全 文 ：　２０１４，４０（４）：８４－８８　 Ｐｌａｎｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ
收稿日期：　２０１３－０９－２４　　　修订日期：　２０１３－１１－１５
基金项目：　科技部农业科技成果转化资金项目（２０１０ＧＢ２４３２０６１５）
＊ 通信作者 Ｔｅｌ：０１０－６２８８９５２９；Ｅ－ｍａｉｌ：ｎｅｍａ＠ｃａｆ．ａｃ．ｃｎ
四川省茂县花椒根结线虫病病原鉴定
王曦茁１，　汪来发１＊，　杨佐忠２，　刘子雄２，　余明忠３
（１．中国林业科学研究院森林生态与保护研究所，国家林业局森林保护学重点实验室，北京　１０００９１；
２．四川省森林病虫害防治检疫站，成都　６１００８１；３．四川省茂县林业局，茂县　６２３２００）
摘要　为明确四川省茂县花椒根结线虫的种类，通过根结线虫雌虫和２龄幼虫的形态特征及雌成虫的会阴花纹、雌
虫酯酶同工酶及分子生物学检测（ｒＤＮＡ－ＩＴＳ区和ｒＲＮＡ－ＩＧＳ区），对花椒根结线虫进行了种类鉴定。三种方法的
结果均表明在茂县地区花椒上发现的根结线虫为北方根结线虫（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ　ｈａｐｌａ），这是我国首次报道在花椒上
发现北方根结线虫病，四川省是北方根结线虫新的分布区。
关键词　北方根结线虫；　鉴定；　花椒
中图分类号：　Ｓ　４３５．７３　　文献标识码：　Ａ　　ＤＯＩ：　１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．０５２９－１５４２．２０１４．０４．０１６
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｒｏｏｔ－ｋｎｏｔ　ｎｅｍａｔｏｄｅ　ｏｎ　ｐｅｐｐｅｒ　ｉｎ
Ｍａｏ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ
Ｗａｎｇ　Ｘｉｚｈｕｏ１，　Ｗａｎｇ　Ｌａｉｆａ１，　Ｙａｎｇ　Ｚｕｏｚｈｏｎｇ２，　Ｌｉｕ　Ｚｉｘｉｏｎｇ２，　Ｙｕ　Ｍｉｎｇｚｈｏｎｇ３
（１．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｓｔａｔｅ　Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｒｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｅｃｏｌｏｇｙ，Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ
ａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ＣＡＦ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００９１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｓｔａｔｉｏｎ　ｆｏｒ　Ｆｏｒｅｓｔ　Ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　Ｐｅｓｔ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ａｎｄ　Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ
