全 文 ：第 39 卷 第 8 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 39 No． 8
2011 年 8 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Aug． 2011
1)国家“863”项目(2006AA100109)、国家林业局“948”项目
(2006－4－C07)。
第一作者简介:周琳，女，1981 年 12 月生，国家林业局林木培育
重点实验室(中国林业科学研究院林业研究所) ，助理研究员。
通信作者:王雁，国家林业局林木培育重点实验室(中国林业科
学研究院林业研究所) ，研究员。E－mail:chwy8915@ sina． com。
收稿日期:2010 年 12 月 7 日。
责任编辑:戴芳天。
云南野生黄牡丹花色素成分的鉴定1)
周 琳 王 雁 律春燕 彭镇华
(国家林业局林木培育重点实验室(中国林业科学研究院林业研究所) ，北京，100091)
摘 要 以云南野生黄牡丹为材料，通过特征显色反应、紫外—可见光谱扫描及高效液相色谱—质谱技术
(HPLC－MS)对其花瓣中的色素成分进行了初步分析和鉴定。结果表明，黄牡丹花色素的组成包括类黄酮和叶绿
素两大类，其中类黄酮类色素主要为查耳酮和黄酮、黄酮醇的混合物，包括 2，4，6，4－四羟基查耳酮(2，4，6，4－
tetrapydroxychalcone，THC)的 2－葡萄糖苷即异杞柳苷(isosalipurposide，ISP)及山奈酚、槲皮素、异鼠李素、金圣草黄
素、芹菜素葡糖苷等。同时，基于花色素的组成信息，探讨了牡丹黄色花育种的策略，为黄牡丹花色素成分的进一
步分离和鉴定奠定了基础，并为牡丹黄色花形成机理及黄色花育种的研究提供了理论参考。
关键词 黄牡丹;花色素;类黄酮;液相色谱;质谱
分类号 Q946． 83:S685． 11
Identification of Components of Flower Pigments in Petals of Paeonia lutea Wild Population in Yunnan /Zhou Lin，
Wang Yan，Lü Chunyan，Peng Zhenhua(Key Laboratory of Tree Breeding and Cultivation (Research Institute of Forestry，
Chinese Academy of Forestry) ，State Forestry Administration，Beijing 100091，P． R． China)/ / Journal of Northeast For-
estry University． －2011，39(8)． －52 ～ 54
Petal pigment composition of Paeonia lutea wild population in Yunnan was primarily investigated and identified by use
of specific color reactions，UV-visible spectra and high performance liquid chromatography-mass spectrometry (HPLC-
MS)． Results indicate that flower pigments of P． lutea consist of flavonoids and chlorophyll;the main flavonoid pigments
are the compound of chalcone，flavones and flavonoids including the 2-glucoside of 2，4，6，4-tetrapydroxychalcone
(THC)-isosalipurposide (ISP) ，as well as kaempferol，quercetin，isorhamnetin，chrysoeriol and apigenin． Meanwhile，the
floral color breeding strategies for the cultivars with yellow flowers were discussed based on the pigment composition of P． lutea．
