全 文 ：分子植物育种，2010年，第 8卷，第 3期，第 612-618页
Molecular Plant Breeding, 2010, Vol.8, No.3, 612-618
技术改进
Upgraded Technology
芦笋 SRAP反应体系优化及引物筛选
盛文涛 1,2 周劲松 1 汤泳萍 1 罗绍春 1 陈光宇 1*
1江西省农业科学院生物工程中心,南昌, 330200; 2南昌大学生命科学与食品工程学院,南昌, 330200
*通讯作者, genebksh@hotmail.com
摘 要 本研究以芦笋基因组总 DNA为模板，通过对芦笋 SRAP反应体系的重要参数进行优化,建立了一
套适用于芦笋的 SRAP反应体系：25 μL的反应体系中，模板 DNA量 80 ng、Mg2+浓度 3.0 mmol/L、上下游
引物各 0.2 μmol/L、dNTPs 0.3 mmol/L、Taq DNA聚合酶 1 U以及 1×Buffer。扩增程序为：94℃预变性 3 min；
94℃30 s、35℃30 s、72℃1.5 min，5个循环；然后退火温度提高到 50℃，35个循环；最后 72℃延伸 10 min。比
较琼脂糖凝胶和变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测 SRAP扩增产物的多态性，结果发现：6%变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳检测扩增产物比琼脂糖的效果好。利用该优化体系筛选引物，从 256个 SRAP引物组合中筛选出 239
个，它们具有扩增条带清晰、丰富、重复性好的优点，证明了此优化体系稳定可靠。
关键词 芦笋, SRAP,反应体系,优化,引物筛选
Optimization of SRAP Reaction System and Selection of Primers for As－
paragus officinalis L.
Sheng Wentao 1,2 Zhou Jinsong 1 Tang Yongping 1 Luo Shaochun 1 Chen Guangyu 1*
1 Biotechnology Center, Jiangxi Academy of Agricultural Sciences, Nanchang, 330200; 2 School of Life Sciences and Food Engineering, Nanchang U-
niversity, Nanchang, 330200
* Corresponding author, genebksh@hotmail.com
DOI: 10.3969/mpb.008.000612
Abstract In this research, we utilized the total DNA of genome from asparagus to be as template for establishing
a SRAP reaction system suitable for asparagus through optimization of significant parameters of SRAP reaction
system. The results showed that the optimal reaction system was 25 μL total volume including 80 ng of template
DNA, 3.0 mmol/L of Mg2+, 0.3 mmol/L of dNTPs, 0.2 μmol/L of forward and reverse primers each and 1 U Taq
DNA polymerase. The reaction program was 3 min of pre-denaturation at 94℃, five cycles of three steps: 30 s of
denaturation at 94℃, 30 s of annealing at 35℃ and 1.5 min of elongation at 72℃. In the following 35 cycles, the
annealing temperature was increased up to 50℃ , with a final elongation step for 10 min at 72℃ . Compared on
polymorphism of SRAP-PCR products through agarose gels and denaturing polyacylamide gels, 6% denaturing
polyacylamide gels was better than agarose gels. Finally, 239 primer combinations, which had clear, abundant and
stable bands, were selected with the optimized system among the total 256 primer combinations. At the same time,
it implied this optimized system was stable and reliable.
