全 文 ：微波辅助提取花椒叶黄酮及其抗氧化活性研究
刘军海
（陕西理工学院 化学与环境科学学院，陕西 汉中 ７２３００１）
摘要：采用微波辅助乙醇提取花椒叶黄酮，并对其抗氧化活性进行研究。在单因素探究试验的基础上，
通过正交试验对单因素试验选取的水平进行工艺优化，得到最佳工艺条件：乙醇体积分数７０％、微波温
度６０℃、微波时间６ｍｉｎ、微波功率４００Ｗ、料液比１∶３０（ｇ／ｍＬ），此条件下花椒叶黄酮的提取率为
７．４１８％。抗氧化实验结果表明花椒叶黄酮对羟自由基和亚硝酸盐均有一定的清除作用。
关键词：微波辅助；黄酮；提取；抗氧化活性
中图分类号：ＴＳ２０１．１ 文献标志码：Ａ ｄｏｉ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１０００－９９７３．２０１５．０７．００３
文章编号：１０００－９９７３（２０１５）０７－００１６－０５
Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ
Ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ Ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｂｕｎｇｅａｎｕｍＬｅａｖｅｓ
ＬＩＵ Ｊｕｎ－ｈａｉ
（Ｃｏｌｅｇｅ ｏｆ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｓｈａａｎｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ
ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｈａｎｚｈｏｎｇ ７２３００１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｕｓｉｎｇ ｅｔｈａｎｏｌ ａｓ ｔｈｅ ｓｏｌｖｅｎｔ，ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｎ Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｂｕｎｇｅａｎｕｍｌｅａｖｅｓ ａｒｅ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ
ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｓｔｕｄｉｅｄ．Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ａｒｅ
ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｔｈｒｏｕｇｈ ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ ｔｅｓｔ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｓｉｎｇｌｅ ｆａｃｔｏｒ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ ｔｈｅ
ｏｐｔｉｍｕｍ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｅｔｈａｎｏｌ ｖｏｌｕｍｅ ｆｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ７０％，ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｏｆ ６０℃，ｍｉｃｒｏｗａｖｅ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｔｉｍｅ ｏｆ ６ｍｉｎ，ｍｉｃｒｏｗａｖｅ ｐｏｗｅｒ ｏｆ ４００Ｗ，ｒａｔｉｏ ｏｆ ｓｏｌｉｄ ｔｏ ｓｏｌｖｅｎｔ ｏｆ １∶３０（ｇ／ｍＬ），ａｎｄ
ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｒａｔｅ ｏｆ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｉｓ ７．４１８％．Ｔｈｅ ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ ｆｒｏｍ Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ ｂｕｎｇｅａｎｕｍ ｌｅａｖｅｓ ｈａｖｅ ｂｅｔｔｅｒ ｃｌｅａｎｉｎｇ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｈｙｄｒｏｘｙｌ ｆｒｅｅ
ｒａｄｉｃａｌｓ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｔｅ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：ｍｉｃｒｏｗａｖｅ－ａｓｓｉｓｔｅｄ；ｆｌａｖｏｎｏｉｄｓ；ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ；ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ
花椒叶是花椒的副产物，新鲜叶子可作为芽菜的
原料或是调味品使用，但是目前还没有形成产业链，大
量的花椒叶散落田间。这部分浪费的资源如果能得到
合理的应用，可为花椒产业创造更多的经济价值。研
究表明：花椒叶中含有芳香油、糖苷、蛋白质、纤维素、
黄酮类化合物等多种成分［１，２］，其中的活性成分黄酮
类化合物具有抑菌、抗癌、抗氧化、降血糖、降血脂、抗
衰老等药理功效，已经广泛应用于食品、药品、日用化
工等领域［３－５］。黄酮类化合物是植物的次级代谢产
物，成分复杂，种类繁多，在食品中可作为甜味剂、抗氧
化剂及功能性食品添加剂。
目前花椒叶黄酮的提取方法报道较少［６，７］，笔者
收稿日期：２０１５－０３－０８
基金项目：陕西省教育厅２０１２年科学研究项目计划（１２ＪＫ０６０２）
作者简介：刘军海（１９７２－），男，陕西渭南人，副教授，主要从事天然产物应用方面的研究。
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基础研究 第４０卷 第７期
２０１５年７月
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采用微波辅助提取花椒叶中的黄酮，并用正交优化了
提取工艺，通过清除羟自由基及亚硝酸盐能力来评价
花椒叶黄酮提取液的抗氧化性能，旨在为花椒叶资源
的进一步综合开发利用提供理论参考。
１ 试验
１．１ 实验材料及仪器
花椒叶（大红袍花椒叶，采摘自陕西韩城）；石油醚
（３０～６０℃沸程）；芦丁（西安荣升有限公司）；乙醇、氢
氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、硫酸亚铁、邻二氮菲、Ｖｃ
（抗坏血酸）、硝酸铝、氢氧化钠、盐酸萘乙二胺、对氨基
苯磺酸等均为分析纯。
ＦＷ１１７中草药粉碎机 天津泰斯特仪器有限公
司；ＧＲ－２００电子天平 日本 ＡＮＤ；ＷＦ－２０００微波快
速反应系统 上海屹尧分析仪器有限公司；ＬＤ５－１０型
离心机 北京京立离心机有限公司；Ｃａｒｙ５０型紫外可
见分光光度计 美国瓦里安；ＳＨＺ－Ｄ９（Ⅲ）循环水式
真空泵 巩义市予华仪器有限公司。
１．２ 实验步骤
１．２．１ 芦丁标准曲线的绘制
y = 0.0883x + 0.0076
R2 = 0.998
0.9
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10
芦丁标准品浓度（mg/mL）
吸
光
度
图１ 芦丁标准曲线绘制图
准确称取干燥至恒重的芦丁标准品０．１０００ｇ，用
体积分数为６０％的乙醇溶液溶解，移入１００ｍＬ的容
量瓶定容，配制成１．０ｍｇ／ｍＬ的溶液，然后分别取
０．０，０．１，０．２，０．３，０．４，０．５，０．６，０．７，０．８，０．９ｍＬ溶
液置于１０ｍＬ的容量瓶中，加入质量分数为５％的亚
硝酸钠０．３０ｍＬ，６ｍｉｎ后加质量分数为１０％的硝酸
铝０．３０ｍＬ，６ｍｉｎ后加入质量分数为４％的氢氧化钠
