全 文 ：第 32 卷 第 9 期
2 0 1 4 年 9 月
中 华 中 医 药 学 刊
CHINESE AＲCHIVES OF TＲADITIONAL CHINESE MEDICINE
Vol． 32 No． 9
Sep． 2 0 1 4
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刊
DOI:10． 13193 / j． issn． 1673-7717． 2014． 09． 044
大孔吸附树脂分离纯化枇杷花总黄酮工艺研究
吴绍康1，沈先荣2，梅威威3，张娜3，葛卫红3
(1．浙江医院，浙江 杭州 310013;
2．海军医学研究所，上海 200433;3．浙江中医药大学，浙江 杭州 310053)
摘 要:目的:筛选一种适合分离纯化枇杷花总黄酮的大孔吸附树脂并确定其最佳工艺参数。方法:以总黄
酮的吸附率与解析率为指标，从 D101、AB － 8、DM301、S － 8 四种大孔吸附树脂中筛选出最佳树脂，并通过单因素
考察该树脂分离纯化总黄酮的最佳工艺条件。结果:DM301 树脂对枇杷花总黄酮具有良好的吸附分离性能，最
佳工艺参数为:上样浓度 12． 5 mg /mL，上样流速 2 mL /min，上样 pH 5． 0，树脂最大上样量 60 mg /g;最佳洗脱剂
50%乙醇，洗脱速率 3 mL /min，洗脱剂用量 10 BV。结论:在所确定的工艺条件下，DM301 树脂分离纯化枇杷花总
黄酮效果良好，以 Al(NO3)3 － NaNO2 － NaOH比色法计，产物经干燥后总黄酮质量分数最高可以达到 80%以上。
关键词:枇杷花;总黄酮;大孔吸附树脂;分离纯化
中图分类号:Ｒ284 文献标志码:A 文章编号:1673-7717(2014)09-2185-04
Studies on Separation and Purification of Total Flavones from
Loquat Flower with Macroreticular Ｒesin
WU Shaokang1，SHEN Xianrong2，MEI Weiwei3，ZHANG Na3，GE Weihong3
(1． Zhejiang Hospital，Hangzhou 310013，Zhejiang，China;2． Naval Medical Ｒesearch Institute，Shanghai 200433，China;
3． Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310053，Zhejiang，China)
Abstract:Objective:To screen the best macroporous adsorptive resin for separation and purification of Loquat flower
flavonoids and to establish the purification process parameters． Methods:Using macroporous adsorption resin adsorption
rate and desorption rate as the indexes，the best resin was screened out for enriching Loquat flower flavonoids from D101，
AB － 8，DM301 and S － 8 resin． The optimal process conditions were investigated through single factor test． Ｒesults:
DM301 resin showed good adsorption and separation property for Loquat flower flavonoids． The detailed process conditions
were as follows:sample concentration was 12． 5 mg·mL －1;sample loading rate was 2． 0 mL·min －1;pH was adjusted to
