全 文 ：木疏胶囊抗大鼠肝纤维化机制
高萍，程留芳，邵泽勇，刘春
［摘要］ 目的 观察木疏胶囊对大鼠肝纤维化相关基因表达和细胞免疫的影响，探讨其抗纤维化机制。 方法 40% 四
氯化碳，皮下注射诱导大鼠肝纤维化模型。 大鼠随机分为正常对照组、模型对照组、木疏胶囊预防组和木疏胶囊治疗组、鳖甲软
肝片预防组和鳖甲软肝片治疗组。 HE 和 Masson 染色观察肝组织病理改变，RT-PCR 检测肿瘤坏死因子 α（TNF-α），α-平滑肌
肌动蛋白（α-SMA），胶原蛋白Ⅰ（Col-Ⅰ），胶原蛋白Ⅲ（Col-Ⅲ）基因表达，流式细胞术检测血 CD4、CD8 水平。结果 各用药组
与模型对照组比较，肝组织学明显改善。 木疏胶囊预防组和治疗组与鳖甲软肝片预防组和治疗组比较，α-SMA，Col-Ⅰ、Col-Ⅲ
表达显著降低（α-SMA：0.40±0.02 vs 0.64±0.04、0.51±0.05 vs 0.70±0.04，Col-Ⅰ: 0.82±0.14 vs 0.95±0.05、0.73±0.14 vs 1.04±0.14，
Col-Ⅲ：0.37±0.02 vs 0.59±0.03、0.45±0.04 vs 0.56±0.05，P＜0.05，P＜0.01），TNF-α 表达差异无统计学意义。 与模型对照组比较，木
疏胶囊预防组和治疗组 CD4 和 CD4/CD8 均显著升高(CD4: 36.42±7.45、34.57±5.03 vs 28.0±5.07，CD4/CD8：1.90±0.41、1.81±0.28
vs 1.47±0.19，P<0.01），木疏胶囊预防组和治疗组与鳖甲软肝片组比较，CD4、CD4/CD8 水平差异无统计学意义。 结论 木疏胶
囊预防和治疗用药均可使肝纤维化大鼠肝组织 TNF-α、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ基因表达下降, 升高 CD4、CD4/CD8。
［关键词］ 肝纤维化； 木疏胶囊； TNF-α； α-SMA； Col-Ⅰ； Col-Ⅲ； CD4； CD8； CD4/CD8
［中图分类号］R575.2 ［文献标识码］A doi:10.3969/j.issn.1674-3245.2011.02.022
Mechanism of anti-fibrosis in liver by mushu capsule
GAO Ping，CHENG Liu-fang，SHAO Ze-yong，et al
（Department of Oncology，General Hospital of Chinese PLA，Beijing，100853，China）
［Abstract］ Objective To investigate the mechanism underlying the antifibrotic action of Mushu capsule in rats with hepatic
fibrosis. Methods A hepatic fibrosis model was induced by subcutaneous injection of carbon tetrachloride. Wistar rats were ran-
domly divided into 4 groups：normal control group，model group，mushu capsule group （MC）and Biejia Ruangan tablet group
（BRT）. MC group and BRT group were subdivided into prevention group and treatment group. The gene expression of TNF-α，α-
SMA，Col-Ⅰ，Col-Ⅲ was detected by RT-PCR. The levels of CD4 and CD8 cells were measured by flow cytometry. Results The
gene expression of α-SMA，Col-Ⅰand Col-Ⅲ in MC prevention group was lower than that in BRT prevention and treatment group
respectively （α-SMA：0.40±0.02 vs. 0.64±0.04，0.51±0.053 vs. 0.70±0.04 Col-Ⅰ: 0.82±0.14 vs. 0.95±0.05，0.73±0.14 vs. 1.04±0.14
Col-Ⅲ：0.37±0.02 vs. 0.59±0.03，0.45±0.04 vs. 0.56±0.05）（P<0.05 or P<0.01）. while there was no difference with the expression of
the TNF -α between MC prevention group and BRT group. moreover，the expression of the TNF -α in MC treatment group was
markedly higher than that in BRT group （0.97±0.14 vs. 0.80±0.16）（P＜0.01 or P＜0.05）. The decreased serum CD4 and CD4/CD8
levels were markedly raised in MC preventing group and treatment group（P<0.01）in comparison with those in model group（CD4：
36.42±7.45，34.57±5.03 vs 28.0±5.07 CD4/CD8：1.90±0.41，1.81±0.28 vs 1.47±0.19）. The decreased serum CD4 level was markedly
raised in BRT preventing group（33.42±4.90 vs 28.0±5.07）（P<0.05），while there was no difference in BRT treatment group. BRT up-
regulated the levels of serum CD8 and CD4/CD8 cells without significant differences. The levels of CD4，CD8 and CD4/CD8 cells had
no notable difference between MC group and BRT group. Conclusions Mushu capsule has an antifibrotic effect in rats with liver fi-
brosis by decreasing the gene expression of TNF-α，α-SMA，Col-Ⅰ，Col-Ⅲ. Simultaneously，it can upregulate the levels of CD4 and
CD4/CD8.
