全 文 ：基金项目:福建省卫生厅青年科研课题(2013-2-132)。
第一作者简介:温扬敏(1979-)，男，硕士研究生，研究方向为天然产物研究与开发。E-mail:ymwen4979@ 126． com
榄绿粗叶木茎甲醇提取物对人食管癌 EC-9706
细胞增殖的影响及其机制探讨
温扬敏1，万端静2，谢永华1，罗彩林1，邱丹缨1
(1 泉州医学高等专科学校，福建泉州 362000;2 泉州市中医院)
摘要:目的 探讨榄绿粗叶木茎甲醇提取物(以下简称 MESLL)对人食管癌 EC-9706 细胞增殖的影响及其机
制。方法 体外培养 EC-9706 细胞。①观察 MESLL 对细胞增殖的影响:取对数生长期 EC-9706 细胞，随机分为
MESLL组、环磷酰胺组(CTX)组和空白组。MESLL组分别给予 0． 01、0． 05、0． 1、0． 2、0． 4 mg /mL MESLL干预，CTX
组给予 1 mg /mL CTX干预，空白组不干预。干预 24、48、72 h，检测各组细胞增殖抑制率。②观察 MESLL 对细胞
NO活性及 NOS、cGMP含量的影响:取对数生长期细胞，随机分为实验组及对照组。实验组分别置入含 0． 01、0． 05、
0． 1、0． 2、0． 4 mg /mL MESLL的培养液培养 48 h，对照组常规培养 48 h。检测两组细胞上清液 NO活性及细胞 NOS、
cGMP含量。结果 ①MESLL对细胞增殖的影响:干预 24 h，仅 MESLL 组 0． 2、0． 4 mg /mL 细胞增殖抑制率高于
CTX组(P均 ＜ 0． 05);干预 48、72 h，MESLL组细胞增殖抑制率随 MESLL浓度升高而增加，MESLL组 0． 1、0． 2、0． 4
mg /mL细胞增殖抑制率均高于 CTX 组(P 均 ＜ 0． 05)。②MESLL 对细胞 NO 活性及 NOS、cGMP 含量的影响:随
MESLL浓度增加，EC-9706 细胞 NO活性及 NOS、cGMP含量呈降低趋势(P ＜ 0． 05)。结论 MESLL 能抑制食管癌
EC-9706 细胞增殖，其机制可能与抑制 NO/NOS-cGMP通路有关。
关键词:食管肿瘤;榄绿粗叶木;一氧化氮;一氧化氮合酶;环鸟甘酸
doi:10． 3969 / j． issn． 1002-266X． 2015． 40． 004
中图分类号:Ｒ735． 1;Ｒ932 文献标志码:A 文章编号:1002-266X(2015)40-0011-03
Effect of methanol extract from lasianthus lancilimbus on proliferation of human
esophagus carcinoma cells EC-9706
WEN Yang-min1，WAN Duan-jing，XIE Yong-hua，LUO Cai-lin，QIU Dan-ying
(1 Quanzhou Medical College，Quanzhou 362000，China)
Abstract:Objective To investigate the inhibitory effect of methanol extract from lasianthus lancilimbus (MESLL)
on proliferation of human esophagus carcinoma cells EC-9706 and the mechanism． Methods EC-9706 cells were cultured
in vitro． ① Observing the effect of MESLL on cell proliferation:the cells in the logarithmic growth phase were divided into
MESLL group，cyclophosphamide (CTX)group and control group． MESLL group was respectively treated with 0． 01，
0． 05，0． 1，0． 2 and 0． 4 mg /mL MESLL，the CTX group was intervened by 1 mg /mL CTX and the control group was not
treated． The proliferation inhibiting rates were detected after 24，48 and 72 h． ② Observing the effect of MESLL on NO ac-
tivity and the levels of NOS and cGMP:the cells in the logarithmic growth phase were divided into the experimental group
and the control group． The experimental group was respectively treated with 0． 01，0． 05，0． 1，0． 2 and 0． 4 mg /mL
