全 文 ：牡丹花提取物清除活性氧及对·OH引发的
DNA损伤的保护作用
王　晓1 , 2　时新刚2 　郑成超1　刘建华2
1(山东农业大学生命科学学院 , 泰安 , 271018)　2(山东省科学院测试中心 ,济南 , 250014)
摘　要　利用比色法 、化学发光法 , 研究了牡丹花提取物体对 O·2-、·OH 、H2O 2 活性氧自由基的
清除作用 ,以及通过 Cu2+-Phen-H2O2-VC-DNA发光体系研究牡丹花提取物对·OH 引起的 DNA 氧
化损伤的保护作用。试验结果表明 , 牡丹花提取物对 O·2-、·OH 、H2O2 自由基均有明显的清除作
用 , 其 50 %抑制浓度(IC50)分别为 199.0、 193.18、 50.85μg/ mL , 并能保护·OH 引发的 DNA氧
化损伤。
关键词　牡丹花 , 活性氧 , DNA损伤
第一作者:博士研究生 ,副研究员(郑成超为通讯作者)。
收稿时间:2004-03-17 ,改回时间:2004-05-24
　　随着自由基医学和自由基生物学研究的深
入发展 , 人们越来越关注各种自由基对机体造
成的损伤 。活性氧自由基包括超氧阴离子 (O·2
-)、羟自由基(·OH)、多种有机氧自由基(RO
·、ROO·)、单线态氧 (1O2)、无机和有机过氧化
物(H2O2 、ROOH)等 , 它们有很强的生物活
性[ 1] 。机体中适量的自由基对于细胞的分裂 、
分化 、生长 、消炎解毒起积极的作用;而过量则
会对机体产生毒害 ,破坏生物大分子 ,影响细胞
活性 ,主要损害细胞膜包括血管内皮细胞膜及
亚微结构 ,并引起一系列有害的生化反应 。现
已明确自由基与许多病理生理现象都有密切的
关系 ,如衰老 、肿瘤 、炎症 、突变 、心脑缺血 、动脉
粥样硬化 、帕金森病等 。因此为了减轻自由基
的危害 、提高人群的生活质量 ,寻找高效 、价廉 、
低毒的阻断自由基反应的抗氧化剂已成为当今
热门的研究课题之一[ 1 ～ 3] 。牡丹(Paeonia suf-
f ruticosa Andr.)属毛茛科芍药属灌木 ,又有洛
阳花 、富贵花和“花中之王”的美称 ,在我国有着
广泛的栽培。牡丹除了其根皮(牡丹皮)是一种
重要的中药外 ,牡丹花还具有重要的药用价值 ,
具有调经活血的功效[ 4] ,含有紫云英苷[ 4] 、没
食子酸 、苯甲酸等黄酮 、多酚化合物(另文将作
详细报道)。本研究采用比色法和化学发光法
研究牡丹花提取物(PE)清除活性氧(O·2 -、
·OH 、H2O2)的作用 ,并通过 Cu2+-Phen-H2O2-
VC-DNA 发光体系研究 PE 对·OH 引起的
DNA氧化损伤的抑制作用 ,初步评价了 PE 的
抗氧化作用 ,旨在为牡丹花的深入研究与开发
应用提供科学依据。
1　材料和方法
1.1　原　料
牡丹花采于山东菏泽 ,品种为凤丹。
1.2　试　剂
槲皮素 、鲁米诺 (luminol)、VC 、小牛胸腺
DNA 、邻菲罗啉 (Phen)均为 Sigma 公司产品;
邻苯三酚(焦性没食子酸),Met , NBT , CuCl2 ,
Na2CO3 , NaHCO3 , H2O2等试剂均为国产分析
纯 。
1.3　仪　器
SHG-D 型生物化学发光测定仪 (上海上
立检测仪器厂), Delta 320 pH 计 (Mettler-
Toledo 仪器公司), KT-300Y型超声波药品处
理机(济宁科特超声电子有限责任公司), 722
型光栅分光光度计(上海分析仪器厂), BUCH
旋转蒸发仪(BUCH公司)。
1.4　方　法
55
食品与发酵工业　Food and Fermentation Industries 　 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
2004年第 30卷第 7期(总第 199期) 　(　　)
DOI :10.13995/j.cnki.11-1802/t s.2004.07.013
1.4.1　牡丹花提取物的制备
取 500.0 g 新鲜牡丹花迅速浸于 500 mL
沸甲醇中 2 min ,放冷 ,超声提取 20 min ,过滤 ,
滤渣再用 500 mL 甲醇重复提取 1 次 ,合并滤
液 ,低温减压浓缩 ,得提取物 4.53 g 。
1.4.2　牡丹花提取物中多酚和总黄酮的含量
测定
多酚测定参照文献[ 5] , 以没食子酸为标