４．００ｍＬ，最后用６０％的乙醇定容。第一组做空白对
照，用紫外分光光度计在５１０．０ｎｍ的波长下分别测
其吸光度，得标准曲线方程为ｙ＝０．８８２７ｘ＋０．００７６
（Ｒ２＝０．９９８），说明所用的芦丁标准溶液在测定范围
内线性关系良好，可以作为试验测定黄酮提取率的指
标。式中：ｙ为吸光度值；ｘ为芦丁标准溶液浓度，
ｍｇ／ｍＬ。标准曲线绘制结果见图１。
１．２．２ 花椒叶黄酮提取工艺流程
花椒叶→洗净→５０℃恒温烘至绝干→粉碎→过
６０目筛→石油醚索氏脱脂２４ｈ→挥发石油醚→３０℃
恒温烘干至恒重→阴凉干燥处备用→设定提取工艺参
数进行微波提取→抽滤→滤液３０００ｒ／ｍｉｎ离心
１０ｍｉｎ→离心液定容→稀释一定倍数→按照１．２．１的
步骤显色→静置１０ｍｉｎ测定吸光度→计算提取率。
１．２．３ 花椒叶黄酮含量测定
黄酮提取率（％）＝
（ｙ－０．００７６）
０．８８２７ ×Ｑ×１００
。
式中：ｙ为待测液吸光度值；Ｑ为稀释总倍数。
１．３ 花椒叶黄酮提取液抗氧化活性试验
１．３．１ 清除羟自由基活性试验［８］
采用邻二氮菲－Ｆｅ２＋氧化法。取１０ｍＬ具塞试管
９支进行编号（１～９），在９支试管中依次加入０．５ｍＬ
水杨酸－乙醇溶液（９．１ｍｍｏｌ／Ｌ），０．５ｍＬ不同浓度的
花椒 叶 黄 酮 提 取 液，０．５ ｍＬ 的 硫 酸 亚 铁 溶 液
（９ｍｍｏｌ／Ｌ），３．５ｍＬ的蒸馏水，最后再加入５．０ｍＬ
双氧水（８８ｍｍｏｌ／Ｌ），摇匀，静置１５ｍｉｎ，待溶液反应
完全，于５１０．００ｎｍ处测定吸光度 Ａ１，用０．５ｍＬ的
蒸馏水代替硫酸亚铁溶液测得的吸光度为 Ａ２，用
０．５ｍＬ的蒸馏水代替花椒叶黄酮提取液所测得的吸
光度为Ａ３，每个实验重复３次，将其平均值作为最后
测定结果。以相同浓度的 Ｖｃ做阳性对照，按下式计
算羟自由基的清除率：
羟自由基清除率（％）＝１－
（Ａ１－Ａ２）
Ａ３
×１００。
１．３．２ 清除亚硝酸盐活性试验［９］
将花椒叶黄酮提取液稀释配制成８个不同浓度梯
度，准备９个２５ｍＬ的容量瓶，１号为空白参比。分别
精密量取１ｍＬ 移入２５ｍＬ 的容量瓶中，各加入
５μｇ／ｍＬ的亚硝酸钠标准溶液５ｍＬ，在室温下反应
６０ｍｉｎ再加２ｍＬ质量分数为０．４％的对氨基苯磺酸
钠，摇匀，静置５ｍｉｎ，最后加入１ｍＬ质量分数为
０．２％的盐酸萘乙二胺溶液，摇匀，定容至刻度线，静置
１５ｍｉｎ，于５４０．００ｎｍ处测吸光度，测定３次，取其平
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第４０卷 第７期
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均值作为最后结果，计算亚硝酸盐的清除率。以相同
浓度的Ｖｃ做阳性对照，评价花椒叶黄酮提取液对亚
硝酸盐的清除效果。
亚 硝 酸 盐 清 除 率 （％）＝ （Ｂ空白对比吸光度 －
Ｂ加入黄酮吸光度）／Ｂ空白对比吸光度×１００。
２ 单因素结果与分析
２．１ 乙醇体积分数对花椒叶黄酮提取率的影响
设定微波时间４ｍｉｎ，微波温度６０℃，微波功率
３００Ｗ，料液比１∶２５（ｇ／ｍＬ），比较不同体积分数的
乙醇对花椒叶黄酮提取率的影响，结果见图２。
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
40 50 60 70 80 90
提
取
率
（ %
）
乙醇体积分数（%）
图２ 乙醇体积分数对花椒叶黄酮提取率的影响
微波反应系统借助微波辐射不断鼓泡，增加了反
应系统的压力，使提取剂和提取原料充分接触，因此只
要选择合适浓度的提取剂就可得到很好的提取效果。
乙醇体积分数在４０％～７０％，随着乙醇体积分数的增
大，花椒叶黄酮提取率不断增大；乙醇体积分数为
７０％提取率最大，乙醇体积分数再增大，提取率反而降
低，故选择体积分数为７０％的乙醇较合适。
２．２ 微波时间对花椒叶黄酮提取率的影响
设定乙醇体积分数６０％，微波温度６０℃，微波功
率３００Ｗ，料液比１∶２５（ｇ／ｍＬ），比较不同微波时间
对花椒叶黄酮提取率的影响，结果见图３。
微波时间是提取过程的重要影响因素，因为分子
扩散及溶解需要一个过程，充分的提取时间可以将目
标产物尽可能地完全提取出来。由图３可知，在２～