Keywords Asparagus officinalis L., SRAP, Reaction system, Optimization, Selection of primer
www.molplantbreed.org/doi/10.3969/mpb.008.000612
基金项目：本研究由国家自然科学基金面上项目(30771376)和江西省自然科学基金项目(2007GZN1971)共同资助
相关序列扩增多态性(sequence-related amplified
polymorphism, SRAP) 2001年由美国加州大学 Li与
Quiros提出，是一种基于 PCR技术的新型分子标记，
无需任何序列信息(Li and Quiros, 2001)。该标记通过
独特的引物设计对 ORFs (open readings frames)进行
扩增，因个体不同及物种的内含子、启动子及间隔区
长度不同而产生多态性，其优点是：多态性高；产率
中等；重复性好；操作简单；在基因组中分布均匀；较
易对扩增得到的目标片段进行测序，易获取 ORFs甚
至目的基因的序列信息；引物具有通用性，正反向引
物两两组配可以得到许多引物对，提高引物的使用效
率，降低成本(李严和张春庆, 2005)。SRAP技术最早
是在芸薹属作物中开发利用，目前，已在马铃薯、水
稻、莴苣、花椰菜、油菜和大蒜等多种作物的种质资
源鉴定评价、遗传图谱构建(包括转录图谱)、重要性
状标记乃至基因分离克隆等方面都有成功的应用
(柳李旺等, 2004)。
芦笋(Asparagus officinalis L.)，属百合科天门冬
属多年生宿根性草本植物，是一种深受消费者喜爱
的营养保健型高档蔬菜，素有“蔬菜之王”的美誉(陈
光宇等, 2005)。近年来，在全国各地发展迅速，2008
年中国芦笋种植面积已达到 9.5万 hm2，约占世界芦
笋种植面积的 50%。由于芦笋已获知的基因组 DNA
序列信息少，目前国内外对芦笋种质资源遗传多样
性、遗传图谱构建和基因定位等方面的研究主要利
用 RAPD和 AFLP等分子标记技术，而 SRAP标记
在芦笋上的研究尚未见报道。近几年，有关 SRAP反
应体系和程序优化方面的研究报道比较多，如黄瓜
(柴丹丹等, 2008)、芝麻(车卓等, 2008)、苎麻(刘立军
等, 2006)、狗牙根(王志勇等, 2008)、大白菜(徐莹莹
等, 2008)、棉花(张大伟等, 2008)等，但不同的植物的
SRAP最佳反应体系差别很大(刘立军等, 2006)，甚至
同一种植物在不同的试验条件下其研究结果都有差
异，如黄瓜(王振国等, 2007;柴丹丹等, 2008)。因此，
本研究通过对芦笋 SRAP反应体系主要影响因素进
行优化，建立其最佳反应体系，为 SRAP标记技术在
芦笋分子遗传学研究方面的应用奠定基础。
1结果与分析
1.1模板 DNA用量对 PCR扩增的影响
模板 DNA含量是制约扩增产量及特异性的一
个因素，模板 DNA量过少时扩增产物少甚至无扩增
条带，过多时又会降低扩增特异性，增加非特异性产
物。本试验比较了不同的 DNA模板浓度对 PCR结
果的影响(图 1)，结果发现：反应体系为 25 μL，模板
DNA用量在 20~200 ng之间均能扩增出条带，说明
SRAP-PCR扩增对模板浓度的适应范围较宽，但在
20 ng和 50 ng时扩增的条带较淡，原因可能是模板
用量较少时，引物与模板的碰撞机会较少(车卓等,
2008)，当加入 80 ng、100 ng和 120 ng模板 DNA时
均能扩增出比较清晰丰富的条带，表明模板 DNA的
用量在 80~120 ng之间均能满足扩增的要求，且差异
不大，而在 200 ng扩增时出现了 1条浓抹带，可能是
模板用量过高导致非特异性的结果，80~120 ng范围
内，模板 DNA量越少越能减少 PCR抑制物含量取得
更好的扩增效果，因此，选用 80ng模板 DNA浓度。
1.2 Mg2+浓度对 PCR扩增的影响
Mg2+浓度不仅影响 Taq DNA聚合酶活性，而且
影响引物的退火温度、模板和中间产物的解离温度、
产物的特异性以及引物二聚体的形成等。Mg2+浓度过
高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降
低 TaqDNA聚合酶的活性，反应产物减少。本试验比
较了不同的Mg2+浓度对 PCR结果的影响(图 2)，结果
发现：Mg2+浓度为 1.0~1.5 mmol/L时，扩增条带微弱，
几乎看不到条带；Mg2+浓度为 2.0~2.5 mmol/L时 PCR
扩增的条带较少且弱；Mg2+浓度增加至 3.0 mmol/L
时，扩增的条带较多，带型清晰且稳定；Mg2+浓度＞