准 ,测得提取物多酚含量为 0.146%;黄酮测定
参照文献[ 6] ,以槲皮素为标准测得提取物黄酮
含量为 0.044%。
1.4.3　超氧阴离子(O·2-)清除活性的测定
参照文献[ 7] ,在 5mL 反应液中 ,加入 Met
溶液 1.0mL ,NBT 溶液 0.5mL ,最后加入 0.5
mL VB
2
溶液 ,混匀 ,使 VB
2
浓度为 3×10-6 mol/
L ,Met浓度为 1×10-2mol/L ,NBT 浓度为 1.0
×10-4mol/ L。分别在样品管中加入不同浓度
的样品 3.0mL ,在 20W 日光灯下 ,距离 40 cm ,
光照 20min ,立即在 722分光光度计上 ,以未光
照的试液作校正 ,于 560 nm 处测定吸光度为
A ,加入样品的溶液测得的吸光度为 A1 ,则清
除率可计算为:
清除率 =[(A -A 1)/ A] ×100%
1.4.4　羟自由基(·OH)清除活性的测定
参考文献 [ 8] , 采用邻菲罗啉-Cu+-VC-
H2O2体系检测·OH 清除能力 。向测量管中依
次加入 50μL 待测样品 (或 50μL 甲醇作空
白), 50μL 1×10-3 mol/L CuCl2溶液 , 20μL ×
10
-3
mol/ L VC 溶液 , 50μL ×10-3 mol/ L 邻菲
罗啉溶液 , 800μL 0.05mol/L pH 10.5 碳酸缓
冲液 ,放入反应池中。最后注入体积分数 1 %
的H2O2 50.0μL , 摇匀 , 启动发光反应 , 连续
测定发光强度 6 s , 至出现峰值 , 记录发光强度
(CL),清除自由基的物质可以降低发光强度 ,
根据发光强度的下降可以判断物质清除自由基
的能力。
发光抑制率=[(对照 CL -样品 CL)/对
照 CL ] ×100%。
1.4.5　H2O2 清除活性的测定
参考文献[ 8] ,采用 H2O2-鲁米诺-碳酸缓
冲液(pH 9.5)体系检测 H2O2 。向测量管中加
入 50μL 待测样品(或 50μL 甲醇作空白), 50
μL 1×10-3 mol/L 鲁米诺溶液 , 放入反应池
中 。800μL pH 9.5碳酸缓冲液 ,最后加体积分
数 0.15 %H2O2 50μL , (反应总体积为 1mL)
启动发光反应 , 连续测定反应强度 6 s , 至出现
峰值 ,记录发光强度(CL),发光抑制率计算同
1.4.4。
1.4.6　DNA 损伤的化学发光体系
参考文献[ 9] ,采用 CuSO4-Phen-VC-DNA-
H2O2 化学发光体系 。该体系生成·OH 能损伤
DNA产生一迟于 Phen本身发光信号的滞后的
化学发光 ,其发光强度与 DNA 的量成正比关
系 。具体操作是:用 0.1 mol/L 磷酸盐缓冲液
(pH 5.5)配制 CuSO4-Phen-VC-DNA 溶液 , 使
Cu
2+ 、Phen 、Vc、DNA 终浓度分别为 5.0 ×
10-5 mol/ L 、 3.5×10-4 mol/ L 3.5×10-4
mol/ L 、1.0μg/ mL ,加入一定量的PE(对照用
缓冲液补齐)。取该溶液 1mL ,放入发光仪样
品池中 ,加入 200μL 体积分数 3%的 H2O2 溶
液 ,立即测量化学发光反应动力学曲线。
2　结果与分析
2.1　PE对O·2-的清除作用
甲硫氨酸(Met)作用于核黄素时可产生 O·2
-,可还原氮蓝四唑(NBT), 使之转化为
CN4H4 ,而多酚化合物可以抑制该反应 ,故可依
据抑制率来研究提取物对 O·2 -的清除效果[ 7] 。
如表 1所示 ,随着 PE 质量浓度的增加 ,对 O·2-
清除率呈上升趋势。其发光抑制率 50 %的浓
度 (IC50)为 199.00μg/mL , 而对照实验槲皮
表 1　牡丹花提取物(PE)对 O·2-的清除作用(n=3)
提取物浓度
/μg·mL -1＊
多酚浓度
/μg·mL -1a
黄酮浓度
/μg·mL -1b
抑制率
/ %
20 0.029 0.009 11.11
100 0.146 0.044 19.14
200 0.292 0.088 44.65
600 0.870 0.264 77.37
1 000 1.460 0.440 94.03
＊:y=21.937ln x-64.988　R2=0.9400 , IC50=199.00μg/mL;
