全 文 ：枇杷花为蔷薇科植物枇杷 [Eiobotrya japonica
（Thunb）Lindl.]的花及花穗， 是一种传统的民间中
药， 味淡、 性微温， 主治感冒咳嗽、 鼻流清涕、 虚
劳久咳、 痰中带血。 现代医学研究结果表明， 枇杷
花富含黄酮 [1-3]， 而黄酮具有降压、 活血化瘀、 保
肝、 止咳、 祛痰、 抗炎、 抗癌、 抗氧化、 镇痛等多
种功效 [4-6]， 在医学上有较高的应用价值。 枇杷花
花期长（11 月~翌年的 4 月）， 花朵多， 每个花序中
的花朵数量可达 80~100 朵。 但为保证枇杷果实的
产量和质量， 一般会在特定时期进行疏花， 此时的
疏花数占总花数的 95％以上[7]， 而大多数被疏的枇
杷花一般被作为垃圾处理， 这样不仅造成资源浪
费， 而且还会污染环境。 若能充分利用枇杷疏花中
的黄酮资源， 不仅能变废为宝， 并且将为天然黄酮
的开发应用提供重要的参考。
目前， 提取枇杷花中总黄酮的方法主要为热水
浸提法 [8-9]， 但此方法提取时间长、 成本高、 黄酮
易分解。 而超声波提取法利用超声波的机械作用、
空化作用和热效应， 能有效缩短提取时间、 提高提
取效率， 目前此法已广泛应用于茶粉 [10]、 杜仲叶[11]、
荔枝壳[12]及槐树叶 [13]等物质的黄酮提取步骤中。 响
应面分析法（Response Surface Methodology）以多元
热带作物学报 2012， 33（7）： 1219-1224
Chinese Journal of Tropical Crops
收稿日期： 2012-05-03 修回日期： 2012-07-02
基金项目： 公益性行业（农业）科研专项经费项目（No. 201003073）； 农业科技成果转化资金项目（No. 2010GB2C400213）； 农业部作物种质
资源保护项目（NB2011-2130135-08）； 农业部热带作物种质资源保护项目（12RZZY）。
作者简介： 周丹蓉（1983年—）， 女， 硕士， 研究实习员。 研究方向： 水果品质与功能性成分研究。 *通讯作者： 郑少泉， E-mail: zsq333555@163.com。
响应面法优化枇杷花总黄酮超声波
辅助提取工艺的研究
周丹蓉 1，2， 郑少泉 1，2*， 蒋际谋 1，2
1 福建省农业科学院果树研究所， 福建福州 350013
2 福建省龙眼枇杷育种工程技术研究中心， 福建福州 350013
摘 要 采用超声波辅助提取枇杷花中的总黄酮， 研究超声波功率、 乙醇浓度、 提取温度、 提取时间、 液料比
及提取次数对总黄酮提取得率的影响。 根据单因素试验， 选择在超声波功率 80 W、 一次浸提条件下优化提取工
艺； 采用 Box-Behnken 中心组合试验设计原理， 设计 4 因素 3 水平试验， 以响应面分析法优化乙醇浓度、 提取
温度、 提取时间及液料比 4 个因素对总黄酮提取得率的影响。 结果表明： 当超声波功率为 80 W 时， 枇杷花中
总黄酮超声波辅助提取的优化工艺参数为： 乙醇浓度 47.33％、 提取温度 58.42 ℃、 提取时间 12.01 min、 液料比
（mL ∶ g）45.56 ∶ 1， 在此条件下枇杷花总黄酮一次浸提的提取得率可达 10.48％。
关键词 枇杷花； 总黄酮； 超声波提取； 响应面分析
中图分类号 S667.3 文献标识码 A
Optimization of Ultrasonic Extraction for Flavonoids from Loquat
Flowers with Response Surface Methodology
ZHOU Danrong1,2, ZHENG Shaoquan1,2, JIANG Jimou1,2
1 Fruit Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou, Fujian 350013, China
2 Fujian Breeding Engineering Technology Research Center for Longan ＆ Loquat, Fuzhou, Fujian 350013, China
Abstract This study aimed to optimize the ultrasonic extraction method for flavonoids from Loquat flowers with
response surface methodology. Ultrasonic power, ethanol concentration, temperature, treatment time, ratio of solvent
to material and treatment times to the extracting rate of flavonoids were studied. Based on the single factor
experiments, 80 w of ultrasonic power and single extraction were chosen to further study. The interactive effects of
four crucial parameters, including ethanol concentration, temperature, treatment time and ratio of solvent to
material, were studied by central composite (Box-Behnken) and were assessed by response surface methodology
(RSM). The results showed that the optimal preparation process of flavonoids extraction was 47.33% of ethanol
concentration (V/V) and 45.56 ∶ 1 of solvent to material rate (mL ∶ g) at 58.42 ℃ for 12.01 min under the ultrasonic
power of 80 w. At this condition, the extracting rate of flavonoids from Loquat flowers could be up to 10.48% for
a single extraction.
