全 文 ：DOI: 10.3781/j.issn.1000-7431.2013.03.
Copyright© 2013 by TUMOR
连翘根醇提物体外诱导TE-13细胞凋亡的机制研究
颜　晰1, 2，赵连梅1，刘月彩3，王　玲1，单保恩1
1.河北医科大学第四医院科研中心，河北 石家庄　050011；2.河北医科大学第四医院检验科，河北 石家庄　
050011；3.河北医科大学第一医院 检验科，河北 石家庄　050031
[ 摘要 ]　目的：从基因及蛋白水平探讨连翘根醇提物（ethanol extract of Forsythia suspensa root，FSEER）诱导
人食管癌 TE-13 细胞凋亡的作用机制。方法：不同质量浓度的 FSEER（0.4、0.5 和 0.6 mg/mL）作用于 TE-13
细胞 24 h 后，采用 FCM 检测线粒体膜电位的变化；蛋白质印迹法检测细胞凋亡相关蛋白 [caspase-3、caspase-8、
caspase-9 和细胞质中细胞色素 C（cytochrome-C，Cyt-C）] 经 FSEER 处理后在 TE-13 细胞中的表达情况；同
时通过 RT-PCR 检测细胞凋亡相关基因 Bax、Bad、Noxa、Bcl-2、Bcl-xl 和 Mcl-1 mRNA 的表达情况。结果：
TE-13 细胞经 FSEER（0.4、0.5 和 0.6 mg/mL）作用 24 h 后，随 FSEER 作用浓度的升高，发生线粒体膜电位损
伤的细胞数目逐渐增多，且明显多于对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。蛋白质印迹法检测结果显示，经
FSEER 处理后，TE-13 细胞中 cleaved caspase-3 和 cleaved caspase-9 的表达水平及细胞质中 Cyt-C 的表达水平均
逐渐增加，与对照组相比，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；而 caspase-8 的表达水平则无明显变化，与对照组相比，
差异无统计学意义 。RT-PCR 检测结果显示，FSEER 可以上调 TE-13 细胞中 Bax、Bad 和 Noxa mRNA 的表达水平，
下调 Bcl-2、Bcl-xl 和 Mcl-1 mRNA 的表达水平。结论：FSEER 可能是通过依赖于线粒体的细胞凋亡内源途径而
诱导人食管癌 TE-13 细胞发生凋亡的。
[ 关键词 ]　食管肿瘤；连翘属；植物提取物；细胞凋亡；TE-13细胞
[中图分类号]　R735.35 [文献标志码] A [文章编号]　1000-7431 (2013) 03-0239-06
The mechanism of apoptosis of TE-13 cells induced by ethanol extract of Forsythia suspensa root
in vitro
YAN Xi1, 2, ZHAO Lian-mei1, LIU Yue-cai3, WANG Ling1, SHAN Bao-en1
1. Research Center, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China; 2.
Clinical Laboratory, Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, Hebei Province, China; 3.
Clinical Laboratory, First Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050031, Hebei Province, China
[ABSTRACT]　Objective: To investigate the probable mechanism of FSEER (ethanol extract of Forsythia
suspensa root)-induced apoptosis of esophageal cancer TE-13 cells in vitro . Methods: Change of
mitochondrial membrane potential in TE-13 celsl after treatment with different concentrations of FSEER
(0.4, 0.5 and 0.6 mg/mL) for 24 h was examined by FCM (fl ow cytometry). The expressions of apoptosis-
associated proteins [cleaved caspase-3, caspase-8, cleaved caspase-9 and Cyt-C (cytochrome-C)]
in esophageal cancer cells after FSEER treatment were detected by Western blotting. The expression
levels of Bax, Bad, Noxa, Bcl-2, Bcl-xl and Mcl-1 mRNAs in TE-13 cells after treatment with different
concentrations of FSEER for 24 h were detected by RT (reverse transcription)-PCR. Results: FSEER (0.4, 0.5
and 0.6 mg/mL for 24 h) can signifi cantly reduce the mitochondrial membrane potential of TE-13 cells
in a dose-dependent manner, as compared with the TE-13 cells without any treatment (P < 0.05). The
result of Western blotting showed that the expression levels of cleaved caspase-3, cleaved-caspase-9
and Cyt-C in TE-13 cells after FSEER treatment were signifi cantly increased but the expression level of
caspase-8 had no change as compared with those of the TE-13 cells without any treatment (P < 0.05).