［Key words］ Liver fibrosis； Mushu capsule； TNF-α； α-SMA； Col-Ⅰ； Col-Ⅲ； CD4； D8； CD4/CD8
肝纤维化是慢性肝病向肝硬化、肝癌发展的必
经之路，木疏胶囊是以当归、黄芪、鳖甲为主要成分
的中药复方制剂，本研究，在分子水平进一步研究
木疏胶囊对实验性大鼠肝纤维化肿瘤坏死因子 α
（TNF-α），α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、胶原蛋白
Ⅰ（Col-Ⅰ）、胶原蛋白Ⅲ（Col-Ⅲ）基因表达的影响，
并探究其对细胞免疫的调节作用，为其抗纤维化机制
提供进一步的证据。
1 材料与方法
1 . 1 材料
1 . 1 . 1 实验动物 同系 Wistar 大鼠 60 只，雌雄
各 30 只，体重（200±20）g，清洁级，解放军总医院动
物实验中心提供。
作者单位：100853 北京，解放军总医院肿瘤内科（高萍），消化科（程
留芳）；雅安市人民医院（邵泽勇）；总参军训和兵种部后
勤部卫生处（刘春）
通讯作者：程留芳，E-mail：greenpla@163.com
·论 著·
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1 . 1 . 2 药物 木疏胶囊主要成分为当归、黄芪、鳖
甲、大枣、黑豆等。 由北京宝树堂科技药业有限公司
精制而成胶囊。 鳖甲软肝片主要成分为鳖甲、三七、
赤芍、冬虫夏草、连翘等，解放军 302 医院研制，内
蒙古福瑞制药厂生产。
1 . 1 . 3 主要试剂与仪器 四氯化碳（CCl4）分析纯
（北京化学试剂公司产品，批号 000925）。总 RNA提
取试剂盒及 RNA 逆转录试剂盒由 Promega 公司提
供。 TNF-α mRNA、α-SMA mRNA、Col-Ⅰ mRNA、
Col-Ⅲ mRNA、GAPDH mRNA 引物由北京鼎国生
物技术发展中心合成。 琼脂糖粉为美国 Sigma公司
产品。 DNA Marker为美国 Sigma公司产品。 PCR仪
为美国 Perkimn-Elmer 公司产品。 恒压恒流 DF-D
电泳仪为上海仪表厂产品。 图象扫描仪为中国科学
院北京空海电子技术公司产品。 FITC 标记的大鼠
CD4 单克隆抗体，PE 标记的大鼠 CD8 单克隆抗体
由北京鼎国生物技术发展中心提供。 FACS Calibur
流式细胞仪为美国 Becton Dickson 公司产品。
1 . 2 方法
1 . 2 . 1 试剂配制 人与大鼠药物剂量换算按参
考文献［1］。 根据本课题组前期实验研究成果，选
用木疏胶囊中剂量 3.125 g/（kg·d）， 鳖甲软肝片
0.625 g/（kg·d）作为本实验的用药 ［ 2 ］。 将 CCl4分析
纯 40 ml 溶于橄榄油 60 ml 中， 配制成 40%的 CCl4
油溶液 100 ml，常温保存备用。
1 . 2 . 2 动物模型与分组 （1）肝纤维化动物模
型 ： 造模各组均于实验第 1 天皮下注射 40% CCl4
0.5 ml/100 g体重，以后每 4 d皮下注射 40% CCl4油
溶液 0.3 ml/100 g体重，连续 8周［ 3 ］。各组均用普通
饲料喂养，自由饮水。（2）预防与治疗实验：Wister大
鼠 60 只， 雌雄各 30 只， 随机分为正常对照组（10
例），模型对照组（10 例），木疏胶囊预防组（10 例），
鳖甲软肝片预防组 （10 例）， 木疏胶囊治疗组（10
例），鳖甲软肝片治疗组（10例）。 造模同时正常对照
组及模型对照组蒸馏水 5 ml/d，分 2 次灌胃；预防实
验和治疗实验，为造模同时及造模结束后，分别以木
疏胶囊 3.125 g/（kg·d）溶于蒸馏水 5 ml，分 2 次灌
