全 文 ：藤梨根正丁醇提取物对人食管癌细胞
生长作用的实验研究
张　丽 1 , 　国宏莉 1, 2 , 　田　林1 , 　曹书芬 1 , 　度长海 1
(郧阳医学院 1附属人民医院病理科;2基础医学院病理学教研室 ,湖北 十堰　442000)
[摘　要 ] 　目的:探讨藤梨根正丁醇提取物对培养的人食管癌 Eca -109细胞的生长抑制作用。方法:MTT比色法
检测藤梨根正丁醇提取物在不同浓度(1μg /m l、10 μg /m l、100 μg /m l)及不同时间(24 h、48 h、72 h)对 Eca - 109细
胞生长抑制作用 , TUNEL法检测其对癌细胞生长的诱导凋亡效应。结果:①藤梨根正丁醇提取物对人食管癌 Eca
- 109细胞的生长抑制作用随着药物浓度的升高和作用时间的延长而增强。 ②提取物对瘤细胞有明显的凋亡效
应。结论:藤梨根正丁醇提取物能有效抑制人食管癌 Eca -109细胞生长。
[关键词 ] 　藤梨根 /猕猴桃根;食管肿瘤;抑制;凋亡
[中图法分类号 ] 　R730. 52　　　[文献标识码 ] 　A　　　[文章编号 ] 　1006 -9674(2006)05 - 0268 -03
Inh ib itory E ffect of Extracts From A ctin id ia Argu ta by N - butyl A lcohol on Human Carc inom a of Esophagus
Ce lls　　 ZHANG L i1 , GUO Hong - li1, 2 , T IAN L in1 , CAO Shu - fen, DU Chang - ha.i 　(1D epartm ent of Pa thology,
Renm in Hospita l, YunyangM edica lCollege, Shiyan, Hubei 442000;2D epartm ent of Pathology, YunyangM edica lCollege,
Shiyan, Hubei 442000)
Abstrac t:Ob jec tive To evalua te the inhibito ry effec t o f ex trac ts from Actin idia argu ta by n - bu ty l alcoho l on hum an carcino-
m a of esophagus cells(Eca - 109). M e thods MTT co lo rme tric assay w as used to exam ine the grow th inhibition of ex tracts
from Ac tin id ia a rguta by n - buty l alcoho l on E ca - 109 ce lls, TUNEL te st w as pe rform ed to obse rve the apopto sis induced
by the ex trac ts(1 μg /m l、10 μg /m l、100μg /m l)on Eca - 109 cells. Results① The inhibito ry effect o f the extrac ts on Eca
- 109 ce llsw as increased in a dose - and tim e -dependentm anne r. ②The extrac ts cou ld significan tly induce apoptosis o f
Eca -109 cells. Conc lusion The ex tracts from Actin idia a rguta by n -buty l alcoho l could e ffec tively inhib it E ca - 109 cell
g row th.
K ey words:Teng ligen /actinidia a rgu ta;E sophagus tumo r;Inhibito ry effect;Apop to sis
[作者简介 ] 　张　丽(1962 -),女 , 哈尔滨人 ,学士 ,副主任
医师 , 研究方向为肿瘤病理学。
　　细胞凋亡是由基因编码控制的一种细胞的程序
性死亡 ,是机体维持正常生理活动所必需的 。近年
发现细胞凋亡在许多疾病尤其在肿瘤的发生 、发展
及转归中起着重要作用 ,这为肿瘤病人的治疗提供
了新的思路 。随着中医药对肿瘤治疗的大量临床观