ｏｆ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈｅｎｇｄｕ　６１００８１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｆｏｒｅｓｔｒｙ　Ｂｕｒｅａｕ　ｏｆ　Ｍａｏ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ｓｉｃｈｕａｎ　６２３２００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｔｏ　ｃｏｎｆｉｒｍ　ｔｈｅ　ｎｅｍａｔｏｄｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｏｂｓｅｒｖｅｄ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｐｅｐｐｅｒ　Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍｉｎ　Ｍａｏ　Ｃｏｕｎｔｙ，Ｓｉ－
ｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，ａｎ　ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ　ｗａｓ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｒｅｇｉｏｎ　ｆｒｏｍ　Ａｐｒｉｌ　ｔｏ　Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ　ｉｎ　２０１１．Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｉｃａｌ
ｔｅｓｔ（ｐｅｒｉｎｅａｌ　ｐａｔｔｅｒｎｓ　ａｎｄ　ｓｅｃｏｎｄ－ｓｔａｇｅ　ｊｕｖｅｎｉｌｅｓ），ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　ｓｔｕｄｙ（ｅｓｔｅｒａｓｅ　ｉｓｏｚｙｍｅ）ａｎｄ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｃｈａｒａｃｔｅｒ－
ｉｚａｔｉｏｎ（ｒＤＮＡ－ＩＴＳ　ａｎｄ　ｒＤＮＡ－ＩＧＳ）ｗｅｒｅ　ｕｓｅｄ　ｔｏ　ｉｄｅｎｔｉｆｙ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｈｅ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｅｐｐｅｒ　ｒｏｏｔ－
ｋｎｏｔ　ｎｅｍａｔｏｄｅ　ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ　ｈａｐｌａ　Ｃｈｉｔｗｏｏｄ．Ｔｈｉｓ　ｉｓ　ｔｈｅ　ｆｉｒｓｔ　ｒｅｐｏｒｔ　ｏｆ　Ｍ．ｈａｐｌａ　ｏｎ　Ｚ．ｂｕｎｇｅａｎｕｍ
ｉｎ　Ｃｈｉｎａ　ａｎｄ　ｉｔｓ　ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ　ｉｎ　Ｓｉｃｈｕａｎ　Ｐｒｏｖｉｎｃｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ　Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ　ｈａｐｌａ；　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ；　Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ
　　花椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ　ｂｕｎｇｅａｎｕｍ　Ｍａｘｉｍ）为芸
香科花椒属落叶小乔木或灌木，原产于我国，是重要
的木本油料和香料树种，因适应性强，分布广和收益