４ｍｉｎ，花椒叶黄酮提取率随微波时间的延长不断增
大，４～６ｍｉｎ提取率增幅不明显，提取时间过长，溶解
的目标产物在微波过度辐射下化学结构容易发生变
化，提取率降低，综合提取率及能耗，选择５ｍｉｎ为较
佳微波时间。
7.5
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
2 3 4 5 6 7
提
取
率
（ %
）
微波时间（min）
图３ 微波时间对花椒叶黄酮提取率的影响
２．３ 微波温度对花椒叶黄酮提取率的影响
设定乙醇体积分数６０％，微波时间４ｍｉｎ，微波功
率３００Ｗ，料液比１∶２５（ｇ／ｍＬ），比较不同微波温度
对花椒叶黄酮提取率的影响，结果见图４。
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
40 50 60 70 80 90
提
取
率
（ %
）
微波温度（℃）
图４ 微波温度对花椒叶黄酮提取率的影响
微波温度对提取效果影响较大，微波温度的高低
直接决定分子的热运动程度。微波温度低，分子的热
运动不剧烈，提取原料细胞间的摩擦作用小，细胞壁破
裂难度较大，提取受阻。微波温度太高又容易导致热
敏性物质变性，提取率降低的同时品质受到严重影响。
由图４可知，花椒叶黄酮在４０～７０℃提取率显著提
高，超过８０℃，花椒叶黄酮提取率急速降低，因此选择
７０℃为较佳的微波温度。
２．４ 微波功率对花椒叶黄酮提取率的影响
设定乙醇体积分数６０％，微波温度６０℃，微波时
间４ｍｉｎ，料液比１∶２５（ｇ／ｍＬ），研究不同微波功率
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对花椒叶黄酮提取率的影响，结果见图５。
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
100 200 300 400 500
提
取
率
（ %
）
微波功率（W）
图５ 微波功率对花椒叶黄酮提取率的影响
微波功率是微波辐射强度的表达，微波辐射强度
越大，越容易改变细胞膜电位变化，分解细胞壁纤维，
再加上强大的内压能更好地促进细胞壁的破裂，有助
于提取物的溶出，强化提取效果；但是微波功率过大产
生的局部过热现象又容易使提取物变性，提取率下降。
在１００～４００Ｗ，微波功率增大促进了花椒叶黄酮的提
取，再增大，提取率降低，由图５可知，４００Ｗ为较佳微
波功率。
２．５ 料液比对花椒叶黄酮提取率的影响
设定乙醇体积分数６０％，微波温度６０℃，微波时
间４ｍｉｎ，微波功率３００Ｗ，研究不同料液比对花椒叶
黄酮提取率的影响，结果见图６。
7.0
6.5
6.0
5.5
5.0
4.5
4.0
3.5
1∶15 1∶20 1∶25 1∶30 1∶35
提
取
率
（ %
）
料液比（g/mL）
图６ 料液比对花椒叶黄酮提取率的影响
由图６可知，随着料液比的增大花椒叶黄酮提取
率不断增大，１∶３０（ｇ／ｍＬ）提取率最大，此时花椒叶黄
酮已达溶解平衡。提取时１ｇ花椒叶中的黄酮含量是
一定的，当料液比较小时，固液相浓度差小，提取受传
质推动力衰减的影响较大，提取率低；料液比增大，提
取率随传质速率的提高而增大，在１∶３０（ｇ／ｍＬ）时提
取率最大，为了防止其他醇溶性物质的溶解，同时考虑
生产成本及后续纯化难度，料液比不宜过大，选择１∶
３０（ｇ／ｍＬ）较合适。
３ 提取工艺的优化
单因素试验为正交优选了设计水平，选择乙醇体
积分数（Ａ）、微波时间（Ｂ）、微波温度（Ｃ）、微波功率
（Ｄ）、料液比（Ｅ）为影响因素，以提取率为指标，选择
Ｌ１６（４５）进行正交试验，正交结果见表１。
表１ Ｌ１６（４５）正交试验结果
试验
Ａ
乙醇体积分数
（％）
Ｂ
微波时间
（ｍｉｎ）
Ｃ
微波温度
（℃）
Ｄ
微波功率
（Ｗ）
Ｅ
料液比
（ｇ／ｍＬ）
提取率
（％）
１ １（５０） １（４） １（５０） １（２００） １（１∶２０） ４．９８３
２ １ ２（５） ２（６０） ２（３００） ２（１∶２５） ６．４３９
３ １ ３（６） ３（７０） ３（４００） ３（１∶３０） ７．０９３
４ １ ４（７） ４（８０） ４（５００） ４（１∶３５） ５．４３７
５ ２（６０） １ ２ ３ ４ ６．５５７