察及实验研究的深入 ,人们逐渐肯定了它对肿瘤治
疗方面的疗效。其抗肿瘤作用机制有多方面 ,如抑
制细胞增殖 ,诱导细胞凋亡 ,抑制蛋白酪氨酸激酶
(pro tein ty rosine kinase, PTK)活性等 [ 1 - 4] 。藤梨根
又称阳桃根 ,为植物猕猴桃科藤梨 (软枣猕猴桃 )
A ctinidia arg - uta(S ieb. teZucc. )Planch. 或猕猴桃
A. ch inensis P lanch. 的根 。研究表明 ,藤梨根对多种
肿瘤细胞有生长抑制作用 ,采用不同方法所得的提
取物其抑制作用存在一定的差异 [ 5 -6] 。本文通过观
察藤梨根对培养的人食管癌 Eca - 109细胞生长的
作用 ,以探讨藤梨根对人食管癌细胞的作用机制 。
1　材料与方法
1. 1　材料
人食管癌细胞 Eca - 109细胞株购于上海市中
科院细胞库 , RPM I- 1640培养基购于武汉天源生物
技术有限公司 ,为 G ibco公司产品 (货号 31800 -
022);超级新生牛血清为杭州四季青生物工程有限
公司产品 (批号 050126);实验用 1∶250胰酶购于
武汉天源生物技术有限公司 ,为 D ifco公司产品(批
号 020411);四甲基偶氢唑蓝(MTT)购于武汉天源
生物 技术 有限 公司 , 为 Duchefa 分 装 (货 号
BS0880);二甲亚砜 (DMSO)购于武汉天源生物技
术有限公司 , 为 Sigma公司产品 。 TUNEL试剂盒
268 郧阳医学院学报(J　YMC)　2006年 10月 , 25(5):268　　
(编号 ZK - 8005)购于北京中杉生物技术有限公
司 。
1. 2　细胞培养
细胞在含 10%小牛血清的 RPM I 1640培养液
中 , 37 ℃、5%CO 2条件下培养 , 24 h换液一次 。
1. 3　药物制备
将藤梨根 1 kg粉碎成粗粉 ,烘干备用。取藤梨
根 500 g,加入 3 000m l正丁醇中浸泡 12 h;回流提
取 1 h,过滤;药渣再加 2 000 m l正丁醇回流提取 1
h;合并两次滤液 ,减压回收正丁醇至稠膏状 ,真空干
燥;干燥品加蒸馏水 500 m l,旋转加热溶解 ,制成饱
和水溶液;灭菌;原液 (500 m l, 1 g /m l, pH =3. 8)。
将原液稀释成 1 μg /m l、10 μg /m l、100 μg /m l三个
药物浓度;过滤;灭菌;分装 ,置 4 ℃冰箱备用。
1. 4　MTT法
将贴壁细胞用 0. 25%的胰蛋白酶消化后计数 ,
调整细胞浓度为 4×104 /m l,接种于 96孔板 ,待 24 h
细胞贴壁后加入藤梨根正丁醇提取物药液 。实验组
分别加入终浓度为 1 μg /m l、10 μg /m l、100 μg /m l 3
个药物浓度的药液 ,对照组加入等体积溶剂的培养
液 ,每组 l2复孔 ,分别于加药后第 1、2、3 d测定各孔
的吸光度值 (A值 )。测定前每孔加 5 mg /m l的
MTT 20 μl,温育 4 h,弃上清液 ,加入二甲基亚砜
(DMSO)150 μl /孔。同时振荡至结晶完全溶解 ,用
酶联免疫检测仪在 490 nm波长下测定 A490值 。用
各组的平均 A值计算细胞生长抑制率。生长抑制
率 =(对照组 A值 -实验组 A值 ) /对照组 A值 ×
100%。
1. 5　TUNEL法检测凋亡细胞
将浓度为 4×104 /m l的 Eca - 109细胞接种于
经多聚赖氨酸包被的干净盖玻片上 ,用 RPM I 1640
培养基于 37℃、5%CO 2条件下在 24孔板中培养 24
h后取出盖玻片 , PBS冲洗 3次。 0. 1%Triton - 100
破膜 、4%多聚甲醛固定 , H2O2阻断 。用 TDT法将
生物素标记的 d - UTP在末端转移酶的作用下 ,标
记到 DNA的 5′端缺口上 ,再用亲和素标记的 HRP
与之结合 ,然后加入底物 DAB显色 ,苏木素复染 ,从
而使凋亡细胞核呈现棕褐色 ,未凋亡细胞核呈蓝色 。
在光学显微镜下随机计数 5个高倍视野约 1 000个
细胞中的凋亡细胞数 , 计算凋亡细胞所占比例。
2　结果
2. 1　MTT法检测生长抑制率
结果表明藤梨根正丁醇提取物对人食管癌 Eca
-109细胞的生长抑制作用随着药物浓度的升高和
作用时间的延长而增强 。用 1 μg /m l的正丁醇提取
物作用 24 h,细胞生长抑制率为 18. 5%;当延长至
72 h时 ,抑制率上升至 45. 3%;而 100μg /m l的药物