RT-PCR showed that FSEER could up-regulate the expression levels of Bax, Bad and Noxa mRNAs and
down-regulate the expression levels of Bcl-2, Bcl-xl and Mcl-1 mRNAs. Conclusion: The underlying
[ 基金项目 ] 河北省中医药管理局科研计划资助项目（编号: 2011011）
Correspondence to: SHAN Bao-en（单保恩）
　　　　　E-mail: baoenshan@yahoo.com.cn
Received　2012-11-23　　Accepted　2013-01-16
06
肿瘤 2013 年 3 月第 33 卷第 3 期　TUMOR Vol. 33, March 2013　　www.tumorsci.org 239
基础研究·Basic Research
连翘（Forsythia suspensa）是一种常用的中
药材，始载于《神农本草经》，为常用 40 种大宗
药材之一，应用广泛且用量较大。现代药理学对
连翘生物学活性的研究主要集中于其抗炎、抗氧
化、抗病毒、抗菌及舒张心血管等方面的功效 [1-6]。
临床上，连翘也可与其他中草药制成配方，应用
于头颈部肿瘤、乳腺癌、食管癌、胃癌、宫颈癌
和白血病等多种肿瘤的治疗，是一味具有进一步
开发利用前景的中药材 [7-9]。有关连翘提取物的
抗肿瘤功能 , 近年来已有较多报道，连翘乙醇提
取物对体外培养的小鼠肝癌细胞 H22、人肝癌细
胞 SMMC-7721、人结肠癌细胞株 LoVo 和人胃
低分化腺癌细胞 BGC-823 等肿瘤细胞的增殖均
有明显的抑制作用 [10-12]。张明远等 [13] 同样证实，
连翘乙醇提取物对 H22 荷瘤小鼠体内肿瘤生长有
抑制作用，但这些研究仅限于其抑制肿瘤生长的
作用，而对其作用机制的研究都不够深入，尤其
是针对连翘不同部位提取物抗肿瘤活性的研究尚
未见报道。本课题前期研究结果显示，连翘根醇
提物（ethanol extract of Forsythia suspensa root，
FSEER）对食管癌细胞 TE-13 的增殖具有明显
的抑制作用，且呈现浓度和时间依赖性，其抗肿
瘤作用可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关 [14]。本研究
将进一步了解 FSEER 对体外培养 TE-13 细胞凋
亡的影响，旨在揭示其抗肿瘤的作用机制，为其
临床应用提供进一步的科学依据。
1　材料与方法
1.1　材料和试剂　中药连翘采购自河北省邯郸市
武安县，经邯郸市药品监督管理局鉴定为地道本
地产药材；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材
料有限公司；RPMI 1640 培养液和胰蛋白酶购自
美国 Gibco 公司；DMSO 购自天津市永大化学试
剂开发中心；线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）
购自江苏碧云天生物技术有限公司；细胞总蛋白
提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；细胞
质蛋白提取试剂盒和细胞总蛋白提取试剂盒购自
南京凯基生物科技发展有限公司；Lowry 蛋白测
定试剂盒购自南京建成生物工程研究所；兔抗人
caspase-3、caspase-9、细胞色素C（cytochrome-C，
Cyt-C）多克隆抗体及兔抗人 caspase-8 单克隆抗
体购自美国 Cell Signaling 公司；RT-PCR 二步
法试剂盒购自美国 Promega 公司；所有引物由生
工生物工程（上海）有限公司合成。
1.2　FSEER的制备　连翘根粉碎后称取 10 g，
加入无水乙醇溶液 100 mL，室温下浸泡过夜，
加热水浴回流提取 2 次，每次 1 h，合并上清液，
447×g 离心 20 min，取上清液，用旋转冷冻
蒸发器蒸发干燥，所得干粉即为 FSEER。使用
时，首先用 75% 乙醇溶液溶解，并控制乙醇溶
液的终体积分数＜ 0.1%，再用 RPMI 1640 培
养液稀释到所需的质量浓度，经无菌滤器除菌，
4 ℃保存备用。
1.3　细胞培养　食管癌细胞株 TE-13 用含 10% 胎
牛血清的 RPMI 1640 培养液（含青霉素 100 U/mL
和链霉素 100 μg/mL），置于 37 ℃、CO2 体积分数
为 5% 的饱和湿度培养箱中培养，以 0.25% 的胰蛋
白酶消化细胞并传代，每 1～ 2 d 换液 1次，取对
数生长期的细胞用于实验。
1.4　线粒体膜电位的检测　采用不同质量浓度
的 FSEER（0.4、0.5 和 0.6 mg/mL） 分 别 处 理
TE-13 细胞 24 h 后（同时设未用 FSEER 处理组