Keywords Paeonia lutea;Flower pigments;Flavonoids;High performance liquid chromatography;Mass spectrometry
黄牡丹(Paeonia lutea)是我国西南特有的野生牡丹，属芍
药科芍药属牡丹组的落叶亚灌木。它不仅是我国稀有的珍贵
木本花卉和名贵的药用植物，而且因其花为黄色，作为珍稀育
种资源在牡丹花色改良研究中也具有重要的地位［1］。花色素
是花色形成的物质基础，分析花瓣中色素成分对于探讨牡丹花
色形成的化学基础和花色育种都具有十分重要的意义。近年
来，国内外围绕牡丹花色的研究不断深入，现已对各栽培品种
群和部分野生种的花色素成分进行了分析，并对花色与花色素
组成之间的关系进行了探讨［2－3］。但是，这些研究都是以常见
的白、粉、红及紫色系的牡丹品种(种)为研究对象。迄今为止，
除 Li等［4］从食品保健角度对开黄色花的滇牡丹类黄酮成分进
行了研究以外，还未有对云南野生黄牡丹花色素成分进行分
析，进而讨论牡丹黄色花育种的报道。因此，本研究采用特征
显色反应、紫外—可见光谱扫描及高效液相色谱—质谱(HPLC
－MS)技术对云南野生黄牡丹花瓣中的色素成分进行了分离和
鉴定。并基于花色素的组成信息，探讨了牡丹黄色花育种的策
略，以期为研究牡丹黄色花形成机理奠定生理生化基础，并为
将来应用分子手段培育纯黄色花的牡丹新品种提供理论依据。
1 材料与方法
1． 1 植物材料
野生黄牡丹采自云南省玉溪市澄江县北部海拔 2 406 m
的梁王山一带。花黄绿或黄色(Yellow－green，154A) ，基部有
紫斑。采摘刚盛开的花朵，置于保鲜袋内立即运回实验室，将
花瓣的基部紫斑剪下，分为黄色花瓣和紫斑两个部分，每 0． 1
g为一包，分别用锡箔纸包好，液氮速冻后，于冰箱中－80 ℃保
存备用。
1． 2 黄牡丹花色素类型的定性分析及特征显色反应
取黄色花瓣及紫斑部分各 0． 1 g，于液氮中研碎后放入具
塞试管中，分别加入石油醚、10． 0%盐酸和 30． 0%氨水约 5
mL，观察颜色变化［5－6］。相同样品，分别用甲醇和含 1． 0%
(体积分数)浓盐酸的甲醇溶液提取液，过滤，定容至 25 mL，
各取 2 mL提取液，进行显色反应［7－9］。
1． 3 紫外―可见光谱分析
黄色花瓣中叶绿素、类胡萝卜素及类黄酮的紫外—可见
光谱分析参照文献［5］－［8］中的方法进行。
1． 4 黄牡丹花色素的 HPLC－MS分析
取黄色花瓣 0． 1 g，于液氮中研碎后放入具塞试管中，加
入 3 mL 70%甲醇溶液，置于冰箱中 4 ℃提取过夜，上清液经
0． 22 μm的滤膜过滤后，用于 HPLC 分析。采用 Agilent 1100
型高效液相色谱仪，Zorbax SB－C18 色谱柱(4． 6 mm×150 mm，
5 μm)。
花色素的 HPLC定性分析条件:参考文献［10］，选择流动
相 A液为体积分数为 0． 1%的甲酸水溶液;B液为含 0． 1%甲
酸的色谱纯乙腈溶液。进样体积为 10 μL，柱温 35 ℃，流速为
0． 8 mL·min－1。洗脱程序初始比例为 20% B液，30 min时 B
液比例提高到 60%，40 min时恢复 B液比例为 20%。花色素
苷和类黄酮的检测波长分别为 525 nm和 360 nm。
采用 API QSTAR Pulsar i System 液相色谱 /四极杆 /飞行
时间串联质谱仪对样本进行分析。色谱柱、流速、柱温、进样
体积和流动相同上。分析程序初始比例为 20% B 液，30 min
时 B液比例提高到 60%，40 min时恢复为 20% B液。检测波
长为 360 nm。质谱分析条件:电喷雾离子源，正离子扫描
(ESI+) ，多反应监测(MRM)模式;毛细管电压 3． 5 kV，喷雾
电压 5 500 V，雾化气压力 1． 1 ×105Pa，辅助气柱前压 0． 68×
105Pa，干燥温度 450 ℃，干燥气(N2)流速 8． 0 L·min
－1。
2 结果与分析
2． 1 花色素的定性分析
2． 1． 1 石油醚、盐酸和氨水测试
从石油醚反应可以看出，黄牡丹的黄色花瓣和紫斑部分
都表现为无色，说明不含类胡萝卜素;盐酸测试发现，浸有黄
色花瓣的盐酸出现黄色，说明有黄酮类化合物，而紫斑部分表
现出明显的红色，说明含有花色素苷的成分;氨水测试中，黄
色花瓣部分表现为铁锈黄色至褐色，表明可能含有黄酮醇类
化合物和查尔酮，而紫斑部分表现为黄绿色，推测是由花色苷
呈现蓝色和类黄酮化合物呈现的黄色混合而成(表 1)。