作用 72 h时 ,可使 85%以上的细胞生长受到抑制
(见表 1)。
表 1　藤梨根正丁醇提取物对 Eca -109细胞的
生长抑制率 (%)
分组 抑制率(%)
24 h 48 h 72 h
1μg /m l 18. 5 36. 2 45. 3
10 μg /m l 24. 5 46. 7 66. 4
100 μg /m l 36. 2 58. 7 87. 2
对照组 0 0 0
2. 3　TUNEL法检测细胞凋亡
当用 1 μg /m l藤梨根正丁醇提取物处理 Eca -
109细胞 24 h时 ,可检测到形态尚未发生改变的早
期凋亡细胞;当药物作用时间延长至 72 h时 ,可见
凋亡细胞变圆 ,体积明显缩小 ,核染色质浓缩 ,变成
新月形 ,此为晚期凋亡细胞 ,随时间的推移 ,凋亡细
胞比例逐渐增加 (见图 1)。而对照组 ,未见有明显
凋亡现象 (见图 2)。
3　讨论
肿瘤是危及人类生命的首要顽疾 ,药物治疗为
中西医肿瘤治疗中的一个重要模式 ,包括化学药物
和天然药物。中医药的抗肿瘤作用已得到广泛的肯
定 ,其机制有多方面 ,如抑制 DNA合成 、抑制肿瘤血
管形成 、诱导细胞分化 、促进细胞凋亡 、调节机体免
疫功能 、抑制蛋白酪氨酸激酶 (pro tein tyrosine ki-
nase, PTK)活性等 [ 1 - 4] 。关于藤梨根的研究已有报
道 ,其对消化系统肿瘤有良好的抗肿瘤作用 ,可用于
消化系统肿瘤的治疗 [ 5] ,但其抗肿瘤作用机制还不
清楚 。
初步研究发现 ,同种猕猴桃根不同提取方法所
得的提取物其抗肿瘤作用可能不尽相同 。有学者用
甲醇 、水 、乙酸乙酯 、正丁醇等溶剂回流提取 , 观察
提取物对同种肝癌细胞株的作用 , 结果表明正丁
醇 、乙酸乙酯提取物对瘤细胞的生长有较好的抑制
作用 , 但各组量效关系不明显[ 6] 。关于藤梨根提取
物中抗肿瘤作用的成分 , 曾有人报道主要为三萜类
化合物 , 分别为乙酸乙酯提取物熊果酸 、β -谷甾醇
及正丁醇提取物 2α, 3α, 24 -三羟基 - 12 -烯 - 28
-乌苏酸 、2β , 3β , 23 -三羟基 - 12 -烯 - 28 -乌苏
269 　　张　丽等.藤梨根正丁醇提取物对人食管癌细胞生长作用的实验研究
酸 、24 - hydroxy tormentric acid[ 7] 。
研究表明 ,藤梨根对多种肿瘤细胞生长均有抑
制作用 。钟振国 [ 8]等采用 MTT比色法 、集落形成法
等方法对藤梨根作用的宫颈癌细胞株 He la、神经肿
瘤细胞株 NG108 - 15、胃癌细胞株 SGC7901等进行
了研究 ,结果藤梨根对不同瘤细胞的生长均有不同
程度的抑制作用。李昊 [ 9]等研究了藤梨根对人胃
低分化腺癌 BGC - 823细胞的作用 ,发现其浓度在
1. 3mg /m l时抑瘤率最强 (88. 19%),随着药物浓度
的降低 ,抑瘤率随之下降;藤梨根对胃癌细胞作用
24 h抑制作用最强(87. 6 l%), 48 h回落 , 72 h再次
上升 , 其对胃癌细胞有明显杀伤作用。卫培峰 [ 10]
等在动物实验中证明藤梨根能有效诱导鼠胃癌细胞
的凋亡 , 与对照组细胞的凋亡率和死亡率有显著的
差异。
近几年来 ,国内外对细胞间隙连接通讯与癌变
的关系进行了大量的研究 ,发现多数肿瘤细胞无此
功能 ,其间隙连接少或无 ,而邻近的正常组织或良性
肿瘤的间隙连接正常 ,少数肿瘤细胞有脆弱的连接
通讯 ,但很容易受到破坏 ,其间隙连接数量很少 ,藤
梨根可以通过上调细胞间隙连接通讯功能来抑制某
些肿瘤细胞如高转移性人肺癌细胞的生长 [ 11] 。
本研究结果证实:藤梨根正丁醇提取物三个药
物浓度 1 μg /m l、10μg /m l、100 μg /m l作用于 Eca -
109细胞 24 h、48 h、72 h后 ,显示出明显的凋亡特
征 。 TUNEL法可检测到不同时期的凋亡细胞;MTT
法也发现随药物浓度升高和作用时间的延长 ,其抑
制率明显升高。因此推测 ,诱导肿瘤细胞凋亡可能
是藤梨根抗肿瘤作用的机制之一。但细胞凋亡的调
控及信号传导极其复杂 ,有多种分子参与 。故抗肿
瘤作用的真正机理及体内抑瘤实验尚需进一步深入
研究。
(文中图 1 ～ 2见封四)
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[收稿日期 ] 2006 -07 -21
270 郧阳医学院学报(J　YMC)　2006年 10月 , 25(5):268