Key words Loquat flowers; Flavonoids; Ultrasonic extraction; Response surface methodology
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2012.07.014
第 33 卷热 带 作 物 学 报
表 1 Box-Behnken 设计试验因素及水平编码
水平
X1 X2 X3 X4
乙醇浓度/％ 提取温度/℃ 提取时间/min 液料比/mL ∶ g
-1 40 50 5 30 ∶ 1
0 50 60 15 40 ∶ 1
1 60 70 30 50 ∶ 1
二次回归法作为函数估计工具， 用多项式将多因子
试验中因素与响应值的相互关系进行拟合， 通过对
函数的响应面和等高线的分析， 得出因子与响应面
之间、 因子与因子之间的相互关系。 与正交设计法
相比， 响应面分析法具有试验周期较短， 可同时研
究几种因素间交互作用等优点， 现已广泛用于物质
提取工艺的研究 [14-16]。 本研究以提高提取效率为目
的， 采用超声波法辅助提取枇杷花中的总黄酮； 并
在单因素试验的基础上， 利用响应面分析法对枇杷
花总黄酮的超声波辅助提取工艺条件进行优化。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 枇杷花采自国家果树种质福州
枇杷圃， 品种为 “新白 3 号”， 为人工疏花得到的
花及花穗， 经晒干、 粉碎后备用。
1.1.2 主要试剂 芦丁为生化试剂（纯度 HPLC≥
98％）， 购自南京替斯艾么中药研究所。 亚硝酸钠、
硝酸铝、 乙醇等均为分析纯试剂。
1.1.3 主要仪器 SK5210 超声波清洗器（上海科
导超声仪器有限公司）、 TU-1900 双光束紫外可见
分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）、
FW100 高速万能粉碎机（苏州江东精密仪器有限公
司）、 FA2004 电子分析天平（上海恒平科学仪器有
限公司）、 SHB-III 循环水式多用真空泵（上海亚荣
生化仪器厂）等。
1.2 方法
1.2.1 标准曲线的绘制 总黄酮的测定以芦丁为标
准品， 采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法 [8]。 准确称取
芦丁标准品 20 mg， 50％乙醇溶解后定容至 100 mL，
得 0.2 mg/mL 芦丁标准溶液。 精确吸取芦丁标准溶
液 0、 1.0、 2.0、 3.0、 4.0、 5.0 mL， 分别置于 10 mL
容量瓶中， 各加入 5％亚硝酸钠溶液 0.3 mL， 摇匀后
静置 6 min； 分别加入 10％硝酸铝溶液 0.3 mL， 摇
匀后静置 6min； 再分别加入 4％氢氧化钠溶液 4mL，
摇匀； 最后用 50％乙醇稀释至刻度， 静置 15 min，
以空白试剂为参比， 510 nm 下测定各标准溶液的
吸光度。 得溶液中芦丁浓度 C（mg/mL）与其吸光度
A 关系的回归方程为： C=0.087 9A-0.002 8， 相关
系数 R2=0.999 9， 说明该检测方法下芦丁溶液浓度
与吸光度呈良好的线性关系。
1.2.2 单因素试验
（1）超声波功率比较试验。 准确称取干燥的枇
杷花粉末 0.5 g， 以液料比（mL ∶ g）30 ∶ 1加入 50％乙
醇 ， 80 ℃恒温水浴 ， 分别在 0、 80、 120、 160、
200 W 功率下超声波提取 30 min， 超声波频率为
50 kHz（下同）， 混合物抽滤， 滤液定容至 50 mL。
（2）乙醇浓度比较试验。 准确称取干燥的枇杷
花粉末 0.5 g， 以液料比（mL ∶ g）30 ∶ 1， 分别加入
30％、 50％、 75％、 95％乙醇和纯水， 80 ℃恒温水
