全 文 ：第 35卷第 4期
2004年 8月 　 　　　　　　　 中南大学学报(自然科学版)J.CENT.SOUTH UNIV.(SCIENCE AND TECHNOLOGY)　　 　　　　　　　
Vol.35　No.4
Aug.　2004
沉淀吸附法提取苦丁茶中的熊果酸
任秀莲 ,魏琦峰 ,周春山 ,钟世安 ,董朝青
(中南大学 化学化工学院 , 湖南 长沙 , 410083)
摘要:依次用碱和酸作沉淀剂 , D型树脂作吸附剂 , 研究了用沉淀-吸附法提取苦丁茶中中熊果酸的工艺。得到的优
化条件为:将苦丁茶的乙醇提取液用质量分数为 10%的 NaOH 溶液碱化至 pH 值约为 10.96 , 过滤除去多酚等杂
质 ,沉淀后 , 滤液先用体积分数为 10%的H2SO4 酸化至 pH 值为 4.00 ,再用相同体积的pH 值为4.00 的酸性水溶液
稀释 ,得到熊果酸沉淀粗产品;粗产品用甲醇溶解后 ,将样品溶液 pH 值调整为 7.07 , 洗脱液 pH 值调整为11.0 , 用
D型大孔树脂吸附 ,分步洗脱 , 收集体积分数为 90%乙醇溶液的洗脱液 , 浓缩结晶得到熊果酸产品。采用高效液
相色谱法测得沉淀分离后产品纯度为 23.12%, 回收率为 92.90%;吸附分离后产品纯度为 90.23%, 回收率为
98.02%,总回收率为 89.09%。
关键词:苦丁茶;熊果酸;大孔吸附树脂;高效液相色谱法
中图分类号:R284.2 文献标识码:A 文章编号:1672-7207(2004)04-0599-05
Separation and purification of ursolic acid from
Ilex Kudingcha by precipitation and adsorption
REN Xiu-lian , WEI Qi-feng , ZHOU Chun-shan , ZHONG Shi-an ,DONG Chao-qing
(Co llege of Chemistry and Chemical Engineering , Central South University , Changsha 410083 , China)
Abstract:Sodium hydroxide solution and sulfuric acid solution as precipitation solvents , the process of
separation and purif ication of ursolic acid form Ilex kudingcha w as studied.The optimal condi tions
w ere obtained as follow s:firstly , the alcohol leaching solut ion w as treated to pH 10.0 11.0 by sodi-
um hydroxide solution w ith mass f raction 10%, then the polyphenols w ere removed by filtering , the
filtrate was adjusted pH value to 4.0 by sulfuric acid solution with volume fract ion 10%, and w as di-
luted by acidic w ater solution(pH =4.0), the crude product of ursolic acid w as obtained;secondly , it
w as dissolved by methanol , and adsorbed in macro-porous adsorpt ion resin column , then the resin was
eluted fractionally by eluent of alcohol-water and the eluate was collected w hen pH value of the sample
is 6.0 7.0 and pH value of the eluent is 11.0;f inally , the product is obtained from the concentrate of
90% alcohol eluent.The products w ere determined by high performance liquid chromatog raphy
(HPLC).The results show that the purity of the product f rom precipitation separation and adsorpt ion
separation is 23.12% and 90.23%, respectively , the recovery is 92.90% and 98.02%, respectively.
the total recovery is 89.09%.