为对照， 对照组中加入等体积的 RPMI 1640 培
养液），收集实验组和对照组细胞，PBS 充分洗
涤后，分别重悬于 0.5 mL 细胞培养液中，调整
细胞密度为 1×106 个 /mL，按 JC-1 试剂盒操作
流程处理细胞后，用流式细胞仪检测细胞线粒体
膜电位的变化情况。
1.5　蛋白质印迹法　取对数生长期的 TE-13 细
胞，采用不同质量浓度的 FSEER（0.4、0.5 和
0.6 mg/mL）分别处理细胞 24 h 或用 FSEER（0.6
mg/mL）处理细胞 6、12 和 24 h 后（2 个实验
均以未用 FSEER 处理组为对照），分别提取各组
细胞的总蛋白及细胞质蛋白，用 Lowry 蛋白测定
试剂盒测定各组蛋白浓度。蛋白样品各取 75 μg，
经 10% SDS-PAGE 分离蛋白，湿电转移至聚偏
二氟乙烯膜上，室温下封闭 2 h，加入相应的一
抗 [ 兔抗人 caspase-3 多克隆抗体（1 ：2 000 稀
释）、兔抗人 caspase-8 单克隆抗体（1 ：2 000 稀
释）、兔抗人 caspase-9 多克隆抗体（1 ：2 000 稀
释）、兔抗人 Cyt-C 多克隆抗体（1 ：300 稀释）]，
4 ℃孵育过夜，洗膜后加入二抗（1 ：20 000稀释），
室温孵育 2 h，用红外成像显影，以 GAPDH 为
内参照分析目标蛋白的表达。
1.6　RT-PCR 检测细胞中凋亡相关基因的表
达　采用不同质量浓度的 FSEER（0.4、0.5 和
0.6 mg/mL） 处 理 TE-13 细 胞 24 h 后（ 未 用
FSEER 处理组作为对照），收集各组细胞，用
TRIzol 试剂提取细胞总 RNA，检测样本D260 nm
mechanism of FSEER-induced apoptosis of TE-13 cells may be related to the mitochondria-dependent
pathway.
[KEY WORDS]　Esophageal neoplasms; Forsythia; Plant extract; Apoptosis; TE-13 cells
颜　晰，等 . 连翘根醇提物体外诱导 TE-13 细胞凋亡的机制研究240
和D280 nm 的比值，并计算 RNA 的浓度。应用美
国 Promega 公司的反转录试剂盒将总 RNA 反
转 录 为 cDNA， － 20 ℃ 保 存。 采 用 PCR 扩 增
检 测 Bax、Bad、Noxa、Bcl-2、Bcl-xl 和 Mcl-1
mRNA 的表达。引物序列见表 1。
PCR 扩增条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变
性 30 s、相应退火的温度（表 1）30 s、72℃延伸
50 s，共 35 个循环；最后 72 ℃延伸 5 min；4 ℃
终止反应。PCR 产物经 1.5% 琼脂糖凝胶电泳分
离，紫外灯下观察并拍照，扩增产物以GAPDH
基因作为内参照，采用Gel-Pro Analysis 3.1软件
分析条带光亮度，mRNA 表达相对值＝目的片段
灰度值 /GAPDH 灰度值。
1.7　统计学方法　所有数据采用 SPSS 13.0 软件
进行统计学分析。所有实验均重复 3 次，结果数
据用 ± s 表示。多组间比较采用单因素方差分析，
两组间比较采用LSD 检验，以P ＜ 0.05 为差异
有统计学意义。
表 1　引物序列
Table 1　The primer sequences for RT (reverse transcription)-PCR
Gene Primer sequence Annealing temperature/℃ Length/bp
Bax 5’-AAGCTGAGCGAGTGTCTCAAG-3’ 57 178
5’-CAAAGTAGAAAAGGGCGACAAC-3’
Bad 5’-GTTCCAGATCCCAGAGTTTGAG-3’ 59 392
5’-GGCGAGGAAGTCCCTTCTTA-3’
Noxa 5’-GCTGGAAGTCGAGTGTGCTAC-3’ 58 211
5’-CACATTCCTCTCAATTACAATGC-3’
Bcl-2 5’-ATGACCAGACACTGACCATCC-3’ 58 252
5’-CCTTTGGACAGATTTTGTGGA-3’
Bcl-xl 5’-AGCTGGTGGTTGACTTTCTCTC-3’ 57 312
5’-GGGATGTCAGGTCACTGAATG-3’
Mcl-1 5’-TCGAGTGATGATCCATGTTTTC-3’ 58 302
5’-GATATGCCAAACCAGCTCCTAC-3’
GAPDH 5’-ACCTGACCTGCCGTCTAGAA-3’ 58 247
5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’
2　结　果