浴， 80 W 功率下超声波提取 30 min， 混合物抽滤，
滤液定容至 50 mL。
（3）提取温度比较试验。 准确称取干燥的枇杷
花粉末 0.5 g， 以液料比（mL ∶ g）30 ∶ 1 加入 50％乙
醇， 分别在 40、 50、 60、 70、 80 ℃水浴、 80 W 功
率下超声波提取 30 min， 混合物抽滤， 滤液定容至
50 mL。
（4）提取时间比较试验。 准确称取干燥的枇杷
花粉末 0.5 g， 以液料比（mL ∶ g）30 ∶1加入 50％乙醇，
60℃水浴、 80W 功率下， 超声波分别提取 5、 15、
30、 45、 60 min， 混合物抽滤， 滤液定容至 50 mL。
（5）液料比比较试验。 准确称取干燥的枇杷花粉
末 0.5 g， 分别以液料比（mL ∶ g）10 ∶1、 20 ∶1、 30 ∶1、
40 ∶1、 50 ∶1， 加入 50％乙醇， 60 ℃水浴、 80 W 功
率下超声波分别提取 15 min， 混合物抽滤， 滤液定
容至 50 mL。
（6）提取次数比较试验。 准确称取干燥枇杷花
粉末 0.5 g， 以液料比（mL ∶ g）40 ∶ 1 加入 50％乙醇，
60 ℃恒温水浴， 80 W 超声波提取 15 min， 混合物
抽滤， 滤液定容至 50 mL， 滤渣反复提取 4 次， 分
别测定每次滤液总黄酮含量， 计算每次提取所得的
黄酮占 5次提取所得总黄酮含量的比例。
1.2.3 响应面法优化试验 超声波是枇杷花中总
黄酮提取的辅助力量， 在单因素试验选取最优功率
条件后， 选取乙醇浓度、 提取温度、 提取时间、 液
料比 4 个因素， 根据 Box-Behnken 中心组合试验
设计原理， 进行 4 因素 3 水平试验， 优化提取工
艺， 因素水平见表 1。
1.2.4 总黄酮的提取 准确称取干燥的枇杷花粉
末 0.5 g 于三角瓶中， 加入特定浓度的乙醇溶液摇
匀， 在特定的温度和超声波功率下进行超声波提取
一定时间， 混合物抽滤， 滤液定容至 50 mL， 得样
1220- -
第 7 期
品溶液。
1.2.5 总黄酮的测定 取样品溶液 0.5 mL于 10 mL
容量瓶中， 以空白试剂为参比， 采用亚硝酸钠-硝
酸铝比色法测定其在 510 nm 处的吸光度。 根据标
准曲线计算所测样品溶液的质量浓度， 并计算枇杷
花中总黄酮的提取得率， 公式为：
总黄铜提取得率/％= C×V1 000×v×m ×100
（1）
式（1）中C为黄酮浓度（mg/mL）， V 为提取液定
容体积（mL）， v 为测定液体积（mL）， m 为枇杷花
质量（g）。
1.3 数据处理
采用 Excel 软件对单因素试验结果进行分析；
采用 SAS软件对试验结果进行多元回归拟合分析， 利
用 Design-Expert软件拟合绘制响应面和等高线图。
2 结果与分析
2.1 单因素试验结果与分析
2.1.1 超声波功率对提取得率的影响 由图 1可知，
使用超声波后总黄酮的提取得率高于未使用超声波时
的提取得率， 这可能主要是由于超声的机械效应迅速
破坏枇杷花细胞外壁， 利于细胞中黄酮浸出； 但过高
的超声波功率可能会对黄酮产生破坏作用， 使黄酮提
取得率随超声波功率的增大而降低， 因此以 80W的
超声波功率提取为宜。
2.1.2 乙醇浓度对提取得率的影响 试验结果表明，
随着乙醇浓度增大， 总黄酮提取得率明显提升， 但当
乙醇浓度达到 50％后， 总黄酮的提取得率反而下降
（图 2）。 原因可能是由于不同浓度乙醇溶液的极性不
同造成其他醇溶性的物质溶出， 这种物质与溶剂间的
相似相溶竞争影响了黄酮的浸出， 因此乙醇浓度选择
50％为宜。
2.1.3 提取温度对提取得率的影响 提取温度的试验
结果见图 3。 随着提取温度升高， 总黄酮提取得率增
加， 但当温度达到 60℃以后， 温度的升高使总黄酮提