大，深受群众欢迎［１］。我国自１９９９年实行退耕还林
工程以来，四川省在退耕地大力种植花椒，目前已成
为许多地区农业支柱产业和高半山农民增收致富的
主要途径之一。２００５年以来，四川阿坝州茂县部分
乡镇的花椒幼树植株矮小，叶片发黄、失绿，生长缓
慢，最后植株枯死，严重地块死亡率达到３０％～
５０％。花椒根及根尖处形成许多小米粒或绿豆粒大
小形状不规则的根结，随后侧根也出现大小不等、表
面粗糙的形状不规则根结，表面为褐色至深褐色，根
结表面又长出许多细的分枝须根，单株根结有的多
达百个以上，主要分布在０～３０ｃｍ土层。剖开根结
见有白色梨形雌虫，即花椒树感染了根结线虫。我
国学者虽对花椒病害进行了广泛的研究［２］，仅有一
位学者提及花椒苗感染南方根结线虫［Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ
ｉｎｃｏｇｎｉｔａ （Ｋｏｆｏｉｄ　＆ Ｗｈｉｔｅ）Ｃｈｉｔｗｏｏｄ］［３］，至今未
见花椒根结线虫病的详细报道。随着经济发展，作
为茂县的支柱产业，茂县的花椒栽植面积在不断扩
大，根结线虫病造成的经济损失也在逐年增加，为了
明确茂县花椒根结线虫病的病原种类，在２０１１年４
月－９月间，笔者采集四川茂县影响严重的花椒根
结线虫样品，通过花椒根结线虫形态观察测量、雌成
４０卷第４期 王曦茁等：四川省茂县花椒根结线虫病病原鉴定
虫会阴花纹、同工酶的酯酶谱带特征和分子生物学
特征分析，明确了该县花椒根结线虫病的病原种类，
现将结果报道如下。
１　材料与方法
１．１　花椒根结线虫的采集
在四川省茂县白溪乡和叠溪镇花椒种植区采
集感病花椒样品，使用随机取样法，采集长有根结
的根及其周围的病土，病土采自土壤表层５～
３０ｃｍ处，每个地块随机采５个点，混匀后放入同一
个采集袋内，做好标记。将采集的标样带回实验
室，以单卵块接种在灭菌土中培养的刚长出两片真
叶的易感病番茄幼苗的土中，培养２个月，用于后
期鉴定［４］。
１．２　花椒根结线虫的获得
雌虫的分离和收集：单卵块繁殖６０ｄ后，取被侵
染的番茄根，在体视显微镜下将根结表皮用镊子或针
尖轻轻拨开，剖面上乳白色的光滑球状物即为根结线
虫的雌虫，用解剖针轻轻拨出，放入水中待用。
２龄幼虫的收集：单卵块繁殖６０ｄ后，采集被侵
染的番茄根清水洗净，剪成３ｃｍ小段，装入５００ｍＬ
三角瓶中，配制体积分数１％次氯酸钠溶液，在上述
三角瓶中倒入２００～３００ｍＬ次氯酸钠溶液，封口后
猛摇３ｍｉｎ，立即用蒸馏水冲洗数次，先后过２００目
和５００目筛，用蒸馏水反复冲洗留在５００目筛子上
的卵，最后用无菌水冲洗收集于无菌的小烧杯中。
将上述卵放于２６℃无菌培养箱中孵化３ｄ，得到根
结线虫的２龄幼虫。
１．３　形态学鉴定
１．３．１　雌虫主要形态特征观察测量
观察头部特征、口针特征等。测量２０条线虫体
长、最大体宽、口针长和ＤＥＧＯ（背食道腺开口至口
针基部球的距离）等形态指标。
１．３．２　２龄幼虫主要形态特征观察测量
观察头部特征、尾部特征等。共观测２０条线
虫。主要测计的指标为体长、最大体宽、口针长、
ＤＥＧＯ和尾长。
１．３．３　雌虫会阴花纹的制作和观察
在体视显微镜下解剖根结，挑取成熟雌虫２０
条。将雌虫移入硬塑料板上的一滴体积分数４５％
乳酸中，用解剖刀切取下尾端（虫体后部约１／４
处），将尾端的体内组织去掉，切除尾端表皮多余的
部分，仅留下会阴花纹部分。将会阴花纹转移至一
块载玻片上的纯甘油滴中，一个玻片上放１０块会
阴花纹，以ＡＦＧ液为浮载剂，用树脂封片，制成永
久玻片。在显微镜下观察会阴花纹的形态特征并
拍照。
１．４　同工酶分析
取５μＬ浸提液（２０％蔗糖＋２％ＴｒｉｔｏｎＸ－１００）
移至自制研磨管中，解剖镜下分离一个刚开始产卵
的雌虫，转入管内浸提液中，用自制的圆头磨面小玻