3.0 mmol/L，带型数量虽无明显变化，但背景值增高。
由此可见，Mg2+最佳的反应浓度 3.0 mmol/L。
图 2不同Mg2+浓度的 SRAP反应结果
注: 1~6: Mg2+浓度分别为 1.0 mmol/L, 1.5 mmol/L, 2.0 mmol/L,
2.5 mmol/L, 3.0 mmol/L, 3.5 mmol/L; M: DL2000 marker
Figure 2 The result of SRAP with different Mg2+ concentrations
Note: 1~6: Mg2+ concentratoin were 1.0 mmol/L, 1.5 mmol/L,
2.0 mmol/L, 2.5 mmol/L, 3.0 mmol/L, 3.5 mmol/L, respectively;
M: DL2000 marker
图 1不同 DNA浓度的 SRAP反应结果
注: 1~6:DNA浓度分别为 20 ng/25μL, 50 ng/25μL, 80 ng/25 μL,
100 ng/25 μL, 120 ng/25 μL, 200 ng DNA/
25 μL, M: DL2000 marker
Figure 1 The result of SRAP with different DNA concentrations
Note: 1~6: DNA concentration were 20 ng/25 μL, 50 ng/25 μL,
80 ng/25 μL, 100 ng/25 μL, 120 ng/25 μL, 200 ng DNA/25 μL,
respectively; M: DL2000 marker
芦笋 SRAP反应体系优化及引物筛选
Optimization of SRAP Reaction System and Selection of Primers for Asparagus officinalis L. 613
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 3不同 dNTPs浓度的 SRAP反应结果
注: 1~5: dNTPs浓度分别为 0.1 mmol/L, 0.2 mmol/L, 0.3 mmol/L,
0.4 mmol/L, 0.5 mmol/L; M: DL2000 marker
Figure 3 The result of SRAP with different dNTPs concentrations
Note: 1~5: dNTPs concentration were 0.1 mmol/L, 0.2 mmol/L,
0.3 mmol/L, 0.4 mmol/L, 0.5 mmol/L, respectively; M: DL2000
marker
性和酶耐热性等因素的制约，它的用量 Taq DNA聚
合酶用量偏低会使新链合成效率下降，导致扩增产物
减少，用量过高不仅造成浪费，而且使 PCR反应的稳
定性降低，并会出现非特异性扩增带，导致假阳性，
甚至有时只出现很亮的涂抹状弥散带。本试验中采用
MBI公司的 Taq DNA聚合酶(1 U/μL)，在 25 μL反
应体系中，Taq DNA聚合酶用量选取了 0.5 U、0.8 U、
1.0 U、1.5 U、2.0 U 5个梯度。由图 5可见，随着 Taq
DNA聚合酶浓度的增高，条带亮度增强，用量为
0.5 U和 0.8 U时，扩增产物较少，条带暗，在 1.00 U
和 1.50 U时均能扩增出清晰稳定且丰富的条带，但
用量增加到 2.00 U，出现很亮的非特异性扩增涂抹
状条带，显示酶量过多。故结合经济角度考虑，选择
Taq DNA聚合酶 1.00 U (25 μL体系)为最优浓度。
1.6两种凝胶电泳检测结果的比较
本试验选用 1770 (♂)和 Backlimn雌性后代(♀)
的雌雄基因组 DNA池为模板 DNA，用 16对 SRAP
图 5不同 Taq DNA聚合酶浓度的 SRAP反应结果
注: 1~5: Taq DNA聚合酶浓度分别为 0.5 U, 0.8 U, 1.0 U, 1.5 U,
2.0 U; M: DL2000 marker
Figure 5 The result of SRAP with different Taq DNA polymerase
concentrations
Note: 1~5: Taq DNA polymerase concentrations was 0.5 U, 0.8 U,
1.0 U, 1.5 U, 2.0 U, respectively; M: DL2000 marker
1.3 dNTPs浓度对 PCR扩增的影响