5． 0;the largest sample load was 60 mg·g －1 ． Eluent concentration was 50% with elution rate of 3 mL·min －1 and the
dosage was 10 BV． Conclusion:DM301 type resin showed good purification effect for Loquat Flower flavonoids in the de-
fined conditions． The content of total flavonoids in the dried matter could increase to 80% above measured by Al(NO3)3
－ NaNO2 － NaOH colorimetric method．
Key words:Loquat flower;total flavones;macroporous resin;separation and purification
收稿日期:2014 － 04 － 23
基金项目:全军医学科技“十二五”重大项目(AS11J003 － 11)
作者简介:吴绍康(1987 －) ，男，硕士研究生，研究方向:中药药理
与新产品开发研究。
通讯作者:沈先荣(1965 －) ，男，研究员，博士研究生导师，研究方
向:海洋药物及中药研究。E-mail:xianrong-sh @ 163．
com。
葛卫红，男，教授，博士研究生导师，研究方向:中药药理
与新产品开发研究。
黄酮类化合物是中药中的一类重要成分，在植物体内
大部分与糖结合成苷，具有清除自由基、抗氧化［1］、抗病
毒［2］、保肝［3］、治疗心血管疾病［4］等多种生物活性。枇杷
花又名土冬花，为蔷薇科植物枇杷(Eriobotrya japonica
(Thunb．)Lindl．)的干燥花蕾及花序;据报道，枇杷花中含
有丰富的黄酮类物质，约为 160 mg /g干花［5］，且气味芳香、
廉价易得，近年来逐渐成为研究热点。大孔吸附树脂具有
稳定性高、选择吸附性强、再生简便等优点［6］，广泛应用于
多种黄酮类化合物的分离纯化。本文通过比较研究，筛选
出了一种对枇杷花总黄酮具有良好富集效果的大孔吸附树
脂并确定了最佳工艺参数，为枇杷花资源的深入开发提供
一定参考。
1 材 料
1． 1 药材与试剂 枇杷花，上海沪香果业专业合作社提
供，经上海中医药大学生药学教研室赵志礼教授鉴定为蔷薇
科枇杷属植物枇杷［Eriobotrya japonica (Thunb．)Lindl．］的
干燥花蕾;D101、AB － 8 型大孔树脂，沧州宝恩化工有限公
司;DM301、S －8型大孔树脂，天津市海光化工有限公司;芦
丁标准品，批号:20130629，中国食品药品检定研究院;其他
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试剂均为国产分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司。
1． 2 仪器 TB － 214 精密电子天平(北京赛多利斯仪器系
统有限公司);Allegratm 64r Centrifuge 高速离心机(Beck-
man) ;XW －80A微型涡旋混合仪(上海沪西分析仪器厂) ;
BPZ － 6050 真空干燥箱(上海和呈仪器制造有限公司) ;759
型紫外 －可见光分光光度计(上海奥普勒仪器有限公司)。
2 方法与结果
2． 1 枇杷花总黄酮的提取 按照实验室正交试验建立的
枇杷花总黄酮最佳提取工艺进行制备:准确称取一定量经
干燥的枇杷花，以水为提取溶剂，在温度 100 ℃，时间 2． 5
h，料液比 1 ∶ 20 的条件下回流提取 3 次;过滤，合并滤液，
9000 r /min离心 30 min，取上清，浓缩干燥得枇杷花总黄酮
粗提物。
2． 2 总黄酮含量测定方法的建立 采用 Al(NO3)3 －
NaNO2 － NaOH比色法
［7］。精密称取芦丁标准品 25． 0 mg，
甲醇溶解并定容至 25 mL，摇匀;精密移取 5． 0 mL 至 100