璃棒充分研磨，补加１０μＬ浸提液。至－２０℃冷冻
保存。参考 Ｅｓｂｅｎｓｈａｄｅ和 Ｔｒｉａｎｔａｐｈｙｌｏｕ等的方
法应用垂直板聚丙烯凝胶电泳做酯酶分析［５］。聚丙
烯酰胺浓度分别为２．５％和７．５％。凝胶板大小为
１５０ｍｍ×１２０ｍｍ，凝胶厚度１．５ｍｍ，电极缓冲液
是ｐＨ　８．３的 Ｔｒｉｓ－盐酸缓冲液。每孔加样量为
２０μＬ（含浓度为１ｍｇ／ｍＬ溴酚蓝溶液），电泳前
３０ｍｉｎ电压设在８０Ｖ，之后将其稳定在１９０Ｖ，电
泳进行约２ｈ，直到溴酚蓝指示条带迁移距离达到
１０ｃｍ。酯酶染色参照胡凯基方法［６］。显色完全后
蒸馏水漂洗３次，在固定液（１０％醋酸＋１０％甘油）
中固定３ｈ以上，酯酶表型的命名参照Ｅｓｂｅｎｓｈａｄｅ
和Ｔｒｉａｎｔａｐｈｙｌｏｕ等［５］的标准，以已鉴定的北方根
结线虫（Ｍ．ｈａｐｌａ）样本（中国农业大学贾克功教授
提供）作为参照系判读酯酶谱型，初步确定根结线虫
的种类，每个样品做３个重复。
１．５　分子生物学鉴定
１．５．１　根结线虫ＤＮＡ提取
在解剖镜下从组织内挑取１头雌虫置于载玻片
上，无菌水冲洗３次，滴１０μＬ预冷的线虫裂解液
（１０ｍｍｏｌ／Ｌ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ　ｐＨ　８．０，１ｍｍｏｌ／Ｌ　ＥＤＴＡ
ｐＨ　８．０，０．２５ｍｏｌ／Ｌ　ＮａＣｌ，１％ＳＤＳ）在虫体上，用
枪头压碎后从载玻片上吸取尽可能多含线虫物质的
裂解液放入预先装有１０μＬ无菌水的离心管中，加
入２μＬ的１ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ并快速加入液氮中冷
冻１０ｍｉｎ，６５℃水浴１ｈ，９５℃水浴１０ｍｉｎ使蛋白
酶Ｋ变性，产物直接用于ＰＣＲ扩增或者－２０℃保
存备用。
１．５．２　ＰＣＲ扩增
ｒＤＮＡ－ＩＴＳ区扩增采用的通用引物为 Ｖ５３６７
（５′－ＴＴＧ　ＡＴＴ　ＡＣＧ　ＴＣＣ　ＣＴＧ　ＣＣＣ　ＴＴＴ－３′）和
２６Ｓ（５′－ＴＴＴ　ＣＡＣ　ＴＣＧ　ＣＣＧ　ＴＴＡ　ＣＴＡ　ＡＧＧ－
３′）［７］；ｒＤＮＡ－ＩＧＳ区扩增采用的通用引物为５Ｓ（５′－
·５８·
２０１４
ＴＴＡ　ＡＣＴ　ＴＧＣ　ＣＡＧ　ＡＴＣ　ＧＧＡ　ＣＧ－３′）和１８Ｓ（５′－
ＴＣＴ　ＡＡＴ　ＧＡＧ　ＣＣＧ　ＴＡＣ　ＧＣ－３′）［８］。引物由北
京赛百盛基因技术有限公司合成。
ＰＣＲ体系（２５μＬ）包括模板 ＤＮＡ　４μＬ，１０×
ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ（Ｍｇ２＋）２．５μＬ，ｄＮＴＰｓ（２．５ｍｍｏｌ／Ｌ）
２μＬ，上 游 引 物 （１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，下 游 引 物
（１０μｍｏｌ／Ｌ）１μＬ，Ｔａｑ　ＤＮＡ 聚 合 酶 （５Ｕ／μＬ）
０．２μＬ，加 Ｈ２Ｏ至２５μＬ。ｒＤＮＡ－ＩＴＳ区反应条件
为：９４℃预变性４ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５５℃３０ｓ，７２℃
１ｍｉｎ，循环３５次；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃保存。ＩＧＳ
区反应条件为：９４℃预变性３ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５３℃
３０ｓ，７２℃９０ｓ，循环４５次；７２℃延伸１０ｍｉｎ，４℃
保存。取５μＬ　ＰＣＲ产物采用１．２％琼脂糖凝胶
１２０Ｖ电泳３０ｍｉｎ进行检测。
１．５．３　ＰＣＲ产物的回收
ＰＣＲ产物由ＤＮＡ胶回收试剂盒（ＴａＫａＲａ）回