2.1　FSEER对 TE-13细胞线粒体膜电位的影响
　TE-13 细胞经不同质量浓度的 FSEER（0.4、0.5
和 0.6 mg/mL）分别作用 24 h 后，随着药物作用
浓度的增加，发生线粒体膜电位损伤的细胞数目
逐渐增多，且明显多于对照组，差异具有统计学
意义（P ＜ 0.01），提示细胞的线粒体受到了损伤，
表明 FSEER 可能是通过降低细胞内 ΔΨ 而诱导
细胞发生凋亡（图 1）。
颜　晰，等 . 连翘根醇提物体外诱导 TE-13 细胞凋亡的机制研究
Fig. 1　The change of MMP (mitochondrial membrane potential) of esophageal cancer TE-13 cells treated with different
concentrations of FSEER (ethanol extract of Forsythia suspensa root) (0.4, 0.5 and 0.6 mg/mL) for 24 h was determined by
FCM (flow cytometry) (mitochondrial staining with JC-1). TE-13 cells without treatment as the control. *P<0.05, vs the
control (n=3).
图 1　不同浓度 FSEER作用于 TE-13细胞 24 h后线粒体膜电位的变化情况
241
Fig. 2　The effects of FSEER (ethanol extract of Forsythia suspensa root) on the expression levels of apoptosis-associated
proteins [cleaved-caspase-3, caspase-8, cleaved-caspase-9 and Cyt-C (cytochrome-C)] in esophageal cancer TE-13 cells
were detected by Western blotting. Fig. 2A showed the expression levels of apoptosis-associated proteins in TE-13 cells
treated with different concentrations of FSEER (0.4, 0.5 and 0.6 mg/mL) for 24 h; Fig. 2B showed the expression levels
of apoptosis-associated proteins in TE-13 cells treated with FSEER (0.6 mg/mL) for 6, 12 and 24 h. TE-13 cells without
treatment as the control. *P<0.05, vs the control (n=3).
图 2　蛋白质印迹法检测 FSEER 作用于 TE-13 细胞后对凋亡相关蛋白（cleaved caspase-3、 caspase-8、cleaved
caspase-9 和 Cyt-C）表达水平的影响
Fig. 3　The mRNA expression levels of Bcl -2 family genes (Bax , Bad , Noxa , Bcl -2, Bc l-xl and Mcl -1) which were
apoptosis-associated genes in esophageal cancer TE-13 cells after treatment with different concentrations of FSEER
(ethanol extract of Forsythia suspensa root) (0.4, 0.5 and 0.6 mg/mL) were detected by RT (reverse transcription)-PCR.
TE-13 cells without treatment as the control. *P<0.05, vs the control (n=3).
图 3　RT-PCR检测 FSEER作用于 TE-13细胞后对凋亡相关基因Bcl -2家族表达水平的影响
颜　晰，等 . 连翘根醇提物体外诱导 TE-13 细胞凋亡的机制研究
2.2　FSEER 对 TE-13 细胞凋亡相关蛋白表达
的影响　采用蛋白质印迹法检测 FSEER（0.4、
0.5 和 0.6 mg/mL） 作 用 TE-13 细 胞 24 h 或
FSEER（0.6 mg/mL） 处 理 细 胞 6、12 和 24 h
后凋亡相关蛋白的变化。结果显示，随着药物
浓度的增加（图 2A）和作用时间的延长（图
2B），caspase-8 蛋白的表达水平没有明显变化，
与对照组相比差异无统计学意义（P ＞ 0.05）；
