全 文 ：宁海白枇杷花中酚类物质鉴定及含量测定
闫永芳 过尘杰 孙 钧 孟天真 赵春江 叶兴乾 *
（浙江大学生物系统工程与食品科学学院 杭州 310058）
摘要 运用 HPLC-PAD-MS 技术对宁海白枇杷花中酚类化合物进行定性及定量分析， 共检测到 6 种主要酚类
化合物，4 种被鉴定。其中，异槲皮苷含量最高，达到 1.536 mg/g；绿原酸 0.5550 mg/g；槲皮苷 0.5836 mg/g；槲皮素
含量较低，0.2294 mg/g。 通过回收率试验、系统稳定性试验及日间精密度试验对该方法进行验证，结果显示各物
质的回收率在 90.3％～101.2％之间，方法准确性好；各标品峰高及峰面积的变异系数均小于 1％（n=3），系统稳定
性较好；各标品保留时间的变异系数均小于 1％，日间精密度良好。 本分析方法具有快速、灵敏、准确的优点，适
用于枇杷花中酚类物质的定性及定量分析。
关键词 酚类物质； 枇杷花； HPLC-PAD-MS
文章编号 1009-7848（2012）04-0202-06
枇杷花为蔷薇科枇杷属植物枇杷（Eriobotrya
japonica Lindl.）的花，原产于我国东南部[1]。 《本草
纲目》记载，枇杷花有化痰止咳、和胃降气的功
效 [2]，具有潜在的医疗保健作用。 浙江省宁海县是
中国枇杷的主要种植区之一， 宁海白枇杷因其香
甜可口的味道而备受消费者青睐。
目前， 国内外枇杷花的研究内容主要包括三
萜皂苷 [3-5]，如 OA、UA 和苦杏仁苷的鉴定及定量
分析；张丽华等人 [6]采用 GC-MS 方法分析枇杷花
中挥发油，鉴定出挥发油的主要组分；李琪等人 [7]
对枇杷花中类黄酮物质的总量进行了研究。 而有
关枇杷花功能性酚类物质的鉴定及酚类化合物单
体的定性及定量方法在国内外文献中尚无报道。
酚类化合物属于次生代谢产物， 普遍存在于植物
界，具有显著的抗氧化活性，对人体健康有重要作
用， 如它可以通过淬灭单线态氧和清除自由基而
降低各种疾病发生的风险[8-15]。 现在自然界已发现
6 000 多种酚类化合物 [16]，并且有越来越多的酚类
物质不断被发现。 加强对枇杷花中酚类物质的研
究，不仅有利于枇杷花制品的宣传，而且可以进一
步拓展其开发领域。
本文以酚类化合物为目标物， 采用 HPLC-
PAD-MS 技术， 对宁海白枇杷花中的酚类物质进
行定性及定量分析，旨在建立一种快速、准确的分
析方法，为后续研究提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料与试剂
枇杷花采集于浙江省宁波市宁海县（北纬 29°
06～29°32，东经 121°09～122°49），树龄为 8 年。 采
集时间为 2009年 11月，果实尚未成熟。
乙腈（色谱纯），美国 Tedia 公司；绿原酸、槲
皮苷、异槲皮苷、槲皮素（纯度 98％以上），上海融
禾医药科技发展有限公司；纯净水，杭州娃哈哈公
司；其它试剂均为分析纯级。
1.2 仪器
Waters e2695 高效液相色谱仪-Waters 2998
PAD 检测器，美国 Waters 公司；RE-52AA 型旋转
蒸发仪 ， 上海亚荣生化仪器厂 ；Bruker Esquire
3000plus 质谱，德国 Bruker公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样品制备 将采集样品在 60 ℃下鼓风干
燥 2 d，磨成粉末，备用。 称取枇杷花 2 g，与 1.5
mL 甲醇混合均匀， 超声辅助提取 1 h， 随后浸渍
收稿日期： 2011-04-27
基金项目： 教育部创新工程重大项目培育资金（707034）；
浙江省重大科技专项（2008C02005-2）
作者简介： 闫永芳，女，1987 年出生，硕士生
通讯作者： 叶兴乾
Vol． 12 No． 4
Apr． 2 0 1 2Journal of Chinese Institute of Food Science and Technology
中 国 食 品 学 报第 12 卷 第 4 期
2 0 1 2 年 4 月
DOI:10.16429/j.1009-7848.2012.04.032
第 12 卷 第 4 期
15 h，再次超声辅助提取 1 h，离心（5 000 r/min，5
min），收集上清液，经 0.45 μm膜过滤。
酚类化合物定量实验 将样品（2 g）与甲醇充
分混合， 直到提取完全 （与 20％ NaOH 呈负反
应）。 提取液减压真空（30℃）浓缩至干，用甲醇溶
解。
1.3.2 HPLC-PAD-MS 定性分析 色谱分析条
件 ： 色谱柱 ：Waters C18 柱 （250 mm×4 mm，5
μm）；流动相：A液：1％乙酸水溶液；B液：乙腈。梯
度洗脱：0 min 10％B，20 min52％B。 流速 ：1 mL/