Key words:Ilex Kudingcha:ursolic acid;macro-porous adsorption resin;HPLC
收稿日期:2003-09-15
基金项目:湖南省科技攻关项目(00NK Y1010)
作者简介:任秀莲(1963-),女 ,内蒙古包头人 ,副教授 ,博士研究生 ,从事天然植物有效成分的提取与分离研究
论文联系人:任秀莲 ,女 ,博士研究生;电话:0731-8830833;E-mail:Weiqifeng163@163.com
　　冬青科苦丁茶具有降压 、降脂和抗癌作用。研
究结果表明 ,苦丁茶中的熊果酸是其药理活性的主
要成分之一[ 1 4] ,它不仅能降低血脂 ,还能降低肝脂 ,
是具有开发潜力的降脂 、护肝药物[ 5] 。
熊果酸是一种三萜类化合物 ,广泛存在于天然
植物中 ,在苦丁茶中含量较高[ 6] ,但很少有关于从苦
丁茶中提纯熊果酸的报道 。从其他植物中分离熊果
酸工艺 ,一种是将乙醇提取液减压浓缩后用有机溶
剂萃取 ,如氯仿 、二氯甲烷 、丙酮 、苯等 [ 7],该工艺成本
高 ,污染严重;另一种是将提取液减压浓缩 ,用硅胶
柱或交联葡聚糖凝胶柱分离富集[ 8 12] ,采用该工艺 ,
柱填料成本高 ,工艺过程复杂 ,并且常用有毒有机溶
剂作洗脱剂污染环境。因此 ,开发无毒的熊果酸分
离纯化工艺很有必要 。
大孔吸附树脂对药物提取分离效果较好[ 13] ,尤
其是对非极性或弱极性化合物具有良好的吸附分离
性能 。为此 ,采用沉淀-吸附法对苦丁茶中的熊果酸
进行分离纯化研究。
1　实　验
1.1　试剂与仪器
1.1.1　试剂
a.将苦丁茶(产自广西)在 50 ℃时烘干 ,然后粉
碎备用;
b.乙醇 、甲醇 、氢氧化钠 、硫酸等 ,为分析纯;
c.熊果酸标准品 , 购于 Sigma 公司 , 纯度为
97%;
d.D型大孔吸附树脂 ,南开大学化学试剂厂生产。
1.1.2　仪器
a.BT8100 高效液相色谱仪 BT8200;
b.紫外可见检测仪和C-R6A Chromatopac 自动
积分仪。
1.2　分析方法
1.2.1　色谱条件
Hypersil RP-C18色谱柱(直径为 10 μm),填料尺
寸(高×直径)为 250 mm ×4.6 mm ;流动相为甲醇-
醋酸-水(体积比为 90∶0.02∶10);用微滤膜过滤后 ,
超声处理 20 min;检测波长为 220 nm;流速为
0.6 mL/min;柱温为 25 ℃[ 14] 。
1.2.2　线性关系的确定
准确称取熊果酸标准品 ,甲醇溶解后配制成质
量浓度为 0.8040 g/L 的熊果酸标准溶液 ,作为测定
样品的标准溶液 。
分别移取 0.8040 g/ L 的熊果酸标准溶液 0 ,
2.0 ,4.0 ,6.0 ,8.0和 10.0 mL ,甲醇定容至 10 mL ,
配制成标准系列 。在色谱条件下 ,吸取上述溶液 ,分
别进样 6 μL ,对每种浓度下的标准系列重复测定 6
次 ,得到回归方程:
A=524 170 c-902.5 , R =0.999 6。
其中:c为熊果酸标准溶液的浓度;A 为峰面积。
1.2.3　样品的测定
样品在与标准曲线相同的色谱条件下测定 ,根
据回归方程得到样品中熊果酸的浓度。
2　结果与讨论
2.1　熊果酸的提取
称取 600 g 苦丁茶粉末 ,加入 8.4 L 90%乙醇水
溶液 ,在 85 ℃水浴上回流提取 2次 ,过滤 ,合并 2次
提取液。准确移取 5.00 mL 提取液 ,用甲醇定容至
25 mL ,作为测试样品。经测定 , 得到苦丁茶中熊果
酸的质量分数为 1.41%,提取率为 97.84%。
2.2　熊果酸的沉淀分离条件的优化
2.2.1　碱化 pH 值对熊果酸纯度和回收率的影响
取苦丁茶提取液 80 mL ,以质量分数为 20%的
NaOH 调节溶液的 pH 值分别为 9.09 , 10.09 ,
10.96 , 11.98 , 13.04 , 13.90。然后将溶液在 50 ℃
水浴中加热 10 min ,再滤去不溶物。滤液先用体积
分数为 10%的 H2SO4 酸化溶液至 pH 值为 4.00 ,再
用 pH值为 4.00的酸性水溶液稀释 ,然后在 50 ℃水
浴中加热 20 min ,室温静置 2 h 后过滤。沉淀经水