mL容量瓶中，蒸馏水定容至刻度，即得到浓度为 0． 05 mg /
mL的芦丁标准品溶液。分别吸取 0． 0、0． 4、0． 8、1． 6、2． 4、
3． 2、4． 0 mL标准品溶液，加蒸馏水补足至 4． 0 mL;依次加
入 5%亚硝酸钠溶液 0． 2 mL，摇匀静置 6 min;10%硝酸铝
溶液 0． 2 mL，摇匀静置 6 min;4%氢氧化钠溶液 1． 6 mL，混
匀后静置 15 min，于紫外分光光度计 510 nm处测定吸光度
值。以芦丁浓度(C)为横坐标，吸光度值(A)为纵坐标，绘
制标准曲线。经计算得回归方程为 A = 0． 0069C + 0． 0022，
相关系数 Ｒ2 = 0． 9999，说明芦丁在 0． 00 ～ 0． 05 mg /mL 浓
度范围内与吸光度线性关系良好。样品经稀释后，按上述
方法进行总黄酮含量测定。
2． 3 大孔吸附树脂预处理 取 D101、AB － 8、DM301、S －
8 型大孔吸附树脂，95%乙醇浸泡 24 h，湿法装柱。依次用
95%的乙醇以 2 BV /h(BV为树脂的体积倍数)的流速冲洗
层析柱，至流出液加 2 倍蒸馏水不产生明显浑浊为止;2 ～ 3
BV的 5%盐酸溶液浸泡并冲洗层析柱，以蒸馏水洗至流出
液呈中性;2 ～ 3 BV 的 5%氢氧化钠溶液浸泡并冲洗层析
柱，以蒸馏水洗至流出液呈中性，备用。
2． 4 静态吸附与解析 分别称取预处理的 4 种大孔吸附
树脂 5 g，置 100 mL具塞三角瓶中，各加入 10 mg /mL 的样
品液 30 mL，摇床震摇 2 h，静置 24 h;过滤，蒸馏水洗去表
面未吸附样品，收集滤液及水洗液，按 2． 2 项下方法测定总
黄酮浓度，计算静态吸附率。向上述静态吸附后的树脂中
加入 100 mL 50%乙醇溶液，摇床震摇 6 h 使其充分解析，
测定解析液中总黄酮浓度，计算静态解析率，见表 1。
表 1 静态吸附结果
树脂类型 吸附率(%) 解析率(%)
D101 76． 77 92． 33
AB － 8 76． 17 89． 93
DM301 77． 24 92． 03
S － 8 93． 06 10． 99
静态吸附率 =(1 － C2V2 /C1V1)× 100%
静态解析率 =［C3V3 /(C1V1 － C2V2) ］× 100%
式中，C1为吸附前样品液中总黄酮浓度，C2为吸附后样
品液中总黄酮浓度，C3为解析液中总黄酮浓度，单位 mg /
mL;V1为吸附前样品液的起始体积，V2为吸附后残液及水
洗液体积，V3为解析液体积，单位 mL。
4 种大孔树脂中，S － 8 树脂的静态吸附率最高，但是解
析率很低;而 D101 与 DM301 两种树脂的静态吸附率、解析
率均较高且接近。进一步比较发现，相同条件下 DM301 的
吸附速率要明显快于 D101，见表 2。
表 2 D101 与 DM301 吸附残液中总黄酮
吸光度随时间下降情况比较
吸附时长(h) A510(D101) A510(DM301)
0． 00 1． 018 1． 018
0． 25 0． 632 0． 592
0． 50 0． 571 0． 509
1． 00 0． 522 0． 481
2． 00 0． 434 0． 407
4． 00 0． 327 0． 327
2． 5 动态吸附与解析 分别称取预处理的 4 种大孔吸附
树脂 5 g，湿法装柱;各加入 10 mg /mL的样品液 30 mL于柱
顶，以相同流速进行动态吸附;吸附结束后，蒸馏水冲洗树
脂床中未吸附成分，收集流出液及水洗液，按 2． 2 项下方法
测定总黄酮浓度，计算动态吸附率。将上述充分吸附后的
树脂，依次用体积分数为 10%、30%、50%、75%的乙醇以
相同流速进行动态解析，测定解析液中总黄酮浓度，计算动
态解析率，见表 3。
表 3 动态吸附结果
树脂类型 吸附率(%) 解析率(%)
D101 91． 03 92． 88
AB － 8 87． 71 91． 21
DM301 91． 87 91． 33
S － 8 90． 44 30． 50
动态吸附率 =(1 － C5V5 /C4V4)× 100%
动态解析率 =［C6V6 /(C4V4 － C5V5) ］× 100%