取得率下降， 这可能由于随着温度升高， 黄酮发生了
分解和转化， 故选择 60℃作为提取温度。
2.1.4 提取时间对提取得率的影响 提取时间的试验
结果如图 4所示。 提取 5~15min时， 总黄酮提取得率
虽有所增加， 但幅度不大； 超过 15min后， 随着提取
时间延长， 黄酮提取得率急速下降。 这可能是由于随
提取时间增加， 超声波的机械效应及热效应随之增加，
导致黄酮被破坏的程度增加， 使得提取得率下降， 故
提取时间以15 min为宜。
乙醇浓度/％
图 2 乙醇浓度对枇杷花总黄酮提取得率的影响
8.00
7.00
6.00
5.00
4.00
3.00
2.00
水 30 50 75 95
总
黄
酮
提
取
得
率
/％
10.00
9.00
8.00
7.00
6.00
5.00
4.00
0 80 120 160 200
超声波功率/W
总
黄
酮
提
取
得
率
/％
图 1 超声波功率对枇杷花总黄酮提取得率的影响
图 3 温度对枇杷花总黄酮提取得率的影响
提取温度/℃
总
黄
酮
提
取
得
率
/％
9.00
8.50
8.00
7.50
7.00
40 50 60 70 80
图 4 时间对枇杷花总黄酮提取得率的影响
提取时间/min
总
黄
酮
提
取
得
率
/％
10.00
9.00
8.00
7.00
6.00
5.00
5 15 30 45 60
周丹蓉等： 响应面法优化枇杷花总黄酮超声波辅助提取工艺的研究 1221- -
第 33 卷热 带 作 物 学 报
总
黄
酮
提
取
得
率
/％
图 5 液料比对枇杷花总黄酮提取得率的影响
液料比/mL ∶ g
11.00
10.00
9.00
8.00
7.00
10 ∶ 1 20 ∶ 1 30 ∶ 1 40 ∶ 1 50 ∶ 1
2.1.5 液料比对提取得率的影响 由图 5可知， 液料
比为 40∶1时提取效果最佳， 故选择 40∶1为提取时所
用液料比。
2.1.6 提取次数对提取得率的影响 每次提取所得的
总黄酮占 5次所得总黄酮的比例从图 6可知， 1次浸
提总黄酮的含量已可达到 81.51％， 故试验中为了节约
成本和提高效率， 选择 1次浸提即可； 工业生产可采
用 2次浸提。
2.2 响应面分析法结果与分析
2.2.1 响应面试验结果及回归分析 以总黄酮提取得
率为响应值（Y）， 响应面试验结果见表 2。 方差分
析结果（表3）表明， X1、 X3、 X4、 X12、 X22、 X42对提
取得率的影响极显著（p<0.01）， X2、 X1X3、 X3X4对
提取得率的影响显著（p<0.05）， X1X2、 X1X4、 X2X3、
X2X4、 X32 为不显著（p>0.05）， 表明试验因素对响
应值的影响并非简单的线性关系。 采用 SAS 软件
对试验结果进行多元回归拟合分析处理， 回归方程
F 值为 12.51， 相关系数 R2=0.935 9， p<0.01， 变异
系数为 1.676 7％， 说明回归方程拟合程度较好，
试验具有很高的可信性和准确性； 失拟项（F 值为
0.087 9）不显著， 说明试验误差很小。
表 2 响应面试验设计与结果
序号 X1 X2 X3 X4 总黄酮提取得率/％
1 1 0 -1 0 9.50
2 0 -1 -1 0 10.53
3 0 0 0 0 10.77
4 1 0 1 0 10.47
5 1 1 0 0 9.18
6 0 0 1 -1 10.81
7 0 1 1 0 10.62
8 0 1 0 1 10.40
9 0 -1 0 1 10.37
10 0 0 -1 -1 10.27
11 1 0 0 -1 9.63
12 0 -1 0 -1 10.19
13 0 1 -1 0 9.88
14 0 0 0 0 10.84
15 0 1 0 -1 9.80
16 1 0 0 1 9.96
17 -1 0 0 1 10.47