收、纯化，具体操作步骤参照试剂盒操作说明。
１．５．４　ＰＣＲ产物的克隆、测序及数据分析
将纯化后的ＰＣＲ产物克隆至质粒载体ｐＭＤ１８－
Ｔ（ＴａＫａＲａ）上，选取每种群各３个阳性克隆由Ｉｎ－
ｖｉｔｒｏｇｅｎ公司测序。利用 ＮＣＢＩ　ＢＬＡＳＴ 工具和
ＤＮＡＭＡＮ　５．０软件，将获得的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ区和ｒＤ－
ＮＡ－ＩＧＳ区序列与ＧｅｎＢａｎｋ已登录的根结线虫序列
进行比对分析。利用 Ｍｅｇａ５．０软件通过最大似然
法（ｍａｘｉｍｕｍ　ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）构建系统发育树，采用
Ｋｉｍｕｒａ　ｔｗｏ－ｐａｒａｍｅｔｅｒ模型。同时对构建的系统树
作自展检验（ｂｏｏｔｓｔｒａｐ　ｔｅｓｔ）以获得分支的支持率，自
展检验中重复抽样次数为１０００次，以秀丽隐杆线虫
（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ　ｅｌｅｇａｎｓ）（Ｘ０３６８０）的ＩＴＳ和ＩＧＳ序
列作为外群。
２　结果与分析
２．１　根结线虫形态学鉴定
雌虫：体白色，梨形，颈短，头区大，无环纹，口
针纤细，基球圆形和杆部有明显界线。锥部向背部
稍稍弯曲，杆部末端最宽。
２龄幼虫：蠕虫状，头不突出，无缢缩，口针基部
球圆形。尾部有明显透明区，尖端狭窄。
通过对会阴花纹观察，会阴花纹为近圆的六边
形到卵圆形，背弓扁平或波浪形，侧线不明显，线纹
平滑到波浪形，尾端区通常有刻点（图１）。
雌虫和２龄幼虫的部分测量值见表１。参照文
献［９－１０］，初步确定花椒根结线虫为北方根结线虫（Ｍ．
ｈａｐｌａ）。
图１　花椒根结线虫的会阴花纹
Ｆｉｇ．１　Ｔｈｅ　ｐｅｒｉｎｅａｌ　ｐａｔｔｅｒｎ　ｏｆ　ｔｈｅ
ｐｅｐｐｅｒ　ｒｏｏｔ－ｋｎｏｔ　ｎｅｍａｔｏｄｅ
表１　花椒根结线虫雌虫和２龄幼虫的测量值１）
Ｔａｂｌｅ　１　Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ｆｅｍａｌｅｓ　ａｎｄ　ｓｅｃｏｎｄ－ｓｔａｇｅ　ｊｕｖｅｎｉｌｅｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｐｐｅｒ　ｒｏｏｔ－ｋｎｏｔ　ｎｅｍａｔｏｄｅ
虫态Ｓｔａｇｅ　 Ｌ／μｍ　 ＢＷ／μｍ　 Ｓｔｙｌｅｔ／μｍ　 ＤＥＧＯ　 Ｔａｉｌ／μｍ
雌虫Ｆｅｍａｌｅ（ｎ＝２０） ５９２．６（４４９．２～７３０．７）３８０．０（３４０．７～４２０．９）１６．４（１５．２～１６．５） ４．８（４．５～６．１） —
２龄幼虫
Ｓｅｃｏｎｄ－ｓｔａｇｅ　ｊｕｖｅｎｉｌｅ（ｎ＝２０）
３９５．８（３８９．０～４１２．２） １４．１（１３．７～１４．６） １１．１（１０．８～１２．０） ３．４（３．０～４．１） ５３．０（４６．５～５８．０）
　１）Ｌ：体长Ｂｏｄｙ　ｌｅｎｇｔｈ；ＢＷ：体宽Ｂｏｄｙ　ｗｉｄｔｈ；Ｓｔｙｌｅｔ：口针长Ｓｔｙｌｅｔ　ｌｅｎｇｔｈ；ＤＥＧＯ：背食道腺开口至口针基部球的距离Ｄｏｒｓａｌ　ｅｓｏｐｈａｇｅａｌ
ｇｌａｎｄ　ｏｐｅｎｉｎｇ；Ｔａｉｌ：尾长Ｔａｉｌ　ｌｅｎｇｔｈ．
２．２　酯酶同工酶酶谱
将分离纯化的根结线虫种群进行同工酶分析，
电泳结果显示分离纯化的种群根结线虫雌成虫的酯
酶同工酶谱均出现一条酯酶带，酯酶谱带类型为
Ｈ１，迁移率为０．５（图２），这与已知的北方根结线虫
酯酶同工酶谱相同［５］，因此可以断定侵染花椒的根
结线虫为北方根结线虫单一种群（Ｍ．ｈａｐｌａ）。
２．３　分子生物学特征
２．３．１　ＰＣＲ扩增及重组质粒ＤＮＡ酶切鉴定
通过通用引物对花椒根结线虫的ｒＤＮＡ－ＩＴＳ区和