dNTPs是 PCR扩增反应的原料，dNTPs浓度过
高，会导致聚合酶错误的掺入引起碱基错配，降低
PCR扩增的忠实性，浓度过低，又会影响合成效率，
甚至会因 dNTPs过早的消耗完而使产物单链化而影
响扩增效果。本试验比较了不同的 dNTPs 浓度对
PCR结果的影响(图 3)，结果发现：当 dNTPs浓度在
0.1 mmol/L时扩增产物谱带很弱，在 0.2 mmol/L时扩
增效果较好，随着 dNTPs浓度的增加至 0.3 mmol/L、
0.4 mmol/L和 0.5 mmol/L时，扩增的条带均清晰丰
富。考虑到 dNTPs浓度过高会引起碱基错配，故选择
0.3 mmol/L为最优浓度。
1.4引物浓度对 PCR扩增的影响
引物在退火时与模板 DNA结合，启动 DNA的
扩增，它是 PCR特异性反应的关键，当引物浓度较
低时，引物与模板结合效率低，产生的多态性带少；
随着引物浓度的增加，产生的多态性带也会增加，但
过高的引物浓度易导致引物二聚体的形成和非特异
性带的扩增，影响靶序列的产量。本试验 25 μL反应
体系中，上、下游引物浓度相同，单侧引物浓度选取
0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L 和
0.5 μmol/L 5 个梯度。当正反引物各为 0.1 μmol/L
时扩增条带较少，随着引物量的增加，扩增条带渐清
晰稳定且丰富，0.2 μmol/L、0.3 μmol/L、0.4 μmol/L、
0.5 μmol/L扩增结果相差不大，但 0.2 μmol/L条带
和背景最清晰(图 4)，考虑到引物量过大易形成引物
二聚体，并节约引物用量，正反引物各用 0.2 μmol/L
(25 μL体系)为佳。
1.5 Taq DNA聚合酶的用量对 PCR扩增的影响
Taq DNA聚合酶浓度和质量受反应体积、酶活
图 4不同引物浓度的 SRAP反应的结果
注: 1~5:引物浓度分别为 0.1 μmol/L, 0.2 μmol/L, 0.3 μmol/L,
0.4 μmol/L, 0.5 μmol/L; M: DL2000 marker
Figure 4 The result of SRAP with different primer concentrations
Note: 1~5: Primer concentration were 0.1 μmol/L, 0.2 μmol/L,
0.3 μmol/L, 0.4 μmol/L, 0.5 μmol/L, respectively; M: DL2000
marker
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.008.000612614
引物 me1~16+em1进行 PCR扩增，对其产物分别用
2%的琼脂糖凝胶电泳和 6%的变性聚丙烯酰胺凝胶
电泳进行检测(图 6;图 7)。
从检测结果可以看出，在 2%琼脂糖凝胶电泳检
测中，清晰可辨的谱带数平均为 5~8条，检出的谱带
数相对较少，许多大小相近的谱带整体迁移，无法分
辨，又浓又亮，常常导致谱带明暗不一；而在 6%变性
的聚丙烯酰胺凝胶电泳检测中，清晰可辨的谱带数
平均为 10~12条，谱带丰富，可以检测出在琼脂糖电
泳中几乎看不见的差异条带。可见，变性聚丙烯酰胺
凝胶电泳在检测扩增产物多态性和分离微小差异片
断方面优于琼脂糖凝胶电泳，其分辨率高，多态信息
量大。所以，SRAP的扩增产物用变性聚丙烯酰胺凝
胶电泳检测结果更准确。
1.7 SRAP的引物筛选
16对不同的引物均能扩增出清晰且重复性好的
谱带，表明建立的芦笋 SRAP优化反应体系是稳定
可靠的。以超雄株 1770的雄性 DNA池和 Backlimn
雌性 DNA池为 DNA模板，采用优化的 SRAP反应
图 6 2%琼脂糖凝胶电泳的检测结果
注 : 1~16: 1770 雄性 DNA 池用 me1~16+em1 扩增的结果 ; 1~16: Backlimn 雌性 DNA 池用 me1~16+em1 扩增的结果 ; M:
DL5000 marker
Figure 6 The result of 2% agarose gels detction
Note: 1~16: The SRAP profile of male DNA pools of 1770 with different primer pairs, me1~16+em1, respectively; 1~16 : The SRAP
profile of female DNA pools of Backlimn with different primers pair, me1~16+em1, respectively; M: DL5000 marker
