全 文 ：究 。
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(2007-10-28收稿)
藤梨根正丁醇提取物在人食管癌细胞生长中的作用
国宏莉 1, 2 ,姚俊霞 1 ,张　丽2 ,田　林 2 ,杜兴贵 1, 2＊
(郧阳医学院 1.病理学教研室;2.附属人民医院病理科 ,湖北十堰 442000)
　　摘要　目的:观察藤梨根正丁醇提取物对培养人食管癌 Eca-109细胞的生长抑制作用 , 探讨藤梨根对人食管癌
细胞的作用机制。方法:MTT比色法检测藤梨根正丁醇提取物在不同浓度(1、 10、100 μg/ml等)及不同时间(24、
48、72 h等)对 Eca-109细胞的生长抑制作用 , TUNEL法检测其对癌细胞生长的诱导凋亡效应 , 免疫组化 SP法检测
凋亡相关蛋白 Bax及 Bcl-2的表达。结果:藤梨根正丁醇提取物对人食管癌 Eca-109细胞的生长抑制作用随着药物
浓度的升高和作用时间的延长而增强 ,其生长抑制率可达 87.2%;提取物对瘤细胞有明显的凋亡效应 , 而在对照组
未见有明显凋亡现象;提取物对瘤细胞作用 24、48、72 h后分别与对照组比较 , 用药组 Bax蛋白表达明显增强(P<
0.01), 同时伴有 Bcl-2表达的减弱 , 在 72 h后最明显 ,差异有显著意义(P<0.01)。结论:藤梨根正丁醇提取物能
有效抑制人食管癌 Eca-109细胞生长。
关键词　藤梨根 /猕猴桃根;食管肿瘤;抑制作用;凋亡
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2008)07-1030-03
基金项目:国宏莉(1979-),女,硕士 ,研究方向为肿瘤病理和妇产科病理;Tel:0719-8875315。＊通讯作者:杜兴贵 , Tel:0719-8875315, E-mail:duxingui@sina.com。
　　藤梨根又称阳桃根 ,为植物猕猴桃科藤梨(软
枣猕猴桃)Actinidiaarguta(Sieb.teZucc.)Planch.
或猕猴桃 A.chinensisPlanch.的根。研究表明 ,藤梨
根对多种肿瘤细胞有生长抑制作用 ,采用不同方法
所得的提取物其抑制作用存在一定的差异 〔1, 2〕。食
管癌是临床常见的恶性肿瘤之一 ,由于就诊时大部
分患者已处于中晚期 ,故临床治疗效果并不令人满
意 。近年研究发现 ,细胞凋亡是机体维持正常生理
活动所必需的 ,在许多疾病尤其在肿瘤的发生 、发展
及转归中起着重要作用 ,这为肿瘤病人的治疗提供
了新的思路。本课题观察藤梨根对培养人食管癌
Eca-109细胞生长的作用 ,以探讨藤梨根对人食管
癌细胞的作用机制。
1 　材料与方法
1.1 　材料　人食管癌细胞 Eca-109细胞株购于上
海中科院细胞库 , RPMI-1640培养基购于武汉天源
生物技术有限公司 , 为 Gibco公司产品 (批号:
31800-022);超级新生牛血清为杭州四季青生物工
程有限公司产品(批号:050126);实验用 1∶250胰
酶为 Difco公司产品(批号:020411);四甲基偶氮唑
蓝(MTT)为 Duchefa分装(批号:BS0880);二甲基亚
砜(DMSO)为 Sigma公司产品 。 TUNEL试剂盒(批
号:ZK-8005)购于北京中杉生物技术有限公司。
1.2　细胞培养 　细胞在含 10%小牛血清的 RP-
MI1640培养液中 , 37℃、5%CO2条件下培养 , 24 h
换液一次 。
1.3　药物制备　藤梨根采自鄂西北武当山地区。
将 1 kg粉碎成粗粉 ,烘干备用。取藤梨根 500 g,加
入 3000 ml正丁醇中浸泡 12h;回流提取 1h,过滤;
药渣再加 2000ml正丁醇回流提取 1h;合并两次滤
液 ,减压回收正丁醇至稠膏状 ,真空干燥;干燥品加
蒸馏水 500 ml,旋转加热溶解 ,制成饱和水溶液;灭
菌即得原液(500 ml, 1 g/ml, pH=3.8)。将原液稀
释成 1、10、100μg/ml药物浓度 ,过滤 ,灭菌分装 ,置
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DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2008.07.061
4℃冰箱备用 。
1.4 　MTT法检测细胞生长抑制率　将贴壁细胞用