18 0 0 1 1 10.38
19 -1 0 1 0 10.64
20 1 -1 0 0 9.66
21 -1 -1 0 0 10.17
22 -1 0 0 -1 9.75
23 0 0 -1 1 10.80
24 0 -1 1 0 10.60
25 -1 1 0 0 9.99
26 -1 0 -1 0 10.54
27 0 0 0 0 10.88
说明： ** 表示差异极显著（p<0.01）； * 表示差异显著（p<0.05）。
方差来源 自由度 平方和 均方 F 值 P 显著性
X1 1 0.822 5 0.822 5 27.776 5 0.000 2 **
X2 1 0.223 8 0.223 8 7.558 8 0.017 6 *
X3 1 0.337 6 0.337 6 11.402 8 0.005 5 **
X4 1 0.309 3 0.309 3 10.446 8 0.007 2 **
X1X2 1 0.022 6 0.022 6 0.762 5 0.399 7
X1X3 1 0.192 0 0.192 0 6.485 5 0.025 6 *
X1X4 1 0.039 3 0.039 3 1.328 8 0.271 5
X2X3 1 0.109 6 0.109 6 3.701 2 0.078 4
X2X4 1 0.044 6 0.044 6 1.505 2 0.243 4
X3X4 1 0.231 1 0.231 1 7.805 3 0.016 2 *
X12 1 2.006 2 2.006 2 67.751 3 <0.000 1 **
X22 1 0.998 7 0.998 7 33.728 1 <0.000 1 **
X32 1 0.002 9 0.002 9 0.097 3 0.760 4
X42 1 0.347 0 0.347 0 11.718 4 0.005 **
模型 14 5.187 4 0.370 5 12.513 3 <0.000 1 **
残差 12 0.355 3 0.029 6
失拟项 10 0.348 9 0.034 9 10.774 3 0.087 9
纯误差 2 0.006 5 0.003 2
总和 26 5.542 7
表 3 回归模型的方差分析
图 6 提取次数对枇杷花总黄酮提取得率的影响
提取次数/次
100.00
80.00
60.00
40.00
20.00
0.00
1 2 3 4 5单
次
提
取
占
总
黄
酮
提
取
得
率
的
比
例
/％
1222- -
第 7 期
采用 SAS 软件 Proc RsReg 程序删除不显著项
（p>0.05）得简化后的回归方程为： Y=10.831-0.262X1-
0.137X2 +0.168X3 +0.161X4 +0.219X1X3 -0.240X3X4 -
0.613X12-0.433X22-0.255X42。 对回归方程取一阶偏
导等于零并求解 ， 得 X1=-0.267 1、 X2=-0.158 2、
X3=-0.298 8、 X4=0.456 3， 由此得到最佳提取工艺
条件为： 乙醇浓度 47.33％、 提取温度 58.42℃、 提
取时间 12.01 min、 液料比（mL ∶ g）45.56 ∶ 1， 在此条
件下枇杷花总黄酮提取得率的预测值为 10.89％。
2.2.2 响应曲面与等高线分析 为研究因素间的
两两交互作用对总黄酮提取得率的影响 ， 利用
Design-Expert 软件拟合绘制响应面图和等高线图
（图 7~图 12）。 图 8 和图 12 表现为曲面陡峭， 两
因素间的交互作用显著； 图 10 曲面较陡峭， 提取
温度与提取时间间的交互作用小（P=0.078 4）； 图
7、 9、 11曲面缓和， 等高线为近圆形， 证明这些因
素两两间的交互作用不显著。 响应曲面与等高线分
析结果与 2.2.1方差分析结果一致。 因此， 采用超声