胃，鳖甲软肝片 0.625 g/（kg·d）溶于蒸馏水 5 ml，分
2次灌胃，治疗 4 周。
1 . 2 . 3 标本采集 取肝左叶相同部位组织液氮快
速冷冻保存，用于 RT-PCR 法检测。 取肝右叶相同
部位组织固定于 10%中性甲醛溶液中，乙醇梯度脱
水，二甲苯透明、浸蜡包埋，4~7 μm 厚度连续切片
用于 HE和 Masson 染色行组织学观察，由资深病理
医师阅片确定肝纤维化模型是否成功。
1 . 2 . 4 RT-PCR 法 检测大鼠肝组织 TNF-α，
α-SMA，Col-Ⅰ，Col-Ⅲ、GAPDH表达。提取总 RNA，
在线设计 TNF-α，α-SMA，Col-Ⅰ，Col-Ⅲ和内参照
GAPDH 的 DNA 片段引物，送北京鼎国生物技术发
展中心合成引物。 一步法基因扩增，DNA（1.2%）琼
脂糖凝胶电泳， 将记录下来的照片扫入计算机图像
分析系统（Image tool），计算各实验组 TNF-α，α-SMA，
Col-Ⅰ，Col-Ⅲ的 DNA 片段的灰度值比值表示各因
子的基因相对表达水平。 合成引物序列见表 1。
1 . 2 . 5 CD4 和 CD8 检测 心脏取血 2 ml 迅速注
入肝素抗凝管（消毒配置好的商品化 4 ml 玻璃管），
即刻用于 CD4、CD8 检测［ 4 ］。 流式细胞术检测大鼠
血 T淋巴细胞亚群的影响。
1 . 3 统计学处理 数据采用 SPSS 13.0 统计软件
包进行分析，结果以 x±s 表示。 计量数据采用独立
样本 t检验。 P＜0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2 . 1 一般状况 造模结束时，模型对照组皮毛松
弛、嗜睡、进食减少、尿黄、趾甲及鼻腔出血。 实验结
束时，正常对照组存活良好，模型对照组死亡 1 只，
鳖甲软肝片预防组死亡 1 只，木疏胶囊预防组死亡
2只，鳖甲软肝片治疗组死亡 1 只，木疏胶囊治疗组
无死亡。
2 . 2 大鼠肝组织病理结果 肝组织病理切片组织
学观察见图 1、图 2，正常对照组肝小叶结构完整，
肝索排列整齐，汇管区无纤维化（图 1A，图 2A）；模
型对照组造模后，大鼠肝细胞浊肿，肝小叶失去正
常结构，汇管区扩大增宽，汇管区胶原沉积，可见胶
原纤维自中央静脉及汇管区向周围延伸，形成较粗
的纤维间隔， 有的已经有假小叶形成 （图 1B，图
2B）； 木疏胶囊预防组及鳖甲软肝片预防组肝小叶
结构基本正常，肝细胞无明显变性、坏死，肝索排列
指标 序列 长度（bp）
TNF-α 5-CGGGGGCCACCACGCTCTTC-3 364
5-GTGGCAAATCGGCTGACGGTGTG-3
α-SMA 5＇-GGCGCCGCTGAACCCTAAG-3＇ 370
5＇-AGCAGTGGCCATCTCATTTTCAAA-3＇
Col-Ⅰ 5＇-GTCCCCCTGGCTCTGCTGGT-3＇ 351
5＇-ATGTGCGGGCGGGGTTCTT-3＇
Col-Ⅲ 5＇-CCTAAGGGCGAAGACGGCAAAGAT-3＇ 322
5＇-CAGGAGGACCAGGGCGACCAC-3＇
GAPDH 5＇-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC- 3＇ 516
5＇-TCC ACC ACC CTG TTG CTG TA -3＇
表 1 TNF-α、α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ引物序列
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相对整齐，仅汇管区少量胶原沉积，无明显纤维间