体系对本试验中共 256对 SRAP引物组合进行 PCR
扩增，检测，结果表明：所有 SRAP引物组合对均能扩
增出条带，能扩出条带丰富清晰的引物对占 93.36%，
说明 SRAP标记适用性强，使用方便；在超雄株 1770
和 Backlimn 雌雄 DNA池间共筛选出 30 对有多态
性引物组合，41条多态性片段，本试验中 SRAP标记
多态率约 11.72%，多态性高(表 1)。至于这些多态性
片段是否真的与芦笋性别决定基因连锁，有待后续
群体验证。
2讨论
本研究对影响芦笋 SRAP扩增结果的模板 DNA、
Mg2+、dNTPs、引物、Taq DNA聚合酶浓度进行了不同
梯度实验，筛选优化，建立了芦笋 SRAP最佳反应体
系为：25 μL的反应体系中，模板 DNA量 80 ng、Mg2+
浓度 3.0 mmol/L、上下游引物各 0.2 μmol/L、dNTPs
0.3 mmol/L、Taq DNA聚合酶 1 U以及 1×Buffer。进
而利用该体系筛选出一批图谱重复性好、带型清晰、
稳定性强的 SRAP引物对。同时比较了两种凝胶电
图 7 6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的检测结果
注 : 1~16: 1770 雄性 DNA 池用 me1~16+em1 扩增的结果 ; 1~16: Backlimn 雌性 DNA 池用 me1~16+em1 扩增的结果 ; M:
DL2000 marker,变性
Figure 7 The result of 6% denaturing polyacylamide gels detction
Note: 1~16: The SRAP profile of male DNA pools of 1770 with different primer pairs, me1~16+em1, respectively; 1~16 : The SRAP
profile of female DNA pools of Backlimn with different primers pair, me1~16+em1, respectively; M: DL2000 marker, denatured
芦笋 SRAP反应体系优化及引物筛选
Optimization of SRAP Reaction System and Selection of Primers for Asparagus officinalis L. 615
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
泳检测 SRAP-PCR产物的效果，发现选用 6%的变性
聚丙烯酰胺凝胶电泳效果更好。研究结果表明，该优
化体系能够很好的满足芦笋 SRAP扩增以及后续实
验的要求。
影响 SRAP 扩增效果的技术环节主要包括
DNA的提取、扩增程序、扩增体系和扩增产物的检测
(张大伟等, 2008)。研究实践中发现，SRAP对 DNA质
量要求比较高，甚于 ISSR，它要求模板 DNA完整性
高，样品间相对一致，特别是需要用 RNase消化以除
去 RNA，不同于 SSR、SCAR和 STS等分子标记，较
多的 RNA存在会严重影响 SRAP的扩增，这可能是
由于 SRAP扩增位点多，且针对 ORFs进行扩增，而
RNA与 ORFs相似程度较高，存在干扰的缘故。目前，
SRAP扩增程序绝大数都是采用 Li和 Quiros (2001)
所提出的复性变温法，效果较好，但本研究为了提高
750~1 000 bp等范围的大片段稳定扩出，适当延长了
延伸时间，这与大白菜(徐莹莹等, 2008)相同。
SRAP既然也是一种基于 PCR的标记类型，扩
增体系中的模板 DNA 、Mg2+、dNTPs、引物、Taq
DNA聚合酶等组分的用量会影响其扩增结果，这些
组分作为 SRAP扩增的原料或催化剂，有一个相对
适宜的用量范围。本研究中 SRAP优化体系中各组
分的用量与芝麻(车卓等, 2008)、石斛属植物(樊洪
泓等, 2008)、狗牙根(王志勇等, 2008)、黄瓜(柴丹丹
等, 2008)、荔枝(昝逢刚等, 2009)等植物的用量都有
所不同，这可能是由于不同植物的基因组大小，所提
取的基因组 DNA中的杂质成分数量不同，以及所用
仪器、试剂产地不同等所致。SRAP扩增产物的检测，
可以用琼脂糖凝胶电泳检测，浓度低时分辨率差，浓
度过高(＞4%)，分离的片段范围小，电泳时间长，带型
不好看，一般使用 2%的琼脂糖效果较好；也可以用
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，其精确性和分辨率远远