0.25%的胰蛋白酶消化后计数 ,调整细胞浓度为 4
×104 /ml,接种于 96孔板 ,待 24 h细胞贴壁后加入
藤梨根正丁醇提取物药液。实验组分加入终浓度
1、10、100μg/ml等药物浓度的药液 ,对照组加入等
体积溶剂的培养液 ,每组 12复孔 ,分别于加药后第
1、2、3 d等时间后测定各孔的吸光度值(A值)。测
定前每孔加 5 mg/ml的 MTT20 μl,温育 4 h,弃上
清 ,加入 DMSO150 μl/孔 。同时振荡至结晶完全溶
解 ,用酶联免疫检测仪在 490 nm处测定 A490值 。用
各组的平均 A值计算细胞生长抑制率 。
生长抑制率 =(对照组 A值 -实验组 A值)/对照组 A
值 ×100%
1.5 　TUNEL法检测凋亡细胞　将浓度为 4×104 /
ml的 Eca-109细胞接种于经多聚赖氨酸包被的清净
盖玻片上 ,用 RPMI1640培养基于 37℃、5%CO2条
件下在 24孔板中培养 24 h后取出盖玻片 , PBS冲
洗 3次。 0.1%Triton-100破膜 、4%多聚甲醛固定 ,
H2O2阻断 。用 TdT(末端脱氧核糖核酸转移酶)法
将生物素标记的 d-UTP在末端转移酶的作用下 ,标
记到 DNA的 5′端缺口上 ,再用亲和素标记的 HRP
与之结合 ,然后加入底物 DAB显色 ,苏木素复染 ,从
而使凋亡细胞核呈现棕褐色 ,未凋亡细胞核呈蓝色 。
在光学显微镜下随机计数 5个高倍视野约 1000个
细胞中的凋亡细胞数 ,计算凋亡细胞所占比例 。
1.6　免疫细胞化学 SP法及图像分析　将浓度为 4
×104 /ml的 Eca-109细胞接种于经多聚赖氨酸包被
的清净盖玻片上 ,用 RPMI1640培养基于 37℃、5%
CO2条件下在 24孔板中培养 24 h后取出盖玻片 ,
PBS冲洗 3次。 0.1%Triton-100破膜 、4%多聚甲醛
固定 ,经 H2O2阻断 、血清封闭后 ,滴加 50 μl一抗 ,
PBS代替一抗作阴性对照 , 4℃冰箱过夜 。滴加生物
素标记的二抗 , PBS冲洗 3次 。滴加辣根过氧化物
酶标记的链霉卵白素 , DAB显色。苏木素复染 ,盐
酸分化 ,氨水返蓝 ,中性树胶封片。采用 Motic6.0
图像分析系统检测其灰度值 。
1.7　统计学处理　计量资料用 x±s表示 ,各组样
本均数间比较采用 SPSS10.0统计分析软件包进行 t
检验 。以 P<0.05为差别有统计学意义。
2　结果
2.1　MTT法检测生长抑制率　结果表明 ,藤梨根
正丁醇提取物对人食管癌 Eca-109细胞的生长抑制
作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增
强。当用 100 μg/ml的药物作用 72 h时 , 可使
87.2%以上的细胞生长受到抑制。见表 1。
　表 1　　　　藤梨根正丁醇提取物对 Eca-109
细胞的生长抑制率(%)
组别 24h 48h 72h
对照组 0 0 0
1μg/ml组 18.5 36.2 45.3
10μg/ml组 24.5 46.7 66.4
100μg/ml组 36.2 58.7 87.2
2.2　TUNEL法检测细胞凋亡　当用 1μg/ml藤梨
根正丁醇提取物处理 Eca-109细胞 24 h时 ,可检测
到形态尚未发生改变的早期凋亡细胞;当药物作用
时间延长至 72 h时 ,可见凋亡细胞变圆 ,体积明显
缩小 ,核染色质浓缩 ,变成新月形 ,此为晚期凋亡细
胞 ,随时间的推移 ,凋亡细胞比例逐渐增加 ,而对照
组未见有明显凋亡现象 。
2.3　免疫组化 SP法检测 Bax及 Bcl-2蛋白的表达
　Motic6.0图像分析系统灰度值分析结果显示 ,提
取物对肿瘤细胞作用 24、48、72 h后分别与对照组
比较 ,用药组 Bax蛋白表达明显增强(P<0.01);同
时伴有 Bcl-2表达的变化 , 24 h后开始减弱 , 48 h后
表达量与对照组比较 ,差异有显著意义(P<0.05),
72 h后降低最为明显(P<0.01)。见表 2。
　　表 2 　Bax及 Bcl-2在 Eca-109细胞的胞质表达(灰度值 , x±s)
组别 浓度(μg/ml) 24h 48h 72h
Bax 正丁醇组 1 165.48±11.01＊＊ 185.07±8.39＊＊ 196.63±9.86＊＊
10 172.22±11.23＊＊ 188.90±13.56＊＊ 198.73±9.28＊＊