隔形成（图 1C，图 2C，图 1E，图 2E）；木疏胶囊治疗
组、 鳖甲软肝片治疗组部分肝小叶结构排列仍紊
乱，肝细胞轻度脂肪变性，汇管区有较多胶原纤维
沉积（图 1D，图 2D，图 1F，图 2F）。
2 . 3 木疏胶囊对肝纤维化大鼠肝组织细胞因子基
因表达的影响 RT-PCR 产物经 1.2％琼脂糖凝胶
电泳鉴定，TNF-α 大小为 364 bp，α-SMA 大小为
370 bp，Col-Ⅰ大小为 351 bp，Col-Ⅲ大小为 322
bp，GAPDH大小为 516 bp，见图 3。
各组 GAPDH 表达基本无变化。 各基因表达与
GAPDH 比值，模型对照组与正常对照组比较，各指
标升高（P＜0.01），各用药组与模型对照组比较，各指
标均降低（P＜0.01）。 木疏胶囊预防组分别与鳖甲软
肝片预防组和治疗组比较，α-SMA，Col-Ⅰ，Col-Ⅲ
基因表达下调（P＜0.01），TNF-α表达无统计学差异，
木疏胶囊治疗组分别与鳖甲软肝片预防组和治疗
组比较，α-SMA，Col-Ⅰ，Col-Ⅲ表达下调 （P＜0.05，
P＜0.01），TNF-α表达上调（P＜0.05，P＜0.01）。 见表 2。
2 . 4 木疏胶囊对大鼠血 T 淋巴细胞亚群的影响
与正常对照组比较， 模型对照组 CD4 水平显著下
注：A.正常对照组；B.模型对照组；C.木疏胶囊预防组；D.木疏胶囊治疗组；
E.鳖甲软肝片预防组；F.鳖甲软肝片治疗组
图 1 各组肝组织病理学观察（HE ×100）
注：A.正常对照组；B.模型对照组；C.木疏胶囊预防组；D.木疏胶囊治疗组；
E.鳖甲软肝片预防组；F.鳖甲软肝片治疗组
图 2 各组肝组织病理学观察（masson ×100）
注：1.DNA Marker；2.正常对照组；3.模型对照组；4.木疏胶囊预防组；5.鳖甲
软肝片预防组；6.鳖甲软肝片治疗组；7.木疏胶囊治疗组。 A：TNF-α；B：α-SMA；
C：Col-Ⅰ；D：Col -Ⅲ；E：GAPDH
图 3 各组肝组织细胞因子基因表达
组别 例数 TNF-α α-SMA Col-Ⅰ Col-Ⅲ
正常对照组 10 0.695±0.156 0.335±0.040 0.510±0.136 0.280±0.014
模型对照组 9 1.659±0.068a 0.957±0.047a 1.719±0.106a 1.116±0.056a
鳖甲软肝预防组 9 0.713±0.126b 0.644±0.040b 0.952±0.048b 0.589±0.029b
木疏胶囊预防组 8 0.794±0.089b 0.396±0.020b c e 0.816±0.136b c e 0.369±0.018b c e
鳖甲软肝治疗组 9 0.803±0.156b 0.703±0.035b 1.036±0.138b 0.556±0.048b
木疏胶囊治疗组 10 0.971±0.139b c d 0.508±0.053b 0.733±0.139b c d 0.446±0.043b c e
表 2 各组 TNF-α、α-SMA、Col-Ⅰ、
Col-Ⅲ基因表达相对值（x±s）
注：与正常对照组比较 aP＜0.01；与模型对照组比较 bP＜0.01；与鳖甲软肝片预防组比
较 cP＜0.01；与鳖甲软肝片治疗组比较 dP＜0.05，eP＜0.01
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降；与模型对照比较，鳖甲软肝片治疗组 CD4 水平
无显著性变化，其余各组均升高；木疏胶囊预防组
和治疗组与鳖甲软肝片预防组和治疗组比较，CD4
水平无统计学差异。 各组比较，CD8 变化无统计学
差异。 与正常对照组比较，模型对照组 CD4/CD8 显
著下降；与模型对照组比较，各用药组 CD4/CD8 均