高于琼脂糖凝胶电泳。本试验比较了两种凝胶电泳
检测 SRAP-PCR产物的效果，发现选用 6%的变性聚
丙烯酰胺凝胶电泳效果更好，但琼脂糖凝胶电泳操
作简单方便，成本低，在实践中二者可以结合使用，
先用琼脂糖凝胶电泳抽样检测，PCR产物质量高，然
后再用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。
目前，本课题组正在利用本试验中所优化的
SRAP扩增检测体系开展芦笋种质资源遗传多样性，
以及与芦笋性别决定基因紧密连锁的 DNA分子标
记筛选转化等研究，获得了较好的研究结果。
3材料与方法
3.1试验材料
本试验选用芦笋品种 Backlimn和 1770为供试
表 1筛选出的 SRAP引物组合
Table 1 Selection of SRAP primer combinations
正向引物
Forward
primers
Me1
Me2
Me3
Me4
Me5
Me6
Me7
Me8
Me9
Me10
Me11
Me12
Me13
Me14
Me15
Me16
em1
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注:√为条带清晰的引物;-为条带模糊的引物; *为条带清晰且具多态性的引物
Note: √ mean the primers with distinct and abundant bands; -mean the primers with blurry bands; * mean the primers with distinct
and polymorphism bands
反向引物
Reverse primers
www.molplantbreed.org
DOI: 10.3969/mpb.008.000612616
材料，种植于江西省农业科学院芦笋资源圃。
3.2试验试剂
Taq DNA聚合酶、dNTPs、DNA Marker等分别购
自 MBI、BBI、明日百傲等公司，SRAP引物根据 Li
等(Li and Quiros, 2001)提出的原则设计合成，由上海
生工生物工程技术服务有限公司合成,具体序列见
表 2，优化试验选用 me2~em4组合。
3.3 DNA提取
称取新鲜幼嫩的芦笋拟叶 4~6 g，置于预冷的研钵
中，加入适量的液氮，迅速研磨至组织破碎转入 50mL
的离心管中，加入 15mL提取液(2%CTAB,100mmol/L
Tris-HCl, pH 8.0, 20 mmol/L EDTA, pH 8.0, 1.4 mol/L
NaCl, 0.1% 2-mercapthoethanol)，65℃水浴 40~60min，
中途轻轻混匀几次；水浴后冷却至室温，加入等体积
氯仿:异戊醇(24:1)，轻轻上下颠倒充分混匀，室温静
置 10 min；13 000 r/min离心 10 min，取上清液，重复
氯仿 /异戊醇抽提一次；于上清液中加入 2/3倍体积
的冰冷异丙醇，小心混匀至 DNA形成絮状，-20℃冰
箱静置 10~20 min；4℃12 000 r/min 离心 10 min，沉
淀 DNA；弃上清，用 75%乙醇洗 2~3次，用滤纸条吸
干残留乙醇，在超净工作台内无菌风干，DNA溶于
200μL超纯水；加入 2μLRNase溶液 56℃水浴 2 h；
1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA完整性与纯度，根据
样品 OD260/OD280分析纯度，并计算样品 DNA浓度，
作为母液 4℃保存备用。
3.4 SRAP-PCR基本反应体系
PCR反应体系为 25 μL：10×扩增缓冲液 2.5 μL；
MgC12 (25mmol/L) 2.5μL；dNTPs (10mmol/L) 2.0 μL；
引物(5 μmol/L) 2.0 μL，模板 DNA (20~200 ng/μL)
2 μL；Taq DNA聚合酶(1 U/μL)1 μL；加入 ddH2O补
齐到 25 μL。
3.5反应体系的优化
在基本反应体系中分别调整模板 DNA、Mg2+、
dNTPs 和引物、Taq DNA 聚合酶各因子的用量，进
行单因子多水平试验。其中，模板 DNA的用量分别
设为 20 ng、50 ng、80 ng、100 ng、120 ng和 200 ng；Mg2+
浓度分别设为 1.0 mmol/L、1.5 mmol/L、2. 0 mmol/L、
2.5mmol/L、3.0mmol/L和 3.5mmol/L；dNTP浓度分别
设为 0.1 mmol/L、0.2 mmol/L、0.3 mmol/L、0.4 mmol/L
和 0.5 mmol/L；