表 1 黄牡丹色素类型测试的颜色反应
样品 石油醚 盐酸 氨水 浓盐酸－镁粉(对照) 四氢硼钠 三氯化铝 醋酸铅 硼酸 浓硫酸 碳酸钠
黄色花瓣 无色 黄色 铁锈黄至褐色 淡紫红(淡紫红) 亮黄 黄 极淡黄，黄色沉淀 亮黄 深黄 亮黄，棕黄
紫斑部分 无色 深红 黄绿 浅粉红(极淡黄) 无色 黄 无色，白色沉淀 无色 深黄 淡黄，淡黄棕
2． 1． 2 类黄酮的特征显色反应
根据各反应液颜色变化，参照文献［11］、［12］对黄牡丹
花色素成分进行初步分析。如表 1 所示，浓盐酸—镁粉反应
中，黄色花瓣部分和紫斑部分均呈现不同程度的红色，说明可
能含有黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇及花色素苷化合
物;而对照组中，黄色花瓣也呈现阳性反应，说明含有某些查
尔酮或橙酮。四氢硼钠反应是二氢黄酮类化合物的专属反
应，黄色花瓣部分呈现亮黄色，而紫斑部分溶液颜色没有明显
变化，表明花瓣中不含二氢黄酮或二氢黄酮醇，可能含有查尔
酮、黄酮、黄酮醇和异黄酮等。在黄色花瓣和紫斑部分的提取
液中加入三氯化铝均呈现不同程度的黄色，证实黄牡丹花色
素属于黄酮类化合物;醋酸铅反应中，黄色花瓣和紫斑部分溶
液颜色无明显变化，并分别产生黄色和白色沉淀，表明其中具
有邻二酚羟基或兼有 4－酮基、3－OH 或 4－酮基、5－OH 结构。
硼酸反应中，紫斑部分的溶液颜色无明显变化，而黄色花瓣的
溶液呈现亮黄色，表明可能具备 5－羟基黄酮或 2’－羟基查耳
酮类结构。浓硫酸反应中，黄色花瓣和紫斑部分都呈现深黄
色，表明含有黄酮或黄酮醇化合物。碳酸钠反应中，两部分均
先表现为黄色，通空气后变为棕黄色，说明其中可能含有 C3
位有游离羟基的黄酮醇类或二氢黄酮类化合物。
2． 2 紫外—可见光谱分析
紫外—可见光谱分析发现，黄牡丹花色素的 90%丙酮溶
液在 663 nm 处有吸收峰，说明含有叶绿素。石油醚和丙酮
(体积比为 1 ∶ 1)的花色素提取液在类胡萝卜素的特征吸收
峰 440、470 nm附近均无吸收峰，说明不含类胡萝卜素。黄牡
丹花色素的甲醇溶液在 359 和 272 nm 处出现吸收峰，且在
300 ～ 330 nm处无肩峰，推测含黄酮醇类化合物，不含二氢黄
酮和二氢黄酮醇;而在花色素苷的特征吸收峰 530 nm处没有
吸收峰，说明黄色花瓣中不含花色素苷。另外，由于在 340 ～
390 nm处有特征吸收峰，推测花色素中有可能存在查耳酮，
310 ～ 330 nm 间未出现肩峰，说明花色素中不含异黄酮，320
nm处无吸收峰表明色素中无肉桂酸作为酰基［7］。
2． 3 黄牡丹花色素成分的 HPLC－MS分析
经 HPLC分析，黄牡丹花色素提取液在 525 nm下未检测
出任何花青苷类化合物(色谱图略) ，在 360 nm下主要检出 5
种黄酮、黄酮醇化合物(f1—f5)和 1 种查耳酮糖苷(c1) (图
1) ，进一步证实黄牡丹花瓣中类黄酮色素成分为黄酮、黄酮
醇和查耳酮的混合物，不含花色素苷。为进一步确定花色素
成分的化学结构，对色素提取液进行了 HPLC－MS分析，并根
据已有的文献数据［13－15］推断样品中花色素的结构。由于
其他成分的含量极其微小，故未进行结构推定。
图 1 黄牡丹花色素在检测波长 360 nm 下黄酮、黄酮醇和查耳酮的
HPLC色谱图
如表 2 所示，在 360 nm 下检测到的组分 f1 质谱碎片 m/
z287． 1(［Y0+H］
+)与黄酮醇山奈酚(Kaempferol，Km)和黄酮木犀
草素(Luteolin，Lu)一致。根据紫外吸收光谱的分析结果及紫外
吸收带 II组分的 λmax，Km及其糖苷大多在265 nm左右，而 Lu及
其糖苷大多在 255 nm左右［11］，推定该组分为山奈酚苷元。
组分 f2 质谱碎片离子为 m/z303． 3(［Y0 +H］
+)，m/z302． 3
为槲皮素(Quercetin，Qu)苷元的特征质荷比，推定为槲皮素
苷元。
组分 f3 经一级质谱得到分子离子 m/z433． 1( ［M］+) ，释
放出碎片离子 m/z271． 3( ［Y0 +H］
+)。m/z270． 3 为芹菜素
(Apigenin，Ap)的特征质荷比，糖苷键断裂得到的糖基离子为
m/z162，推定为芹菜素的葡糖苷。
组分 f4 质谱碎片离子为 m/z317． 3(［Y0 +H］
+)，m/z316． 3
为异鼠李素(Isorhamnetin，Is)苷元的特征质荷比，推定为异鼠
李素苷元。
组分 f5 质谱碎片离子为 m/z301． 3(［Y0 +H］