min；进样量：10 μL；柱温：30℃。检测器为 Waters
2996 二极管阵列检测器，色谱数据在 240～400 nm
范围扫描，检测波长 285 nm和 340 nm。
质谱分析条件：ESI 电离源，电喷雾离子化负
离子采集模式；扫描范围：102～1 200 m/z；毛细管
电压：4 000 V；锥孔电压：40 V；源温度：250 ℃；脱
溶剂气流：10 L/min；雾化气流量：30 psi。
1.3.3 标准曲线制作 准确称取绿原酸、 异槲皮
苷、槲皮苷、槲皮素标准品，分别置于 3 mL 容量瓶
中，用甲醇溶解后稀释至刻度，摇匀，经 0.45 μm
滤膜过滤，备用。 按照 1.3.2 节色谱条件制作标准
曲线。 以峰面积（Y）对进样量（X）进行回归，得到
回归方程：Y（绿原酸）=1149035827.07X-1693434.89，
决定系数 R2=0.9970；Y （异槲皮苷）=657907163.27X+
965178.95， 决定系数 R2=0.9974； Y （槲皮苷）=
184262500X-1632982.5， 决定系数 R2=0.9993；Y
（槲皮素标准品）=883234375X-424971.6， 决定系
数 R2=0.9921。
1.4 方法验证
1.4.1 回收率考察 将一定量的各标准品加到 1
g 样品干粉中，按照 1.3.1 节所述方法进行样品前
处理，在 1.3.2 节色谱条件下进样分析，计算各组
分的加标回收率。
1.4.2 系统稳定性及精密度考察 用甲醇溶解样
品，按照 1.3.2 节色谱条件对 4 种标准品混合液进
行检测。 系统稳定性：取标准混合液，连续进样 3
次，记录峰高和峰面积，计算变异系数。 日间精密
度：取标准混合液，在不同时间测定，每天进样 4
次，连续两天进样，记录保留时间，计算日间变异
系数。
2 结果与讨论
2.1 色谱条件优化结果
根据前人实验基础[17-20]，通过预试验比较常用
的酚类化合物流动相测定体系。试验结果表明，流
动相组成、比例、pH 对化合物的峰形、分离度及保
留时间有很大影响。 以甲醇-水为流动相时，样品
图谱中峰 3和峰 4 的分离度较低；而以乙腈-水为
流动相时，分离效果较好。 流动相的 pH对峰形也
会产生影响，选取 4％、3％、2％、1％、0.5％、0.2％乙
酸水溶液作为流动相，比较标品图谱中各峰峰形。
通过比较发现，乙酸含量在 2％以上时，各峰峰形
较差，有拖尾现象；以 1％乙酸水溶液作流动相时，
色谱峰分离度、峰形最好。流动相比例对本试验中
化合物的分离有重要的影响， 等度洗脱只能分离
得到 2～3个峰，分离不完全；梯度洗脱则可以有效
分离 6个主峰，因此本试验采用梯度洗脱。除此之
外，不同柱温对测定结果有一定的影响。在对柱温
的比较分析时发现，柱温 30℃较为适宜，因此色谱
条件设定： 流动相 A 液：1％乙酸水溶液；B 液：乙
腈。洗脱梯度：0 min 10％B，20 min52％B。柱温：30
℃。
2.2 酚类物质鉴定
在 1.3.2 节色谱条件下测定枇杷花中酚类物
质。 HPLC图谱表明，当检测波长为 285 nm 时，分
离到多种具有特征吸收的物质，其中峰 1、峰 2、峰
3、 峰 4 的保留时间分别为 3.490，6.078，7.551 和
12.913 min。 全波长扫描结果表明，峰 1 表现出酚
酸类化合物的紫外光谱特征； 峰 2～4 表现出黄酮
类化合物的紫外光谱特征。 质谱结果显示，峰 1：
355.0[M+1]+，352.8[M-1]-，确定其相对分子质量为
354，与绿原酸标准品基本一致，故判断该组分为
绿原酸。 峰 2：465[M+1]+，462.9[M-1]-，确定其相对
分子质量为 464。 正离子质谱中，该分子离子失去
一个葡萄糖中型碎片 162，形成 302.9 异槲皮苷碎
片离子，由此可判定该组分为异槲皮苷。 峰 3：449.0
[M+1]+，446.9[M-1]-，确定其相对分子质量为 448。
正离子质谱中， 该分子离子失去一个鼠李糖碎片
146，形成 302.9 槲皮苷碎片离子，由此判定该组
分为槲皮苷。 峰 4：302.9[M+1]+，300.7[M-1]-，确定
其相对分子质量为 302， 与槲皮素标准品基本一
致，故判定该组分为槲皮素。通过本试验尚不能推
宁海白枇杷花中酚类物质鉴定及含量测定 203
中 国 食 品 学 报 2012 年第 4 期
测图 2中其它峰的结构。
将峰 1、峰 2、峰 3、峰 4 及标准品的特征归纳
于表 1。 经对比分析，枇杷花中主要的酚类化合物
可鉴定为绿原酸、异槲皮苷、槲皮苷和槲皮素。
2.3 酚类物质定量分析
依据 1.3.3 节所得回归方程测定枇杷花中 4
种物质含量，结果见表 2。
0.070
0.060
0.050
0.040
0.030
0.020
0.010
0.000
AU
1
3.