波浸提枇杷花中总黄酮时， 要严格控制好乙醇浓度、
提取时间及液料比， 若提取时间改变时， 要及时调
整乙醇浓度和液料比， 以得到最大提取得率。
2.2.3 验证试验 根据响应面试验所得的优化提
取工艺进行验证试验： 准确称取干燥的枇杷花粉末
0.5 g， 以液料比（mL ∶ g）45.56 ∶ 1 加入 47.33％乙醇，
58.42 ℃水浴、 超声波提取 12.01 min， 重复试验 5
次， 测得总黄酮的平均提取得率为（10.48±0.36）％，
与模型预测值（10.89％）的相对误差为 3.76％， 预
测值与实测值较接近， 说明此模型有效， 采用响应
面法得到的枇杷花总黄酮提取工艺参数可靠、 重现
性好， 具有实用价值。
11.50
11.00
10.50
10.00
9.50
70
65
60
55
50 40
45
50
55
60
提取温度/℃ 乙醇浓度/％
总
黄
酮
提
取
得
率
/％
图 7 乙醇浓度和提取温度对总黄酮提取得率影响的响应面
提取时间/min 乙醇浓度/％
总
黄
酮
提
取
得
率
/％
11.50
11.00
10.50
10.00
9.50
40
45
50
55
6025
20
15
10
5
图 8 乙醇浓度和提取时间对总黄酮提取得率影响的响应面
图 9 乙醇浓度和液料比对总黄酮提取得率影响的响应面
11.50
11.00
10.50
10.00
9.50总
黄
酮
提
取
得
率
/％
40
45
50
55
6050
45
40
35
30液料比/mL ∶ g 乙醇浓度/％
图 10 提取温度和提取时间对总黄酮提取得率影响的响应面
5
10
15
20
25
提取温度/℃提取时间/min
11.50
11.00
10.50
10.00
9.50总
黄
酮
提
取
得
率
/％
70
65
60
55
50
周丹蓉等： 响应面法优化枇杷花总黄酮超声波辅助提取工艺的研究 1223- -
第 33 卷热 带 作 物 学 报
液料比/mL ∶ g
50
45
40
35
30
11.50
11.00
10.50
10.00
9.50
总
黄
酮
提
取
得
率
/％
提取温度/℃
70
65
60
55
50
图 11 提取温度和液料比对总黄酮提取得率影响的响应面
提取时间/min液料比/mL ∶ g
50
45
40
35
30 5
10
15
20
25
11.50
11.00
10.50
10.00
9.50
总
黄
酮
提
取
得
率
/％
图 12 提取时间和液料比对总黄酮提取得率影响的响应面
3 讨论与结论
本试验通过单因素试验选定超声波功率 80 W
作为辅助浸提功率， 并采用响应面法对影响超声波
辅助提取枇杷花总黄酮的关键因素及其相互作用进
行了探讨， 建立总黄酮提取得率与乙醇浓度、 提取
温度、 提取时间、 液料比间关系的回归模型， 通过
回归模型进行参数优化， 在超声波功率 80 W 时，
得提取工艺优化参数为： 乙醇浓度 47.33％、 提取
温度 58.42℃、 提取时间 12.01 min、 液料比（mL ∶ g）
45.56 ∶ 1。 在该条件下总黄酮提取得率的实测值与
预测值较接近， 表明利用响应面法优化枇杷花总黄
酮超声波辅助提取工艺精密度高， 预测性好， 合理
可行。
黄锁义 [17]、 王明艳 [18]、 李开泉 [19]等的研究均证
明超声波技术在物质提取中具有较高效率和优越
性， 发展潜力巨大。 本试验利用响应面法对枇杷花总
黄酮的超声波辅助提取工艺进行优化， 与单因素试
验相比， 采用优化后的工艺能显著提高总黄酮的提
取得率， 为生产中提取枇杷花总黄酮提供了参考。
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责任编辑： 白 净
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