+)，m/z300． 3
为金圣草黄素(Chrysoeriol，Ch)苷元的特征质荷比，推定为金
圣草黄素苷元。
组分 c1 经一级质谱分析得到准分子离子为 m/z435． 3
( ［M+H］+) ，释放出碎片离子 m/z273． 1( ［M+H］+) ，为 2，4，
6，4－四羟基查耳酮(2，4，6，4－tetrapydroxychalcone，THC)
的特征质荷比，糖苷键断裂得到的糖基离子为 m/z162，推定
为 THC2－葡糖苷即异杞柳苷(isosalipurposide，ISP)。
35第 8 期 周琳等:云南野生黄牡丹花色素成分的鉴定
表 2 黄牡丹花色素的 HPLC－MS分析及其结构鉴定
组分 相对分子质量 质谱信息 /(m/z) 推定结果
f1 286． 1 287． 1( ［Y0+H］+) 山奈酚苷元 Kaempferol
f2 302． 3 303． 3( ［Y0+H］+) 槲皮素苷元 Quercetin
f3 433． 1 433． 1( ［M］+) ，271． 3( ［Y0+H］+) 芹菜素葡糖苷 Apigenin－glucoside
f4 316． 3 317． 3( ［Y0+H］+) 异鼠李素苷元 Isorhamnetin
f5 300． 3 301． 3( ［Y0+H］+) 金圣草黄素苷元 Chrysoeriol
c1 434． 3 435． 3( ［M+H］+) ，273． 1( ［M+H］+)THC2－葡糖苷(异杞柳苷)isosalipurposide
注:M:糖苷分子; ［M］+:糖苷分子离子; ［M+H］+:糖苷分子加
氢;Y0:苷元;［Y0 +H］+:苷元分子加氢。
3 讨论
3． 1 黄牡丹花瓣中的主要色素种类
目前运用 HPLC法已从牡丹各栽培品种群和部分野生种
的花瓣中检测出 6 种花色素苷、3 种黄酮和 3 种黄酮醇［2］。
本实验发现，云南野生黄牡丹花色素的组成包括叶绿素和类
黄酮两大类，黄色花瓣部分不含花青苷，类黄酮类色素主要为
查耳酮和黄酮、黄酮醇的混合物，包括新发现的查耳酮 2－葡
糖苷 ISP，以及在其他野生种如紫牡丹中检测到的 3 种黄酮醇
和 3 种黄酮中的 2 种，与 Li等［4］研究结果一致。叶绿素的存
在表明该居群黄牡丹花瓣中黄绿色的来源，并推测可能与黄
牡丹是牡丹组野生居群中比较原始的一种有关［16］。目前发
现开黄色花的龙胆［17］和非洲菊［18］等花瓣中也含有叶绿素，
并且叶绿素的含量随着花朵的开放逐渐降低，而花色由绿转
黄。另外，HPLC还分离出其他多种含量较低的黄酮和黄酮
醇化合物，对这些色素成分的结构鉴定和黄酮和黄酮醇类色
素的糖苷水平上的分析有待于进一步研究。
3． 2 牡丹黄色花育种的可能途径
通过远缘杂交开展牡丹黄色花育种:查耳酮是黄酮类物
质中使花朵呈现黄色的主要物质之一［19］，本研究结果也表
明，牡丹黄色花的形成有赖于花瓣中查耳酮类色素的存在，并
同时尽量降低花色素苷的含量。为此，在花色素成分分析的
基础上，根据花色素的组成进行亲本的选择与组合，并借鉴欧
美在牡丹育种中应用黄牡丹的成功经验，有望通过种内、种间
杂交等获得理想的黄色花新品种。Zhang 等［3］通过对 35 个
西北牡丹品种进行花色素分析发现，开白色花的冰山雪莲花
瓣中不含任何花色素苷，可作为黄牡丹杂交选育的理想亲本。
牡丹黄色花的分子育种:分子育种可克服远缘杂交的不
亲和性。本实验发现黄牡丹花瓣中不含花青苷，而含有大量
查耳酮类化合物 ISP。因此可通过向目标植株中导入黄牡丹
的 ISP合成关键基因 THC2GT，并同时抑制其内源花青苷合
成相关基因的表达，促进花瓣内查耳酮的积累，进而实现牡丹
黄色花分子育种［20］。目前，THC2GT的 cDNA克隆已从香石
竹中得到分离，并通过表达该基因使矮牵牛花瓣中 ISP 含量
增加［21－22］。
致谢:感谢中国林业科学研究院资源与昆虫研究所李正
红、刘秀贤老师在实验取材方面给予的大力支持!
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420．
(上接 29 页)物质基础。播种后种子迅速萌发，达到早苗、全
苗和壮苗，是植物物获取优质高产的坚实基础。许多研究证
实了使用植物生理活性物质浸种可促进种子的萌发和幼苗的
生长［7－8］。试验结果表明，采用适宜剂型、质量浓度的植物生
长调节剂浸种处理报春花种子，有利于提高发芽率、活力指
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