MESLL for 48 h，and the control group was not treated． The NO activity and the levels of NOS and cGMP were measured．
Ｒesults ① After 24 h，the proliferation inhibiting rates treated with 0． 2 mg /mL and 0． 4 mg /mL MESLL were higher than
those of the CTX group (all P ＜ 0． 05)． After 48 and 72 h，tumor inhibiting rate of MESLL group was increased with the
increased concentrations of MESLL． The tumor inhibiting rates treated with 0． 1 mg /mL，0． 2 mg /mL and 0． 4 mg /mL
MESLL were higher than those of the CTX group (all P ＜ 0． 05)． ② Effect of MESLL on NO activity and the levels of NOS
and cGMP:the activity of NO，the levels of NOS and cGMP reduced with the increased concentrations of MESLL (P ＜
0． 05)． Conclusions MESLL could inhibit the proliferation of EC-9706 cells，and the mechanism may be related with the
inhibition of NO /NOS-cGMP pathway．
Key words: esophageal neoplasms; lasianthus lancilimbus; nitric oxide; nitric oxide synthase; cyclic
guanosine monophosphate
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山东医药 2015 年第 55 卷第 40 期
食管癌是常见的恶性肿瘤之一，我国食管癌发
病率和病死率均居世界之首［1］。目前，外科手术及
术后联合化疗、化疗、靶向治疗为食管癌的主要治疗
手段，但总体治疗效果仍不尽人意，且化疗药物毒副
作用大［2］。近年来中药在抗肿瘤新药的研发中日
益引起关注。粗叶木属是茜草科中的一个大属，约
有 180 个种，间断分布于亚洲、非洲至中、南美洲［3］。
从粗叶木属植物根和茎中已分离出多种具有抗炎、
抗肿瘤效果的生物活性物质。如李斌等［4］从长尾
粗叶木根中分离出具有体外抑制卵巢癌细胞增殖的
新蒽醌苷类化合物;徐斌等［5］从罗浮粗叶木分离出
具有肝损伤保护作用物质。榄绿粗叶木为粗叶木属
中的一个变种，分布于我国浙江、江西、福建等地，生
长在海拔 300 ～ 1 500 米处的林下［6］，在民间多用榄
绿粗叶木茎治疗肝炎等疾病。但其分离物是否具有
抗肿瘤作用目前研究较少。2014 年 6 ～ 12 月，我们
观察了榄绿粗叶木茎甲醇提取物(MESLL)对人食
管癌细胞 EC-9706 增殖及其细胞 NO 活性、一氧化
氮合酶(NOS)和环鸟苷酸(cGMP)含量的影响。现
报告如下。
1 材料与方法
1． 1 材料 榄绿粗叶木采自福建省三明市宁化县
治平乡泥坑村，由泉州市林业局野生动植物保护管
理站原站长林彦云先生鉴定。人食管鳞癌细胞株
EC-9706(以下称 EC-9706 细胞)，购自上海天呈科
技生物公司。全自动酶标仪购自赛默飞世尔科技
(北京)有限公司;细胞培养箱购自宁波双嘉仪器有
限公司。NO、NOS检测试剂盒购自上海贝博生物公
司;cGMP 检测试剂盒购自武汉艾美捷科技有限公
司;CCK-8、ＲPMI 1640 培养基及小牛血清购自赛默
飞世尔科技(北京)有限公司;甲醇(分析纯)购自天
津市津东天正精细化学试剂厂;环磷酰胺(CTX)购
自山西普德药业股份有限公司。
1． 2 MESLL制备 取榄绿粗叶木茎，水洗干净后晒
干;用刀切成长 2 ～3 cm、宽 0． 5 ～ 1 cm小块。称取 1
kg，放入 10 L 玻璃瓶中，加入固液比为 1∶ 10(kg /L)
的甲醇溶液。浸泡 15 天过滤，取上清液，旋转蒸发仪
蒸发，得到甲醇提取物浸膏。用蒸馏水配制成含
0． 01、0． 05、0． 1、0． 2、0． 4 mg /mL MESLL的溶液。
1． 3 MESLL对 EC-9706 细胞增殖抑制作用观察
EC-9706 细胞用含 10% FBS 的 ＲPMI 1640 培养液，
在 37 ℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。收集对数
生长期细胞，置于 96 孔板，调整细胞密度至 6 × 103