洗 、真空干燥后得到熊果酸粗产品 。准确称取
0.500 0 g熊果酸产品 ,用 5 mL 甲醇定容后测定 ,计
算产品的回收率和纯度 ,结果如图 1所示。
1—回收率;2—纯度
图 1　碱化 pH 值对熊果酸回收率
和纯度的影响
Fig.1　Influence of pH value on recovery
and purity of ursolic acid
·600· 中南大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 35卷
　　由图 1可知 ,当 pH 值为 10.96 时 ,熊果酸的纯
度和回收率都最高 ,分别为 21.94%和64.66%;当
pH值为 10.96 时 , 熊果酸酸根离子的浓度达到最
高;当继续升高溶液的 pH 值时 ,黄酮类化合物的电
离趋势增强 , 使得产品的回收率和纯度逐渐降低。
对于酸性 、碱性或两性有机化合物 ,可通过加入酸或
碱调节溶液的 pH 值来改变物质分子的存在状态(游
离型或解离型),从而使物质的溶解度发生变化 ,达
到分离的目的[ 15] 。苦丁茶中除含有熊果酸等三萜
类化合物外还有多酚类 、生物碱 、黄酮类等 ,它们的
酸碱性不同。生物碱在植物体内一般以盐的形式存
在 ,将提取液碱化时生物碱以沉淀形式析出。采用
多酚类化合物将提取液碱化时 ,采用形成的酚钠盐
不易溶于高浓度的乙醇溶液中。熊果酸和黄酮类化
合物为酸性有机化合物 ,当 pH 值在碱性范围时 ,电
离平衡向离解方向移动 ,酸根离子的浓度升高。因
此 ,将提取液碱化时 ,多酚类和生物碱进入沉淀 ,熊
果酸和黄酮类留在碱性溶液中 。
2.2.2　酸化 pH 值对熊果酸纯度和回收率的影响
为了研究酸化 pH 值对熊果酸纯度和收率的影
响 ,将 480 mL 除去多酚类后的滤液平均分成 6等
份 ,然后以 10% H2SO4 分别调节溶液的 pH 值为
0.99 , 2.02 ,3.06 , 4.00 , 5.08 , 5.98 ,再用等体积的
pH值为 4.00的酸性水溶液稀释 ,酸化 pH 值对熊果
酸纯度和回收率的影响如图 2所示 。
1—回收率;2—纯度
图 2　酸化 pH 值对熊果酸纯度和回收率的影响
Fig.2　Influence of pH value on purity and
recovery of ursolic acid in acidation
由图 2可知 ,在酸化过程中 ,当 pH 值从 0.99升
高到 4.00 时 , 产品的回收率从 53.38%升高到
91.79%,纯度从 19.47%升高到 22.89%, 表明当
pH值为 0.99 ～ 4.00时 ,升高 pH 值有利于熊果酸
析出;当 pH 值为 4.00时 ,产品的纯度和回收率都达
到最高。对于 pH 值低于 5.0的酚酸性物质 ,大部分
以非解离形式(HA)存在 ,易进入有机溶剂中[ 14] 。
2.2.3　稀释比对熊果酸纯度和回收率的影响
将 400 mL 苦丁茶提取液碱化 ,除去多酚类等杂
质后 ,再将滤液平均分成 5等份 ,然后用 10%H2SO4
调节溶液 pH 值为 4.00 ,再分别用 0.5 , 1.0 , 1.5 ,
2.0 ,2.5 倍溶液体积(即稀释比)的 pH 值为4.00的
酸性水溶液稀释 ,使熊果酸析出并沉降 ,结果如图 3
所示 。
1—回收率;2—纯度
图 3　稀释比对熊果酸纯度和回收率的影响
Fig.3　Influence of dilution ratio on purity and
recovery of ursolic acid
由图 3可知 ,在用酸性水溶液稀释滤液过程中 ,
酸性水溶液体积是影响产品纯度和收率的重要因
素。当稀释比为 0.5时 ,产品的纯度较高 ,但收率很
低 ,表明熊果酸没有完全沉淀析出;当稀释比为 1
时 ,产品的纯度和收率最高;当稀释比为 2.5 时 ,产
品的纯度和回收率都迅速下降 。表明在稀释比为 1
的酸性水溶液中 ,熊果酸沉淀较完全 ,且黄酮类化合
物对熊果酸的沉淀干扰也较小 。
2.3　熊果酸的吸附分离条件的优化
2.3.1　样品溶液 pH 值选择
将甲醇溶解的熊果酸粗产品用极性调节剂以
1∶1稀释后 ,分别调节溶液的 pH 值为 2.87 , 4.64 ,7.