ｒＤＮＡ－ＩＧＳ区进行ＰＣＲ扩增，片段长度在７７０ｂｐ左右
（图３），同北方根结线虫的序列长度基本一致。重组质
粒经酶切后都得到１个目的片段大小相似的片段（图
３），这说明质粒为目的片段ＰＣＲ扩增产物的重组克隆。
·６８·
４０卷第４期 王曦茁等：四川省茂县花椒根结线虫病病原鉴定
图２　花椒根结线虫酯酶电泳谱型
Ｆｉｇ．２　Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　ｏｆ　ｅｓｔｅｒａｓｅ　ｉｓｏｚｙｍｅ
（Ｅｓｔ）ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｐｐｅｒ　ｒｏｏｔ－ｋｎｏｔ　ｎｅｍａｔｏｄｅ
图３　花椒根结线虫ＩＴＳ区和ＩＧＳ区的ＰＣＲ扩增
及产物重组质粒的酶切鉴定结果
Ｆｉｇ．３　Ｔｈｅ　ＰＣＲ　ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｒｅｓｕｌｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｐｅｐｐｅｒ
ｒｏｏｔ－ｋｎｏｔ　ｎｅｍａｔｏｄｅ　ＩＴＳ　ａｎｄ　ＩＧＳ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
２．３．２　序列分析及同源性结果比较
测序结果表明，ｒＤＮＡ－ＩＴＳ区目的片段长度为
７６８ｂｐ，其 中 ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２ 区 序 列 长 度 为
４７７ｂｐ，在 ＧｅｎＢａｎｋ中进行ＢＬＡＳＴ和 ＤＮＡＭＡＮ
６．０比对分析，发现ＩＴＳ１－５．８Ｓ－ＩＴＳ２区序列与北方
根结线虫（ＡＹ２６８１０８、ＡＹ２８１８５４和ＪＸ０２４１４７）序列
只有１个碱基差异，序列相似性为９９．７９％；ｒＤＮＡ－
ＩＧＳ区目的片段长度为７６８ｂｐ，其中ＩＧＳ２区序列长
度为５６２ｂｐ，与在美国分离获得北方根结线虫 ＨＩ
种群（ＡＹ５２８４１８）只有２个碱基差异，序列相似性为
９９．６４％。将本研究中获得ＩＴＳ和ＩＧＳ序列与Ｇｅｎ－
Ｂａｎｋ中下载的已知根结线虫序列进行比对分析，用
Ｍａｘｉｍｕｍ　ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ法分别构建了系统发育树：图
４为基于ＩＴＳ序列构建的根结线虫系统发育树，花
椒根结线虫与北方根结线虫位于同一大分支，支持
率为９８％，从树的分支状况来看，４种根结线虫可分
为两组，第Ⅰ组包括所有的北方根结线虫，第Ⅱ组包
括南方根结线虫、花生根结线虫和爪哇根结线虫。
组间相隔较远，分支间的支持率大于９８％，系统发
育关系比较清晰。图５为基于ＩＧＳ序列构建的根结
线虫系统发育树，花椒根结线虫与北方根结线虫位于
同一大分支，支持率为９８％；与基于ＩＴＳ序列的系统
发育树相对应，常见的４种根结线虫也可分为两组：
第Ⅰ组包括所有的北方根结线虫，而其他３种根结线
虫全部位于Ⅱ组，组间相隔较远，两个大分支间支持率
大于９８％，北方根结线虫所在分支与南方根结线虫、
花生根结线虫和爪哇根结线虫形成的分支间系统发
育关系清晰，说明花椒根结线虫为北方根结线虫。
３　结论与讨论
由于寄主和环境等因素的影响，根结线虫种内
和种间的形态常常有较大的变化，因此，单纯依赖一
种方法鉴定很难做到快速、准确。应用ｒＤＮＡ－ＩＴＳ
和ｒＲＮＡ－ＩＧＳ克隆、序列测定分析及比对，已成功地
应用于根结线虫的鉴定［１１－１２］。本文根据花椒根结线
虫雌虫和２龄幼虫的形态特征及雌成虫的会阴花
纹，雌虫酯酶同工酶分析及分子生物学的检测（ｒＤ－
ＮＡ－ＩＴＳ区和ｒＲＮＡ－ＩＧＳ区），结果表明四川茂县地
区花椒根结线虫的病原为北方根结线虫。在鉴定
