３８ ４１．１３ ３４．２３ ４．８７
６ ７６．３８ ４１．１３ ４４．５５ ４．８５
７ ７６．３８ ９２．７７ ３４．２３ ５．１８
８ ７６．３８ ９２．７７ ４４．５５ ５．５７
９ ４０．００ ７０．００ ４０．００ ７．０８
１０ ９０．００ ７０．００ ４０．００ ２．９３
１１ ６５．００ ２０．００ ４０．００ ５．３８
１２ ６５．００ １２０．００ ４０．００ ６．３３
１３ ６５．００ ７０．００ ３０．００ ５．９０
１４ ６５．００ ７０．００ ５０．００ ６．１６
１５ ６５．００ ７０．００ ４０．００ ６．０２
二元多项式方程：Ｙ＝－１２．２３７ １＋１．２１９ ３ Ｘ１
－０．０１０ ４ Ｘ１２＋０．０５６ １ Ｘ２－０．０００ ３ Ｘ２２＋０．６００
６ Ｘ３－０．００５ ３ Ｘ３２－０．０００ ７ Ｘ１Ｘ２－０．００４ ５ Ｘ１Ｘ３＋
０．００２ ０ Ｘ２Ｘ３，ｒ＝０．９８２ ９。
由结果可知，二次多项式拟合的相关系数优于
多元线性回归方程，因此本实验以二次多项式为其
数学模型。由于三维图只能表示效应对其中２个因
素的关系，为了考察各因素对指标的影响，先固定一
个对应变量影响最小的自变量，观察可知，Ｘ３对应
变量Ｙ的影响最小，一般设其值为中值，因此，选择
Ｘ３为４０，代入二次多项式方程，绘制因变量Ｙ对Ｘ１
（甲醇浓度）和Ｘ２（超声时间）的３Ｄ效应面图（Ａ）和
等高线图（Ｂ），见图１。
Ａ Ｂ
图１ 因变量Ｙ对Ｘ１和Ｘ２的３Ｄ效应面图（Ａ）和等高线图（Ｂ）
根据以上效应面图和等高线图直观分析，当溶
剂用量（Ｘ３）一定时，甲醇浓度（Ｘ１）在４０％～６０％
之间，超声时间（Ｘ２）在８０～１５０ｍｉｎ时连钱草中总
黄酮的提取含量达到最大。
２．６ 优选连钱草总黄酮提取工艺的验证试验
根据得到的最优条件，结合单因素考察结果和
实际可操作性，确定连钱草总黄酮的最优提取条件
为：甲醇浓度为５５％，超声时间为９０ｍｉｎ，溶剂用量
为药材量的８倍（本实验为４０ｍＬ），代入二项式方
程得到连钱草总黄酮含量的预测值为３５．３６ｍｇ／ｇ。
在此条件下提取连钱草药材，依法测定其总黄酮含
量，对预测结果进行验证。结果显示，３批连钱草药
材总黄酮的平均含量为３５．６６ｍｇ／ｇ，预测值与实际
值之间偏差较小，本实验确定的最佳提取工艺条件
合理，且具有较好的稳定性和重现性。
３ 讨论
目前国内多采用单因素考察或正交设计法优化
中药有效成分的提取纯化等工艺，虽然以上方法较
为简便，但精度不高，而且大多情况下，各因素对效
应的影响并非线性，实验数据没有可靠的预测性。
就传统的正交设计法而言，虽然实验次数较少，但由
于因素之间交叉的不够全面而导致实验结果与单纯
的单因素考察结果存在偏差。本实验采用 ＣＣＤ－
ＲＳＭ，通过非线性模型拟合得出最佳条件，可以很
好地解决传统正交设计的不足，从而提高优化效果。
由于ＣＣＤ－ＲＳＭ多被应用于药剂成型工艺的优
化或处方的筛选，而用于优化中药有效成分的提取
工艺的研究尚少，本实验验证了ＣＣＤ－ＲＳＭ 能用于
优化连钱草中总黄酮的提取工艺。可见，该方法可
以应用到中药有效成分的提取分离及相关研究中，
方法值得推广。
参考文献：
［１］Ｐｉｏ ＴＦ，Ｍａｃｅｄ Ｏ．Ｃｕｌｔｉｎａｓｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ
ｉｎｌｉｑｕｉｄ ｍｅｄｉｕｍ ｕｓｉｎｇ ｃｅｎｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ［Ｊ］．Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２００８，３５：５９－６７．
［２］Ｒｏｓａ ＰＡＪ，Ａｚｅｖｅｄｏ ＡＭ，Ａｉｒｅｓ－Ｂａｒｒｏｓ ＭＲ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｎ－
ｔｒａｌ ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏ ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｓａｔｉｏｎ ｏｆ ａｑｕｅｏｕｓ ｔｗｏ－ｐｈａｓｅ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ［Ｊ］．Ｊ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ Ａ，２００７，４３：
４７１－４８０． （编辑：李伟东）
—１７２—杨菁，等：星点设计－效应面优化法优选连钱草中总黄酮超声提取工艺 第３期