６ ２ ２ １ ４ ３ ５．４２６
７ ２ ３ ４ １ ２ ６．０２４
８ ２ ４ ３ ２ １ ６．１３２
９ ３（７０） １ ３ ４ ２ ５．２６１
１０ ３ ２ ４ ３ １ ６．３８４
１１ ３ ３ １ ２ ４ ６．５８２
１２ ３ ４ ２ １ ３ ６．４４３
１３ ４（８０） １ ４ ２ ３ ６．０１４
１４ ４ ２ ３ １ ４ ５．５４７
１５ ４ ３ ２ ４ １ ５．２６８
１６ ４ ４ １ ３ ２ ５．４０２
Ｋ１ ５．９８８ ５．７０４ ５．５９８ ５．７４９ ５．６９２
Ｋ２ ６．０３５ ５．９４９ ６．１７７ ６．２９２ ５．７８２
Ｋ３ ６．１６８ ６．２４２ ６．００８ ６．３５９ ６．２４４
Ｋ４ ５．５５８ ５．８５４ ５．９６５ ５．３４８ ６．０３１
Ｒ ０．６１０ ０．５３８ ０．５７９ １．０１１ ０．５５２
较优水平 Ａ３ Ｂ３ Ｃ２ Ｄ３ Ｅ３
最佳组合 Ａ３Ｂ３Ｃ２Ｄ３Ｅ３
正交试验设计是确定较优提取工艺的有效方法之
一，而且试验数目较少，可行性高。由表１可知，正交
优化的最佳工艺组合为 Ａ３Ｂ３Ｃ２Ｄ３Ｅ３，对应的微波提
取条件为：乙醇体积分数７０％、微波时间６ｍｉｎ、微波
温度６０℃，微波功率４００Ｗ、料液比１∶３０（ｇ／ｍＬ）。
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由表１也可知，各因素对提取率的影响次序为微波功
率＞乙醇体积分数＞微波温度＞料液比＞微波时间。
为了验证正交优化试验所确定的工艺条件，对最佳因
素组合进行３次平行实验，３次平行验证试验的平均
提取率为７．４１８％，高于正交试验任何组合的提取率，
因此正交优化试验确定的最佳工艺组合为最终的提取
条件。
４ 抗氧化试验研究
４．１ 清除羟自由基试验
人体内过量的羟自由基如果不能及时清除将会引
发各种疾病，其潜在危害很大，为了研究花椒叶黄酮提
取液体外清除羟自由基能力，按照１．３．１的试验流程
进行清除羟自由基试验，实验结果见图７。
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8
清
除
率
（ %
）
浓度（mg/mL）
Vc
黄酮提取液
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
图７ 花椒叶黄酮提取液清除羟自由基结果
由图７可知，在试验浓度范围内，花椒叶黄酮提取
液对羟自由基的清除率随浓度的增加逐渐增强，清除
效果与浓度呈一定的量效果关系，最大清除率达
６８．０３％，清除效果比Ｖｃ略差一些。
４．２ 清除亚硝酸盐活性试验
亚硝酸盐摄入较多可将血红蛋白中的二价铁离子
氧化成三价铁离子，使血红蛋白失去携氧能力，还是形
成强致癌物亚硝胺的前体物质，亚硝酸盐及时的清除
是对食品安全的保障。为了探究花椒叶黄酮提取液的
清除亚硝酸盐能力，按照１．３．２的试验流程进行试验，
与同浓度的Ｖｃ进行对比，结果见图８。在试验浓度范
围内，花椒叶黄酮提取液对亚硝酸盐的清除率随浓度
的增加逐渐增强，浓度与清除率呈正相关，当浓度达到
３．５ｍｇ／ｍＬ后，清除效果增幅并不明显，最大清除率
为７３．８２％。
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 4 4.5
清
除
率
（ %
）
浓度（mg/mL）
黄酮提取液
Vc
95
85
75
65
55
45
35
25
15
图８ 花椒叶黄酮提取液清除亚硝酸盐结果
５ 结论
微波辅助提取花椒叶黄酮提取时间短，提取率高，
节省溶剂。正交优化试验确定的最佳提取工艺条件：
乙醇体积分数７０％、微波温度６０℃、微波时间６ｍｉｎ、
微波功率４００Ｗ、料液比１∶３０ｇ／ｍＬ，花椒叶黄酮的
提取率为７．４１８％。
花椒叶黄酮提取液对羟基和亚硝酸盐的清除效果
与提取液的质量浓度均呈一定的量效关系，随着花椒
叶黄酮提取液质量浓度的增大，清除效果也不断增强，
最大清除率分别达６８．０３％，７３．８２％。花椒叶黄酮作
为具有一定抗氧化能力的天然绿色食品抗氧化剂，应
用前景广阔。
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