51
8
2 6.
14
0 37
.5
04
412
.7
98
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00
图 1 绿原酸、异槲皮苷、槲皮苷、槲皮素混合标品在 285 nm 处的 HPLC 分离图谱
Fig.1 HPLC chromatograms of mixed standard sample at 285 nm
0.50
0.40
0.30
0.20
0.10
0.00
AU
0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00
A
13.
49
0
2
6.
07
8
37.
55
1
4 12
.9
13
B
图 2 枇杷花酚类物质在 285 nm 处的 HPLC 分离图谱
Fig.2 HPLC chromatograms of loquat flower extract at 285 nm
保留时间/min 3.518 6.140 7.504 12.798 3.490 6.078 7.551 12.913
最大吸收波长/nm 241.5 255.7 254.5 254.5 241.5 255.7 254.5 254.5
325.9 354.6 348.6 363.9 325.9 354.6 348.6 363.9
相对分子质量 354 464 448 302 354 464 448 302
1 2 3 4 1 2 3 4
化合物
样品 标准品
表 1 枇杷花中酚类化合物的 HPLC-PAD 特征参数
Table 1 HPLC-PAD parameters of chlorogenic acid， quercetin-3-o-glucoside， quercitrin and quercetin
from loquat flower extract and mixed standard sample
时间/min
时间/min
204
第 12 卷 第 4 期
酚类化合物 绿原酸 异槲皮苷 槲皮苷 槲皮素
枇杷花/mg·g-1 0.5550 1.536 0.5836 0.2294
RSD％ 1.1 1.4 1.6 1.3
表 2 枇杷花酚类物质定量测定结果（mg/g 干质量）（n=3）
Table 2 Contents of chlorogenic acid， quercetin-3-o-glucoside， quercitrin and quercetin
from loquat flower extract （mg/g dry） （n=3）
由表 2 可知， 宁海白枇杷花中异槲皮苷含量
较高，达到 1.536 mg/g，而其它品种的枇杷花未见
报道。Ferreres等人报道枇杷叶中异槲皮苷的平均
含量约为 0.00585 mg/g，果皮中异槲皮苷的平均含
量为 0.02607 mg/g， 枇杷果实中未检测到异槲皮
苷[21]。宁海白枇杷花中槲皮苷含量为 0.5836 mg/g，
显著高于 Ferreres 等人报道的枇杷叶中槲皮苷平
均含量 0.00282 mg/g [21]；其槲皮素含量较低 ，为
0.2294 mg/g， 但仍显著高于新疆野苹果叶片的槲
皮素含量 0.00516 mg/g[22]，国光苹果苹果皮的槲皮
素含量 0.0865 mg/g[23]，而国光苹果果肉中未检出
槲皮素[23]。 枇杷叶中富含绿原酸[24]，枇杷叶中的绿
原酸含量为 0.01792 mg/g[21]，新疆野苹果叶片中为
0.0005 mg/g[22]，而供试枇杷花中绿原酸含量较高，
达到 0.5550 mg/g。
2.4 方法验证结果
2.4.1 回收率 各标准品加标回收率试验结果见
表 3。 各物质的回收率在 90.3%～101.2%之间，因
此试验条件能满足枇杷花中酚类化合物含量的测
定要求，具有较高的准确度和精确度，可靠性高。
酚类物质 对照品加入量/mg 测定平均值/mg 平均回收率% RSD%
绿原酸 2.31 7.710 93.5 1.17
异槲皮苷 3.23 18.63 101.2 2.35
槲皮苷 2.10 7.944 100.4 1.04
槲皮素 1.15 3.332 90.3 1.73
表 3 回收率试验结果（n=3）
Table 3 Results of recovery tests for the spiked sample（n=3）
2.4.2 稳定性及日间精密度 稳定性试验结果见
表 4。 各组分峰高及峰面积的变异系数均小于
1％。由此看出，系统和方法的稳定性较好。日间精
密度测定结果见表 5。 结果表明，变异系数均小于
1％，精密度良好，可以满足检测要求。 试验发现用
乙醇溶解标准品时，结果误差较大，精密度较差。
经多次进样比较，用甲醇溶解标品重复性好。这可
能是由于流动相的影响以及样品在甲醇溶液中较
稳定等原因所引起的。
1 峰高/μV 627 523 619 401 625 856 0.687
峰面积/μV·s 6 190 284 6 095 001 6 162 436 0.797