07 ,9.23 ,11.25。用 D型树脂柱吸附 1 h ,水洗至无
色后 ,依次用 30%乙醇和 90%乙醇各 200 mL 洗
脱 ,收集 90%乙醇洗脱液 ,将洗脱液减压浓缩至干 ,
用 10 mL 甲醇溶解 ,测定结果如图 4所示 。
·601·第 4期　　　　　　　　　　　　　　　　　　任秀莲 ,等:沉淀吸附法提取苦丁茶中的熊果酸
图 4　样品 pH 值对熊果酸吸附量的影响
Fig.4　Influence of pH value of sample on
adsorption amount of ursolic acid
从图 4可以看出 ,当样品溶液的 pH 值为 7.07
时 ,树脂对熊果酸的吸附量最大 ,流出液中熊果酸的
含量最低 ,因此 ,当样品溶液 pH 值为 6.00 ～ 7.00时
有利于熊果酸的吸附 。当样品溶液 pH 值高于7.07
时 ,熊果酸的吸附量逐渐下降。主要是因为熊果酸
酸根离子浓度增大 ,导致熊果酸的溶解度在洗脱液
中增大 ,从而减弱了熊果酸与大孔吸附树脂的作用
力 ,不利于吸附 。
2.3.2　洗脱液 pH 值的选择
采用平行装 5根 D型树脂柱 ,将 1.31 g/L 熊果
酸富集物溶液 10.00 mL 用等体积的极性调节剂稀
释后 ,调节 pH 值为 6.58 ,吸附 1 h 后 , 用 30%乙醇
200 mL 洗脱至无色 ,再依次用 pH 值为 7 ,9 , 10 , 11 ,
12 ,13的 90%乙醇洗脱液 200 mL 洗脱至检不出三
萜类 物质 为止。 控制洗 脱液 的流 速为 1 ～
2 mL/min ,将 90% 乙醇洗脱液酸化至 pH 值为
4.00 ,过滤 ,沉淀 ,用水洗至中性后 ,甲醇溶解定容至
10.00 mL ,用外标法定量 ,结果如图 5所示 。
从图 5可知 ,洗脱液的 pH值对洗脱液的洗脱能
力有明显影响。随着洗脱液碱性的增强 ,洗脱液的
洗脱能力逐渐增强 ,当洗脱液的 pH值大于 11时 ,其
洗脱能力达到最强 。因此 ,选择洗脱液的 pH 值为
11适宜 。这是因为 ,通过改变洗脱液的 pH 值 ,使熊
果酸形成较强的离子化合物而易被洗脱[ 16] ,从而提
高了洗脱率。当洗脱液 pH 值高于 11时 ,熊果酸的
回收率达98.02%,熊果酸产品经高效液相色谱外标
法定量测定 ,纯度达 90.23%(见图 6)。
图 5　洗脱液 pH 值对熊果酸回收率的影响
Fig.5　Inf luence of pH value of eluent on purity
and recovery of sample
图 6　熊果酸产品的高效液相色谱图
Fig.6　HPLC spectrium of ursolic acid
3　结　论
a.将苦丁茶的乙醇提取液用质量分数为 10%
的 NaOH 碱化至 pH 值为 10.96 ,过滤去除多酚类等
杂质后 ,先以体积分数为 10%的 H2SO4 酸化滤液至
pH值为4.00 ,再用与相同体积的 pH 值为 4.0的酸
性水溶液稀释 ,得到熊果酸沉淀粗产品。该优化条
件得到的熊果酸纯度为 23.12%,回收率为92.90%。
b.用 pH值为 4.0的酸性水溶液稀释碱化后滤
液 ,有利于熊果酸与黄酮类杂质的分离 。
c.pH 值对熊果酸在大孔吸附树脂柱上的吸附
与洗脱有明显的影响 ,当样品溶液 pH 值为 7.07时 ,
熊果酸的吸附量最高;当洗脱液 pH值为 11.0时 ,可
使熊果酸洗脱完全 ,产品的纯度达 90.23%,回收率
达 98.02% 。
·602· 中南大学学报(自然科学版)　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 35卷
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