升高；木疏胶囊预防组和治疗组与鳖甲软肝片预防
组和治疗组两两比较，CD4/CD8 变化无统计学差
异。 见表 3。
3 讨论
肝纤维化是慢性肝病向肝硬化发展的必经之
路。 近年来，明确提出了肝纤维化完全有可能发生
逆转［ 5~7 ］。 木疏胶囊在益气养血的同时，根据辨证论
治，注重活血化瘀，兼顾扶正、补虚、利湿等，前期实
验已证实， 其前身木苏丸能有效干预肝纤维化，并
证实了部分干预机制 ［ 1 ］。 木苏丸经过制剂形式的
改进制成胶囊，本研究从基因水平进一步揭示木疏
胶囊抗大鼠肝纤维化的机制。
Wang 等 ［ 8 ］ 发现，纤维化早期肝组织内即出
现 TNF-α mRNA 高表达，因而认为 TNF-α 是炎性
反应和纤维化的重要始动因子。 本研究亦发现，模
型组肝纤维化大鼠 TNF-α 基因表达明显升高，木
疏胶囊可降低肝纤维化大鼠 TNF-α 基因表达水
平， 提示， 木疏胶囊可能通过降低肝纤维化大鼠
TNF-α 水平，减轻肝细胞损伤，减少其在肝的炎性
反应和肝纤维化中的作用，从而抑制纤维化进程。
正常情况下 ，肝星状细胞 （HSC）处于静止状
态 ，不表达α-SMA，当肝细胞受到损伤时，HSC 激
活，转化成肌成纤维样细胞，表达 α-SMA。因此本实
验中将 α-SMA 作为主要观察指标之一，并发现在
肝纤维化大鼠肝组织中 α-SMA 表达量明显增加，
与文献报道一致 ［ 9，10 ］。 经木疏胶囊防治，α-SMA
mRNA 表达下调，且肝纤维化明显改善，其作用可
能与降低 HSC活化程度有关。
胶原是细胞外基质（ECM）的主要组成成分，肝纤
维化时 ECM中胶原以 Col-I、Col-Ⅲ型胶原为主（占
ECM的 95%以上）， 胶原蛋白转录调节是胶原合成
最重要的环节［ 11 ］。木疏胶囊预防组和治疗组大鼠肝
纤维化肝组织的 Col-Ⅰ、Col-Ⅲ型胶原 mRNA 的表
达明显下降，提示其为抑制纤维化的重要途径。
研究显示，慢性肝炎、肝炎肝硬变、慢性重型肝
炎外周血 CD4+、CD8+细胞绝对计数和 CD4+/CD8+比
值均低于正常对照组和急性肝炎患者，肝硬变患者
细胞免疫功能的明显下降，是临床上肝硬变易发展
为肝癌和易并发感染的重要因素之一［ 12，13 ］。 本研究
中，肝纤维化大鼠外周血 CD4、CD4/CD8 水平下降，
反映了肝纤维化大鼠细胞免疫功能下降。 经木疏胶
囊预防和治疗，CD4、CD4/CD8均升高， 故认为木疏
胶囊可调节大鼠肝纤维化的细胞免疫功能，并因此
而发挥抗肝纤维化作用。
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（收稿日期：2010-12-14；修回日期：2011-01-04）
表 3 木疏胶囊对肝纤维化大鼠 T淋巴细胞亚群的影响（x±s）
组别 例数 CD4 CD8 CD4/CD8
正常对照组 10 44.057±5.242 22.177±3.483 2.040±0.451
模型对照组 9 27.998±5.073b 19.009±2.121 1.470±0.186b
鳖甲软肝片预防组 9 33.417±4.902b c 19.660±5.937 1.793±0.400
木疏胶囊预防组 8 36.415±7.450a d 19.427±2.952 1.896±0.409c
鳖甲软肝片治疗组 9 31.593±4.135b 19.984±2.590 1.600±0.275b
木疏胶囊治疗组 10 34.569±5.033b c 19.207±2.221 1.811±0.275c
注：与正常对照组比较 aP＜0.05，bP＜0.01；与模型对照组比较 cP＜0.05，dP＜0.01
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