个 /孔，随机分为 MESLL 组、CTX 组和空白对照组。
MESLL组分别予含 0． 01、0． 05、0． 1、0． 2、0． 4 mg /mL
MESLL细胞培养液干预，CTX组予含 1 mg /mL CTX
细胞培养液干预，空白对照组不予处理。MESLL 组
各浓度及 CTX组、空白组均设 6 个复孔。干预 24、
48、72 h，加入 CCK-8 试剂，用酶标仪于 450 nm波长
处检测吸光度(OD)，计算细胞增殖抑制率。细胞
增殖抑制率(%)=(1 －干预组 OD 值 /空白对照组
OD值)× 100%。
1． 4 MESLL 对 EC-9706 细胞 NO 活性及 NOS、
cGMP含量的影响 取对数生长期 EC-9706 细胞，
分于 6 孔板，调整细胞密度至 1 × 105 个 /孔，随机分
为实验组及对照组。实验组分别在含 0． 01、0． 05、
0． 1、0． 2、0． 4 mg /mL MESLL培养液中培养，对照组
不予处理。实验组各浓度及对照组均设 6 个复孔。
干预 48 h吸取培养上清液，按照 NO 试剂盒说明书
测定 NO含量;另外收集细胞，按照 eNOS、cGMP 试
剂盒说明书测定细胞 eNOS、cGMP含量。
1． 5 统计学方法 采用 SPSS11． 5 统计软件，计量
资料以 珋x ± s 表示，结果比较采用单因素方差分析。
P ＜ 0． 05 为差异有统计学意义。
2 结果
2． 1 各组不同时间 EC-9706 细胞增殖抑制率比较
见表 1。
表 1 各组不同时间 EC-9706 细胞增殖抑制率比较(珔x ± s)
组别
细胞增殖抑制率(%)
24 h 48 h 72 h
CTX组 8．35 ±0．68 18．68 ±1．62 39．82 ±2．34
MESLL组
0． 01 mg/mL 7．15 ±0．82 16．37 ±1．45 31．78 ±3．12
0． 05 mg/mL 6．36 ±1．68 21．62 ±3．27# 35．04 ±4．76
0． 1 mg /mL 6．42 ±1．13 38．86 ±1．99* #△ 50．04 ±4．46* #△
0． 2 mg /mL 11．97 ±0．78* #△▲ 52．04 ±1．87* #△▲ 64．76 ±4．25* #△▲
0． 4 mg /mL 27．69 ±1．53* #△▲◆ 74．48 ±1．68* #△▲◆ 82．92 ±6．02* #△▲◆
注:与 CTX组比较，* P ＜ 0． 05;与同组 0． 01 mg /mL 比较，#P ＜
0． 05;与同组 0． 05 mg /mL 比较，△P ＜ 0． 05;与同组 0． 1 mg /mL 比
较，▲P ＜ 0． 05;与同组 0． 2 mg /mL比较，◆P ＜ 0． 05。
2． 2 MESLL 干预后细胞上清液 NO 活性及细胞
NOS、cGMP含量变化 见表 2。
表 2 MESLL干预后细胞上清液 NO活性及细胞 NOS、
cGMP含量变化(μmol /L，珔x ± s)
组别 NO NOS cGMP
对照组 6．88 ±0．13 9．32 ±0．14 0．30 ±0．01
实验组
0． 01 mg/mL 6．86 ±0．24 9．13 ±0．16 0．29 ±0．01
0． 05 mg/mL 6．72 ±0．35 9．09 ±0．10 0．28 ±0．01
0． 1 mg /mL 6．59 ±0．23 8．23 ±0．21* #△ 0．21 ±0．01* #△
0． 2 mg /mL 6．30 ±0．32* # 7．87 ±0．12* #△▲ 0．17 ±0．01* #△▲
0． 4 mg /mL 6．07 ±0．35* #△▲ 5．28 ±0．19* #△▲◆ 0．15 ±0．01* #△▲
注:与对照组比较，* P ＜ 0． 05;与同组 0． 01 mg /mL 比较，#P ＜
0． 05;与同组 0． 05 mg /mL 比较，△P ＜ 0． 05;与同组 0． 1 mg /mL 比
较，▲P ＜ 0． 05;与同组 0． 2 mg /mL 比较，◆P ＜ 0． 05。
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3 讨论
研究证实，粗叶木属植物具有祛风胜湿、活血止
痛等功效，主风寒湿痹、筋骨疼痛，民间用于治疗湿
热、黄疸等［7 ～ 9］，但其确切的有效成分并不明确。近
年应用现代科学技术从粗叶木属植物根和茎中分离
出多种具有抗炎、抗肿瘤效果的化合物，如长尾粗叶
木素、新倍半萜内酯等［10 ～ 12］。榄绿粗叶木为粗叶木
属中的一个变种，因此推测榄绿粗叶木的分离物可
能也具有抗炎、抗肿瘤等效果，但相关报道较少。本
研究结果显示，不同浓度 MESLL 均可抑制 EC-9706
细胞增殖，且其增殖抑制率随 MESLL浓度升高而增
加，与李斌等［12］报道相符。证实MESLL可抑制 EC-
9706 细胞增殖。
肿瘤的生长需要新生血管形成以获取血供。研
究发现，NO能促进肿瘤血管形成，并能促进内皮细
胞的黏附和增加血管通透性，因而能加速肿瘤的生
长和转移［13］。NO是由 NOS氧化 L-精氨酸产生的，
可通过质膜扩散到临近细胞与鸟苷酸环化酶结合，