而caspase-3和caspase-9蛋白各自出现了其裂解
片段cleaved caspase-3和cleaved caspase-9，且
cleaved caspase-3和cleaved caspase-9以及细胞质
中 Cyt-C 蛋白的表达水平均逐渐上调，与对照组
相比差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。
2.3　FSEER对 TE-13细胞Bcl-2家族基因表达
水平的影响　RT-PCR 检测结果显示，经不同
质量浓度的 FSEER（0.4、0.5 和 0.6 mg/mL）
处理 24 h 后，TE-13 细胞中Bcl-2 家族基因的
表达水平发生了变化。随着药物浓度的增加，
促 凋 亡 基 因 Bax、Bad 和 Noxa mRNA 的 表 达
水平逐渐升高，而抗凋亡基因 Bcl-2、Bcl-xl 和
Mcl-1 mRNA 的表达水平则逐渐下降，与对照
组相比，差异均有统计学意义（P ＜ 0.05，图 3）。
这一结果说明 FSEER 可能是通过上调促凋亡
基因Bax、Bad 和 Noxa 的表达以及下调抗凋亡
基因Bcl-2、Bcl -xl 和Mcl -1 的表达而诱导细胞
凋亡的。
242
3　讨　论
食管癌是中国最为高发的恶性肿瘤之一，虽
然近年来，食管癌诊疗水平得到了极大的改进，
但 5 年生存率仅为 5% ～ 7%，总体还未达到令人
满意的程度。随着医学界对恶性肿瘤发生和发展
的深入了解，中药对恶性肿瘤治疗作用的认识也
逐步客观化，中药抗肿瘤新药开发的品种迅速增
多。目前研究显示，中医药治疗肿瘤具有不良反
应小、抗肿瘤作用明显的特点 [15-19]，成为中国抗
肿瘤治疗的重要特色之一。本课题组的早期研究
结果发现，FSEER 可能作为一种潜在的抗肿瘤药
物应用于临床 [14]，因此本研究旨在对其抗肿瘤的
作用机制进行研究。
线粒体不仅是细胞生命活动的控制中心，而
且是细胞凋亡的调控中心。近年来，陆续有报道
指出，线粒体跨膜电位的消耗早于核酸酶的激活，
也早于磷酯酰丝氨酸暴露于细胞表面，而一旦线
粒体跨膜电位耗散，细胞就会进入不可逆的凋亡
过程 [20]。本实验首先采用 JC-1 线粒体膜电位检
测试剂盒检测了 FSEER 作用于 TE-13 细胞后线
粒体膜电位水平的变化。结果显示，FSEER 可使
线粒体膜电位发生显著降低，并具有一定的剂量
相关性，提示 FSEER 可能是通过损伤细胞线粒
体而启动细胞凋亡过程的。
细胞凋亡是由两条主要通路介导的，包括由
死亡受体起始的外源途径和由线粒体起始的内
源途径。外源途径是由死亡受体的激活而触发
的，并且直接导致 caspase-8 的活化，随后激活
caspase-3。相反，内源途径是由紫外线照射、生
长因子消失或不同的应激刺激而触发的，导致
Cyt-C 从线粒体释放进入细胞质并与 Apaf-1 和
caspase-9前体形成凋亡复合体而使caspase-9活
化，活化的caspase-9切割并激活caspase-3[21, 22]。
Caspase-3 是凋亡过程中关键的执行分子，在细胞
凋亡中发挥非常重要的作用，其裂解活化是反映
凋亡启动和发生的重要分子标志 [23]。
本研究结果显示，FSEER 作用后，caspase-3
和 caspase-9蛋白各自出现了其裂解片段的表达，
并且随着药物浓度的提高和作用时间的延长，裂
解片段愈加明显，细胞质中 Cyt-C 的表达量也逐
渐增加，而与外源途径相关蛋白caspase-8蛋白的
表达却没有明显变化，这说明 FSEER 活化了细
胞凋亡内源途径中的 caspase-3 和 caspase-9，而
对外源途径中的caspase-8没有明显影响，此结果
进一步提示 FSEER 可能是通过线粒体途径而诱
导细胞发生凋亡的。线粒体途径中 Cyt-C 的释放
受 Bcl-2 蛋白家族的紧密调控，包括促凋亡因子
（Bax、Bad、Bak 和 Noxa 等）的活化和抗凋亡因
子（Bcl-2、Bcl-xl 和 Mcl-1 等）的失活 [24]。与之
相 符， 本 研 究 RT-PCR 结 果 显 示，FSEER 可 以
上 调 Bax、Bad 和 Noxa mRNA 的 表 达， 而 下 调
Bcl-2、Bcl-xl 和 Mcl-1 mRNA 的表达，从而促使
Cyt-C 从线粒体释放进入细胞质，与 Apaf-1 和
caspase-9 前体形成凋亡复合体，激活 caspase-3
而推进细胞凋亡过程。
综上所述，本实验从凋亡信号转导通路层面，
系统地研究食管癌细胞 TE-13 的凋亡调控网络，
揭示了 FSEER 诱导食管癌细胞发生凋亡的作用
机制，为其临床治疗乳腺癌提供了理论基础。
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[ 本文编辑 ]　林　琳
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