引物的用量分别设为 0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、
0.3 μmol/L、0.4 μmol/L和 0.5 μmol/L，Taq DNA聚合
酶的用量分别设为 0.5 U、0.8 U、1.0 U、1.5 U和 2.0 U。
DNA用量优化时，其它因素采用 3.4 SRAP-PCR基
本反应体系所用剂量；Mg2+ 浓度优化时，DNA 为
80 ng, 其它因素采用 3.4中的所用剂量；dNTPs浓度
优化时，DNA为 80 ng, Mg2+为 3.0 mmol/L，其它因
素采用 3.4中的所用剂量；引物浓度优化时，DNA为
80 ng, Mg2+为 3.0 mmol/L, dNTPs为 0.3 mmol/L，其它
因素采用剂量见 3.4；Taq DNA聚合酶优化时，DNA
为 80 ng，Mg2+为 3.0 mmol/L，dNTPs为 0.3 mmol/L，
表 2 SRAP所用引物序列
Table 2 Primers sequence were used in SRAP analysis
正向引物
Forward primers
me1
me2
me3
me4
me5
me6
me7
me8
me9
me10
me11
me12
me13
me14
me15
me16
序列
Sequence
5-TGAGTCCAAACCGGATA-3
5-TGAGTCCAAACCGGAGC-3
5-TGAGTCCAAACCGGAAT-3
5-TGAGTCCAAACCGGACC-3
5-TGAGTCCAAACCGGAAG-3
5-TGAGTCCAAACCGGACA-3
5-TGAGTCCAAACCGGACG-3
5-TGAGTCCAAACCGGACT-3
5-TGAGTCCAAACCGGAGG-3
5-TGAGTCCAAACCGGAAA-3
5-TGAGTCCAAACCGGAAC-3
5-TGAGTCCAAACCGGAGA-3
5-TGAGTCCAAACCGGAAG-3
5-TGAGTCCAAACCGGTTA-3
5-TGAGTCCAAACCGGTCC-3
5-TGAGTCCAAACCGGTGC-3
反向引物
Reverse primers
em1
em2
em3
em4
em5
em6
em7
em8
em9
em10
em11
em12
em13
em14
em15
em16
序列
Sequence
5-GACTGCGTACGAATTAAT-3
5-GACTGCGTACGAATTTGC-3
5-GACTGCGTACGAATTGAC-3
5-GACTGCGTACGAATTTGA-3
5-GACTGCGTACGAATTAAC-3
5-GACTGCGTACGAATTGCA-3
5-GACTGCGTACGAATTCAA-3
5-GACTGCGTACGAATTCAC-3
5-GACTGCGTACGAATTCAG-3
5-GACTGCGTACGAATTCAT-3
5-GACTGCGTACGAATTCTA-3
5-GACTGCGTACGAATTCTC-3
5-GACTGCGTACGAATTCTG-3
5-GACTGCGTACGAATTCTT-3
5-GACTGCGTACGAATTCAT-3
5-GACTGCGTACGAATTGTC-3
芦笋 SRAP反应体系优化及引物筛选
Optimization of SRAP Reaction System and Selection of Primers for Asparagus officinalis L. 617
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
正反引物各为 0.2 μmol/L。
3.6 SRAP-PCR反应程序
94℃预变性 3 min；反应前 5个循环为 94℃变性
30 s、35℃复性 30 s、72℃延伸 1.5 min；随后的 35个
循环退火温度提高到 50℃，最后 72℃延伸 10 min。
PCR仪为日本 PC-802。
3.7 PCR产物的检测
SRAP扩增产物分别采用 2%琼脂糖凝胶电泳和
6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测分析，2%琼脂糖凝
胶电泳用 0.5×TBE电泳缓冲液，在恒定 200 V电压
下电泳 40 min，最后在紫外成像系统中照相并记录
分析；6%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳在恒压 2 000 V
下电泳 2~3 h，银染后用数码相机拍照并记录分析。
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