a , b:分别指相应的提取物中多酚和黄酮的浓度。
56
研究报告
(　　)　 2004 Vol.30 No.7(Total 199)
素在本体系中的 IC50为 13.69μg/mL(见表4),
说明 199.00μg/ mL 的 PE 清除氧自由基的能
力与之相当。
2.2　PE对羟自由基(·OH)的清除作用
通过化学模拟体系研究 PE 对活性氧自由
基的清除作用如表 2 所示。羟自由基 (·OH)
是最活泼也最具危害性的自由基 ,往往也更难
清除 ,已发现许多抗氧化物质能清除 O·2-,但
却不能清除·OH 自由基[ 10] 。本研究结果表
明 ,PE能显著地清除·OH 自由基 ,并具有很好
量效关系 ,其 IC50为 193.18μg/mL ,而作为对
照的槲皮素在本体系中的 IC50为 99.5μg /mL ,
说明 PE 对·OH自由基有较好的清除作用 。
表 2　牡丹花提取物(PE)对·OH的清除作用(n=8)
提取物浓度
/μg·mL-1＊
多酚浓度
/μg·mL -1
黄酮浓度
/μg·mL -1
发光峰值
(cp6s)
抑制率
/ %
空白管 69 169±2 589
50 0.073 0.022 57 230±3 163 17.26
100 0.146 0.044 50 547±1 860 26.92
200 0.292 0.088 34 133±1 534 50.65
300 0.438 0.132 26 258±638 62.04
400 0.586 0.176 20 682±782 70.01
500 0.730 0.220 15 903±1 481 77.01
＊:y =27.001ln x -92.123 , R2 =0.9846 , IC50=193.18μg/
mL
2.3　PE对 H2O2 的清除作用
H2O2能在有 O2和碱性条件下氧化鲁米诺
产生化学发光。如表 3所示 , PE能显著抑制该
体系的化学发光 ,随着 PE 浓度的增大 ,发光值
明显下降 ,其 IC50为 50.85μg/ mL ,说明 PE 具
有清除 H2O2 的作用 ,或能竞争性地夺取 H2O2
能量 ,或者这 2 个作用兼而有之。槲皮素在本
体系中的 IC50为 14.2μg/ mL(见表 4),在清除
表 3　牡丹花提取物对 H2O2 的清除作用(n=8)
提取物浓度
/μg·mL-1＊
多酚浓度
/μg·mL -1
黄酮浓度
/μg·mL -1
发光峰值
(cp6s)
抑制率
/ %
空白管 20 280±416
20 0.029 0.009 13 208±516 34.87
50 0.073 0.022 9 363 ±331 53.83
200 0.292 0.088 6 569 ±470 67.61
400 0.586 0.176 4 706 ±283 76.86
600 0.870 0.264 3 442 ±237 83.03
　　＊:y=13.734ln x-2.546　R2=0.9836, IC50=50.85μg/mL
表 4　牡丹花提取物 、槲皮素清除活性氧的能力(IC50)
PE 槲皮素/μg·mL -1
氧阴离子(O·2-) 199.00 13.69
羟自由基(·OH) 193.18 99.50
过氧化氢(H2O 2) 50.85 14.20
H2O2 的能力上 , 50.85 μg/mL 的 PE 与 14.2
μg/mL 的槲皮素相当。
2.4　PE对·OH引发的 DNA损伤的保护作用
在 Cu2SO4-Phen-VC-H2O2化学发光体系
中 ,Phen在金属离子的催化下能与 H2O2作用 ,
产生最大发射在 455 ～ 450 nm 范围内的化学发
光 。在 DNA 存在 ,体系产生的·OH 等自由基
引起 DNA损伤断裂 ,产生延迟于 Phen本身发
光的慢的化学发光 ,最大发光在 380 ～ 420 nm ,
此发光反应为鸟嘌呤的特征反应[ 9] 。由图1所
示 ,PE 的加入使 DNA 损伤发光峰位后移 ,峰
值降低 ,对 DNA 的损伤发光有明显地抑制作
用 ,且抑制作用随 PE 浓度的增大而增强 ,说明
PE能有力地清除·OH ,从而保护 DNA 免受损
伤 。同时 ,还可以看到 PE 能够明显的抑制基
底反应液的 Phen的发光 , PE的加入使得前峰
前移 ,后峰后移 ,后移程度随着 PE浓度的增大