催化产生 cGMP，激活蛋白激酶 G，在介导细胞内第
二信使 cGMP的信号转导中发挥重要作用。NO 生
物合成主要受 NOS活性的调节，NOS 包括神经元型
NOS、内皮型 NOS(eNOS)和诱导型 NOS 三种亚
型［14］。血管内皮细胞内 eNOS诱导产生的 NO可旁
分泌地进入血管平滑肌细胞，并与鸟苷酸环化酶结
合，增加其活性，使胞内 cGMP 浓度升高，松弛血管
平滑肌，从而降低血管张力，增加微循环通透性，有
利于基质成分的改变和内皮细胞迁移，促使肿瘤血
管生成［15］。因此，NO、NOS 和 cGMP 在肿瘤新生血
管形成中发挥重要调节作用［16，17］。本研究结果显
示，不同浓度 MESLL 作用后实验组 NO 活性及
NOS、cGMP含量均明显低于对照组，提示 MESLL的
抗肿瘤作用可能与抑制 NO /NOS-cGMP /通路，抑制
肿瘤血管形成有关，但其具体机制还有待进一步研
究证实。
参考文献:
［1］李国仁，戴建华，陈光辉．对我国食管癌外科的现状和前景的思
考［J］．食管外科电子杂志，2014，2(1):26-32．
［2］Lu P，Liang QD，Li Ｒ，et al． Effect of traditional chinese medi-
cine on survival and quality of life in patients with esophageal carci-
noma after esophagectomy［J］． Chin J Integr Med，2006，12(3) :
175-179．
［3］朱华．东亚粗叶木属(茜草科)植物的分布及其生物地理意义
［J］．云南植物研究，2008，30(3):308-314．
［4］李斌，张东明，罗永明． 长尾粗叶木根化学成分的研究［J］． 中
国中药杂志，2006，31(2):133-135．
［5］徐斌，谢志春，林新勤，等．罗浮粗叶木醇提物治疗鸭乙型肝炎
的实验研究［J］．现代预防医学，2010，37(14):2710-2712．
［6］朱华．中国粗叶木属(茜草科)植物的分类研究［J］． 植物分类
学报，1994，32(1):49-81．
［7］唐安球，周华富．食管癌治疗现状及进展［J］．医学综述，2014，
20(1):39-41．
［8］李学民，汤萨，彭秀青，等． 1973-2005 年手术治疗食管癌患者 5
年生存率变化分析［J］．肿瘤防治研究，2014，4(3):237-242．
［9］国家中医药管理局中华本草编委会．中华本草［M］．上海:上海
科学技术出版社，1999:446．
［10］Li B，Zhang DM，Luo YM，et al． Three new and antitumor anthra-
quinone glycosides from Lasianthus acuminatissimus MEＲＲ［J］．
Chem Pharm Bull (Tokyo)，2006，37(34) :297-300．
［11］李斌，张东明，罗永明．长尾粗叶木根一个新倍半萜内酯的分离
［J］．药学学报，2006，41(5):426-430．
［12］李斌，赖学文，徐向红，等．长尾粗叶木根中一个新蒽醌的分离
［J］．药学学报，2007，42(5):502-504．
［13］Tateya S，Ｒizzo N，Handa P，et al． Endothelial NO /cGMP /VASP
signaling attenuates Kupffer Cell activation and hepatic insulin re-
sistance induced by high-fat feeding［J］． Diabetes，2011，60
(11) :2792-2801．
［14］Lecarpentier E，Claes V，Timbely O，et al． Ｒole of both actin-my-
osin cross bridges and No-cGMP pathway modulators in the contrac-
tion and relaxation of human placental stem villi［J］． Placenta，
2013，34(12) :1163-1169．
［15］詹仁雅，潘剑．一氧化氮对肿瘤血管生成的作用［J］．中华神经
外科疾病研究杂志，2005，4(1):86-87．
［16］黄辉，吴斌，耿小平． 一氧化氮合酶与肝癌血管生成的关系
［J］．安徽卫生职业技术学院学报，2004，3(3):52-54．
［17］Tanaka H，Kijima H，Tokumga T，et al． Frequent expression of
inducible nitric oxide synthase in esophageal squanous cell careino-
mas［J］． Int J Oncol，1999，14(6) :1069-1073．
(收稿日期:2015-04-18)
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山东医药 2015 年第 55 卷第 40 期