2 峰高/μV 521 649 523 457 517 863 0.159
峰面积/μV·s 7 474 042 7 489 239 7 465 789 0.548
3 峰高/μV 258 001 257 897 258 247 0.070
峰面积/μV·s 3 612 139 3 618 491 3 627 795 0.218
4 峰高/μV 71 844 72 352 71 745 0.452
峰面积/μV·s 1 152 876 1 168 675 1 147 766 0.943
1 2 3
化合物 峰参数
进样次数
变异系数 CV％
表 4 稳定性试验分析
Table 4 Stable tests of the analytic methods for chlorogenic acid， quercetin-3-o-glucoside， quercitrin and quercetin
宁海白枇杷花中酚类物质鉴定及含量测定 205
中 国 食 品 学 报 2012 年第 4 期
进样次序 绿原酸/min 异槲皮苷/min 槲皮苷/min 槲皮素/min
1 3.471 6.090 7.445 12.710
2 3.478 6.090 7.454 12.714
3 3.482 6.115 7.495 12.710
4 3.484 6.132 7.450 12.645
5 3.458 6.100 7.483 12.689
6 3.460 6.110 7.477 12.647
7 3.438 6.094 7.463 12.715
8 3.466 6.112 7.476 12.791
变异系数 CV％ 0.440 0.240 0.236 0.362
表 5 保留时间日间精密度
Table 5 Inter-day precision of retention time
3 结论
1） 运用 HPLC-PAD-MS联合技术，对枇杷花
中酚类物质进行定性及定量分析。采用乙腈和 1％
乙酸水溶液作为流动相，梯度洗脱。 当柱温为 30
℃时，峰形优，各物质的峰得到较好的分离。 经方
法学验证， 各物质的回收率在 90.3％～101.2％之
间。 方法的灵敏度高，准确性和重复性好，测定结
果可信。
2） 在样品的 HPLC 分析过程中，得到 6 种含
量较高的物质，其中 4种被鉴定出来。 图 2中峰 A
和峰 B因其质谱结果较为少见， 可能为尚未发现
的新物质，今后将重点研究并鉴定其结构，测定其
含量。
3） 宁海白枇杷花中的酚类物质主要有绿原
酸 、异槲皮苷 、槲皮苷 、槲皮素 ，其含量分别为
0.5550，1.536，0.5836，0.2294 mg/g。 本文是国内首
次对枇杷花中酚类物质进行定性及定量分析，为
枇杷花的深入研究和开发提供参考。
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Identification and Determination of Phenols in Loquat Flower by HPLC-PAD-MS
Yan Yongfang Guo Chenjie Sun Jun Meng Tianzhen Zhao Chunjiang Ye Xingqian*
（College of Biosystem Engineering and Food Science， Zhejiang University， Hangzhou 310058）
Abstract Phenols in NingHai white loquat flower were identified and determined using a HPLC-PAD-MS method in
the research. Six compounds were detected and four of them were identified. The identified phenols were chlorogenic acid
（0.5550 mg/g）， quercetin-3-o-glucoside （1.536 mg/g）， quercitrin （0.5836 mg/g） and quercetin （0.2294 mg/g）. The recov-
ery test was between 90.3% and 101.2%， and the CV of stability and inter-day repeatability were lower than 1%. The
results showed that the established method was a fast， effective and accurate method to analyze phenols in loquat flower.
Key words phenols； loquat flower； HPLC-PAD-MS
宁海白枇杷花中酚类物质鉴定及含量测定 207