式中，C4为吸附前样品液中总黄酮浓度，C5为吸附后样
品液中总黄酮浓度，C6为解析液中总黄酮浓度，单位 mg /
mL;V4为吸附前样品液的起始体积，V5为吸附后残液及水
洗液体积，V6为解析液体积，单位 mL。
由表 3 可以看出，4 种大孔树脂的动态吸附及解析行
为与静态时基本一致，经过综合比较，最终选择 DM301 作
为纯化枇杷花总黄酮的最佳树脂。
2． 6 泄露曲线的考察 准确称取 DM301 大孔吸附树脂 5
g，湿法装柱;将浓度为 10 mg /mL 的样品液以 2 mL /min 流
速上样，至流出液与上样液浓度基本一致时停止上样;每处
理 1 BV样品液收集一次流出液，共收集 40 BV，依次测定
总黄酮含量，绘制泄露曲线，见图 1。
从 1 BV 开始，树脂已经开始发生轻微泄露，随着上样
量的增加，泄漏量逐渐增大;当上样量至 40 BV 时，流出液
中总黄酮浓度已基本接近上样液浓度，树脂达到吸附饱和，
经计算得最大饱和吸附量约为 150 mg /g树脂。
2． 7 上样量的考察 配制 10 mg /mL的样品液 200 mL，分
成体积为 20、30、40、50、60 mL的溶液 5 份，以 2 mL /min的
流速过柱，3 BV蒸馏水洗柱;收集流出液及水洗液，测定总
黄酮含量，计算吸附率，见图 2。
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图 1 树脂泄露曲线
图 2 上样量对吸附率的影响
上样量越小，树脂对样品的吸附越好，但上样量太小，
树脂的利用率太低;上样量太大，样品则得不到有效吸附而
浪费掉。结合实际情况选择最佳上样量为 60 mg /g 树脂，
约为树脂饱和吸附量的 2 /5。
2． 8 吸附速率的确定 配制 10 mg /mL的样品液 150 mL，
均分成 5 份，分别以 1． 0、2． 0、3． 0、4． 0、5． 0 mL /min的速率
过柱，3 BV蒸馏水洗柱;收集流出液及水洗液，测定总黄酮
含量，计算吸附率，见图 3。
图 3 吸附速率对吸附率的影响
上样速率越小，树脂吸附越完全，但速率过小，上样时
间就会较长。由图 3 可知，当吸附速率由 1． 0 mL /min提高
到 2． 0 mL /min时，吸附率只是略微下降，时间却节省一半，
故最佳吸附流速选择 2． 0 mL /min。
2． 9 上样浓度的考察 准确称取 1500 mg 样品，配制成
100 mL溶液，均分为 5 份，再分别将浓度稀释为 5． 0、7． 5、
10． 0、12． 5、15． 0 mg /mL，然后均以 2 mL /min的速率上柱，3
BV蒸馏水洗柱;收集流出液及水洗液，测定总黄酮含量，计
算吸附率，见图 4。
若上样浓度太稀，溶液通过树脂床速度会相对加快，传
质未进行彻底即可能泄露;若上样浓度太浓，则黏度较大，
图 4 上样浓度对吸附率的影响
黄酮向树脂内部传质速度减慢，易造成树脂周围的黄酮过
多，使得有些黄酮尚未吸附便流出来［8］。由图 4 可以看出，
上样浓度为 12． 5 mg /mL时树脂的吸附率达到最佳。
2． 10 上样液 PH的考察 配制 12． 5 mg /mL的样品液 120
mL，均分成 5 份，用 1%的盐酸和 1%的氢氧化钠溶液将 PH
调节至 2． 0、3． 0、4. 0、5． 0、6． 0，然后以 2 mL /min 的速率过
柱，3 BV蒸馏水洗柱;收集流出液及水洗液，测定总黄酮含
量，计算吸附率，见图 5。
图 5 上样 pH对吸附率的影响
当 pH ＜ 5 时，溶液变得浑浊，可能是由于在酸性条件
下黄酮苷发生了部分水解;当 pH = 6 时，吸附率较 PH = 5
时有所降低。由于原液 PH 约为 5． 37，且澄清度及吸附率
均已较好，故不再需要调节上样 pH。
2． 11 洗脱溶剂的选择 配制 12． 5 mg /mL 的样品液 120
mL，均分为 5 份，以 2 mL /min 的速率上柱，3 BV 蒸馏水洗
柱，收集流出液及水洗液;依次用 10%、30%、50%、75%、
95%的乙醇溶液各 10 BV，以 3 mL /min 的速率洗柱;收集
洗脱液，测定总黄酮含量，计算解析率，见图 6。
图 6 洗脱剂浓度对解析率的影响