中，采用形态学、生物化学和分子生物学特征分析进
行综合鉴定的方法，从而避免了用一种方法鉴定可
能出现的误差。这是首次报道北方根结线虫引起的
花椒新病害，同时也是首次报道北方根结线虫在我
国四川省的分布。
近些年来的调查发现，花椒根结线虫病的发生
在逐步扩展，但因为其危害具有隐蔽性，还未被关注
和引起足够重视。茂县位于四川省西北部，阿坝藏
族羌族自治州的东南缘，是岷江上游的高山峡谷地
带。许多花椒栽植在退耕地及半高山坡上，海拔在
１　５００～２　０００ｍ，冬冷夏凉、昼夜温差大、７月平均温
度２０．９℃，低于北方根结线虫分布南限温度（７月
份平均温度为２６．７℃）［１３］，因此在这样的生态环境
下，北方根结线虫是可以生存的。在以前的报道中，
四川省危害植物的根结线虫为常见的南方根结线虫
·７８·
２０１４
（Ｍ．ｉｎｃｏｇｎｉｔａ）、爪哇根结线虫（Ｍ．ｊａｖａｎｉｃａ）和花
生根结线虫（Ｍ．ａｒｅｎａｒｉａ）等［１４］，未见北方根结线
虫的报道，北方根结线虫是由于苗木运输传进四川，
还是原已存在，还有待进一步的研究。
图４　根结线虫不同种群ＩＴＳ序列的聚类分析（ＮＪ）
Ｆｉｇ．４　ＮＪ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　１６　Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｉｓｏｌａｔｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＩＴＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｍ．ｈａｐｌａ
图５　根结线虫不同种群ＩＧＳ序列的聚类分析（Ｍａｘｉｍｕｍ　ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ）
Ｆｉｇ．５　Ｍａｘｉｍｕｍ　ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ　ｔｒｅｅ　ｏｆ　１２　Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅｉｓｏｌａｔｅｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ＩＧＳ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
　　根据根结线虫病害发生和流行的特点，目前花
椒根结线虫病的发生范围仍很有限，建议建立无病
种苗生产基地和进行植物检疫，发病区内种苗不得
运输或携带到非发病区种植；选用无病地块的健壮、
无病种苗；对已感病的苗木实行就地销毁；清除植株
病残体及附近杂草，控制该病的扩展蔓延。
参考文献
［１］　曾京京．我国花椒的栽培起源和地理分布［Ｊ］．中国农史，
２０００，１９（４）：６８－７５．
［２］　李笃肇．花椒苗根结线虫病的发生与防治［Ｊ］．特种经济动植
物，２００４（１２）：３３．
（下转１００页）
·８８·
２０１４
０１１对多种植物病原菌具有很好的抑菌效果，制备
的内生短短芽胞杆菌０１１可湿性粉剂，迄今文献中
未见研究报道。为下一步开发短短芽胞杆菌可湿性
粉剂的配方筛选奠定了基础。
参考文献
［１］　曾智，孙运军，钱荣华．我国微生物农药的研究应用现状与前景
［Ｊ］．农业现代化研究，２００８，２９（２）：２５４－２５６．
［２］　喻子牛．微生物农药及其产业化［Ｍ］．北京：科学出版社，２０００：
１－１２．
［３］　邹芳慧，陈志强，任卫东．面向二十一世纪的生物农药［Ｊ］．化学
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