100 179.10±11.02＊＊ 193.42±8.97＊＊ 198.75±8.51＊＊
对照组 0 125.43±5.42 125.89±6.23 126.88±8.53
Bcl-2 正丁醇组 1 129.48±7.01 123.07±5.39 119.63±4.86＊＊
10 127.22±8.56 119.90±4.56 114.73±5.28＊＊
100 124.01±7.23 114.42±4.92＊ 109.75±3.51＊＊
对照组 0 123.43±6.13 125.44±7.53 126.88±5.57
　　注:与对照组比较 , ＊P<0.05, ＊＊P<0.01
·1031·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 7期 2008年 7月
3 　讨论
肿瘤是危及人类生命的首要顽疾 ,药物治疗为
中西医肿瘤治疗中的一个重要模式 ,包括化学药物
和天然药物 。中医药的抗肿瘤作用已得到广泛的肯
定 ,其机制有多方面 ,如抑制 DNA合成 、抑制肿瘤血
管形成 、诱导细胞分化 、促进细胞凋亡 、调节机体免
疫功能 、抑制蛋白酪氨激酶活性等〔3-6〕。目前 ,关于
藤梨根的研究已有报道 ,其对消化系统肿瘤有抑瘤
作用 ,但其作用机制还不清楚。
研究发现 ,同种猕猴桃根不同提取方法所得的
提取物其抗肿瘤作用可能不尽相同 。有学者用甲
醇 、水 、乙酸乙酯 、正丁醇等溶剂回流提取 ,观察提取
物对同种肝癌细胞株的作用 ,结果表明正丁醇 、乙酸
乙酯提取物对瘤细胞的生长有良好的抑制作用 ,但
各组量效关系不明显 〔2〕。关于藤梨根提取物中抗
肿瘤作用的成分 ,曾有人报道主要为三萜类化合物 ,
分别为乙酸乙酯提取物熊果酸 、β -谷甾醇及正丁醇
提取物 2α, 3α, 24-三羟基-12-烯 -28-乌苏酸 、2β, 3β ,
23-三羟 基-12-烯-28-乌 苏 酸 、 24-hydroxytormentric
acid〔7〕。
研究表明 ,藤梨根对多种肿瘤细胞生长均有抑
制作用 。钟振国 〔8〕等采用 MTT比色法 、集落形成法
等方法对藤梨根作用的宫颈癌细胞株 Hela、神经肿
瘤细胞株 NG108-15、胃癌细胞株 SGC7901等进行了
研究 ,结果藤梨根对不同瘤细胞的生长均有不同程
度的抑制作用。李昊 〔9〕等研究了藤梨根对人胃低
分化腺癌 BGC-823细胞的作用 ,发现其浓度在 1.3
mg/ml时抑瘤率最强 (88.19%),随着药物浓度的
降低 ,抑瘤率随之下降;藤梨根对胃癌细胞作用 24h
抑制作用最强(87.61%), 48 h回落 , 72 h再次上
升 ,其对胃癌细胞有明显杀伤作用 。卫培峰 〔10〕等在
动物实验中证明藤梨根能有效诱导鼠胃癌细胞的凋
亡 ,与对照组细胞的凋亡率和死亡率有显著的差异 。
近几年来 ,国内外对细胞间隙连接通讯与癌变
的关系进行了大量的研究 ,发现多数肿瘤细胞无此
功能 ,其间隙连接少或无 ,而邻近的正常组织或良性
肿瘤的间隙连接正常 ,少数肿瘤细胞有脆弱的连接
通讯 ,但很容易受到破坏 ,其间隙连接数量很少 ,藤
梨根可以通过上调细胞间隙连接通讯功能来抑制某
些肿瘤细胞如高转移性人肺癌细胞的生长 〔11〕。
本研究结果显示:藤梨根正丁醇提取物三个药
物浓度 1、10、 100 μg/ml作用于 Eca-109细胞 24、
48、72h后 ,有明显的凋亡特征。 TUNEL法检测可
见不同时期的凋亡细胞;免疫组化 SP法检测 Bax及
Bcl-2蛋白的表达 ,与对照组比较 ,用药组 Bax蛋白
表达增强 , Bcl-2表达减弱 。因此推测 ,诱导肿瘤细
胞凋亡可能是藤梨根抗肿瘤作用的机制之一 。但细
胞凋亡的调控及信号传导极其复杂 ,有多种分子参
与。肿瘤细胞胞质内 Bax蛋白的高表达 ,可能直接
刺激一些细胞器比如线粒体 ,使其渗透压失衡基质
发生肿胀或产生其它变化 ,引起外膜损伤 ,释放细胞
色素 C等 Caspase激活蛋白。细胞色素则可和凋亡
蛋白酶激活因子结合并使之活化 , 而触发 Caspase
级联反应 ,引起细胞发生程序性死亡即凋亡。故抗
肿瘤作用的真正机理及体内抑瘤实验需进一步深入
研究 。
参 考 文 献
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·1032· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 31卷第 7期 2008年 7月