由图 6 可知，当乙醇体积分数为 50%时，便可将大约
90%的黄酮类成分洗脱下来;但当乙醇浓度继续升高时，解
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析率反而下降，且洗脱液中观察到絮状沉淀，可能是由于水
提物极性较大，在浓度较高的乙醇溶液中溶解度降低所致。
2． 12 洗脱流速的确定 配制 12． 5 mg /mL 的样品液 120
mL，均分为 5 份，以 2 mL /min 的速率上柱，3 BV 蒸馏水洗
柱，收集流出液及水洗液;然后分别用 10 BV 50%的乙醇溶
液以 0． 5、1． 0、2． 0、3. 0、4． 0 mL /min的速率洗柱;收集洗脱
液，测定总黄酮含量，计算解析率，见图 7。
图 7 洗脱速率对解析率的影响
不同洗脱流速对洗脱率略有影响。流速太慢，洗脱效
率较低;流速太快，则可能造成溶质分子与洗脱溶剂之间来
不及扩散充分便发生泄露。综合来看，当洗脱速率为 3
mL /min时，洗脱率与洗脱效率均较高。
2． 13 洗脱剂用量的考察 配制 12． 5 mg/mL 的样品液 24
mL，以2． 0 mL/min的速率上柱，3 BV蒸馏水洗柱，收集流出液
及水洗液;再用 50%乙液以 3 mL/min速率洗至流出液澄清为
止，每 1 BV收集 1份，测定总黄酮含量，绘制洗脱曲线;分别将
各份洗脱液浓缩干燥，计算干燥后总黄酮的质量分数。
图 8 树脂洗脱曲线
当洗脱剂用量增加到 10 BV 时，洗脱液中总黄酮浓度
已基本不再变化，为了节约洗脱剂，提高效率，选择洗脱剂
最佳用量为 10 BV;在上述条件下，经干燥后总黄酮质量分
数最高者可以达到 80%以上。
3 讨 论
D101、AB － 8、DM301、S － 8 分别为非极性、弱极性、中
极性、极性大孔吸附树脂。一般来说，非极性树脂适于从极
性溶剂中吸附非极性物质，极性树脂适于从非极性溶剂中
吸附极性物质;中极性大孔树脂含有酯基，其表面兼有亲水
与疏水两部分，既可在极性溶剂中吸附非极性化合物，又可
在非极性溶剂中吸附极性化合物，适用于分离极性较大的
水提物成分［9 － 10］。
DM301 型大孔吸附树脂是苯乙烯型中极性共聚体，经
比较发现，其对枇杷花水提物中总黄酮具有吸附量大，吸附
效率高，解析速度快等优点。最佳上样条件为:上样浓度
12． 5 mg /mL，上样流速 2 mL /min，上样 pH 5． 0，上样量 60
mg /g树脂;最佳洗脱条件为:洗脱剂 50%乙醇，洗脱速率 3
mL /min，洗脱剂用量 10 BV。在放大试验中，可以通过适当
调节上样速率与洗脱速率，以不同浓度乙醇进行梯度洗脱
的方式实现对枇杷花总黄酮的最佳分离。
另外，由于水提物成分复杂，某些潜在因素可能会对比
色法结果产生一定干扰。因此，本实验中总黄酮的检测方
法还有待于进一步优化与改进。
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60 － 64．
英卫生部列出 5 大健康杀手
英国卫生部日前指出，心脏病等 5 类疾病是英国人的
主要健康杀手，加强对这些疾病的防治将有望在 2020 年前
减少 3 万个死亡病例。
英国卫生大臣杰里米·亨特当天在议会讲话中说，心
脏病、癌症、中风、呼吸道疾病和肝病是英国人的 5 大健康
杀手，这些疾病每年造成超过 15 万名 75 岁以下英国人死
亡。对其采取有针对性的行动，将有望提高英国人的健康
水平，延长预期寿命。作为系列行动的一部分，亨特当天宣
布启动一项心血管疾病防治计划，包括改进心脏病急救水
平、改善心血管疾病检测和患病风险管理等。
英国医学刊物《柳叶刀》网站当天也发布一份报告指
出，尽管过去 20 年中英国人的预期寿命延长了 4． 2 岁，但
与其他富裕国家相比，英国人的健康状况、20 岁至 54 岁人
口死亡率等指标较为落后。报告建议，英国需重新重视药
物误用问题，降低国民的食盐摄入量，注重从社会和经济方
面应对国民键康问题。
针对这份报告提到的问题，卫生大臣亨特希望改革后
的国家医疗服务系统能迎接挑战，改变目前表现不佳的状
况。亨特认为，除了指责医疗系统的工作以外，英国人自身
也应作出改变，保护身体健康，如戒除吸烟、酗酒等不良生
活习惯，多参加户外运动。