而加大。后峰后移的一个因素可能反映了 PE
清除·OH ,减缓 DNA 损伤的动力学过程 ,延迟
时间与 PE呈现明显的量效关系。
曲线 a～ e , PE浓度分别为 0、 20 、50 、
100 、200μg/mL
图 1　PE对·OH 致 DNA链损伤的抑制作用
3　讨　论
本试验结果表明 , PE 对 O·2 -、·OH 和
H2O2等活性氧具有直接清除作用 , 牡丹花中的
含有丰富的酚类物质 、黄酮类化合物 ,这些物质
57
研究报告
2004年第 30卷第 7期(总第 199期) 　(　　)
在抗氧化反应中不仅能清除链反应引发阶段的
自由基 ,而且可以直接捕捉自由基反应链中的
自由基 ,阻断自由基链反应起到预防和断链的
双重作用[ 13] ,提示 PE 可能在防衰老 、抗炎症
等方面发挥作用 。据此推断 , 牡丹花的抗氧化
作用可能是民间验方的药理基础之一。本工作
为牡丹花的药理研究增加了自由基生物学方面
的理论和实验资料。
参 考 文 献
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Effects of Extract from Peony Flowers on Removal of Reactive
Oxygen Species and Preventing DNA Damage Caused by Hydroxyl Radical
Wang Xiao
1 , 2 　Shi Xingang2 　Zheng Chengchao1 　Liu Jianhua2
1(Colleg e of Life Sciences , Shandong Ag riculture University , Taian , 271018)
2(Test Center , Shandong Academy of Sciences , Jinan , 250014)
ABSTRACT　The effects of the ex t ract of peony flowers on removing active oxygen species in some
modif ied chemical sy stems were investig ated by chemiluminescence and spectrophotometry.The inhi-
bi tion of the damage DNA chain induced by hydroxy l radical by the ex tract f rom peony flowers was ob-
served by chemiluminescence.The results show ed that the ex t ract could eff iciently remove O·2 -,
·OH , H2O2 and the 50%inhibition concentration (IC50)are 199.0 , 193.18 , 50.85μg/mL , respec-
tively.The ext ract also protected DNA chains f rom being damaged by hydroxy l radical.
Key words　Paeonia suf fruticosa Andr , active oxygen , DNA damage
　行业动态
　 酪蛋白磷酸肽制备工艺通过专家鉴定
天津大学承担的天津市科技攻关项目“高效促钙吸收因子酪蛋白磷酸肽的连续制备工艺开发” ,最近
通过了天津市科委的科技成果鉴定 , 达到国际先进水平 , 其产品为一类功效显著的促钙吸收因子 , 商品化
后有利于提高国民健康水平和社会效益。
以酪蛋白 、碱性蛋白酶为研发体系 , 采用逐级放大由酶解罐与超滤 、纳滤膜件组合而成的双级酶膜耦合反应
器 ,开发了集酶促水解反应 、催化剂回收再用 、产物分离 、浓缩脱盐 、苦味肽脱除等多步工序于一体的连续 、稳定 、高
效制备酪蛋白磷酸肽的新工艺 ,使主要指标连续酶解转化率大于 90%,酶耗量降为 1/3 , 蛋白质收率>90%,具有
创新性和先进性 ,样品达到国家保健(功能)食品通用标准。
58
研究报告
(　　)　 2004 Vol.30 No.7(Total 199)