全 文 ：第 29卷 ,第 2期 光　谱　实　验　室 Vol . 2 9 , No . 2
2 0 1 2年 3月 Chinese Journal of Spectroscopy Laboratory March , 2 0 1 2
正交设计优选掌裂草葡萄中总黄酮的
提取工艺①
① 榆林市科技局重点项目 ( 9760609)
② 联系人 ,手机: ( 0) 13891279937; E-mail: dufy0160@ 163. com
作者简介:杜芳艳 ( 1960— ) ,女 ,陕西省米脂县人 ,教授 ,主要从事天然产物研究工作。
收稿日期: 2011-05-25;接受日期: 2011-06-24
杜芳艳②　邓保炜　张智芳　谢春平
(榆林学院能源化工研究中心　陕西省榆林市西沙崇文路 2号　 719000)
摘　要　以芦丁为标样 ,采用荧光光度法测定掌裂草葡萄中总黄酮含量。 以总黄酮提取率为考察指
标 ,采用正交设计方法优选最佳提取工艺。 结果显示: 其优选工艺为: 药材加 15倍量的 60%乙醇 ,在 60℃
下回流提取 2. 0h ,重复提取 3次 ,总黄酮提取率为 35. 99%。
关键词　掌裂草葡萄 ;总黄酮 ;正交设计
中图分类号: R284. 2; O657. 32　文献标识码: B　文章编号: 1004-8138( 2012) 02-0875-03
1　引言
葡萄科蛇葡萄属植物 ,多为民间中草药 ,具有活血散瘀、消炎止血、清热解毒等功效 ,用于治疗
风湿脾痛、无名肿毒、骨髓炎等疾病 [ 1]。许多研究表明大多数蛇葡萄属植物的茎叶中含有丰富的黄
酮类化合物 ,有的含量高达 43. 4%— 44%左右 [2 ] ,并且具有广泛的生理活性 ,可清除氧自由基 ,抑
制机体内的氧化损伤 ;可调节人体免疫机能 ;可用于防治糖尿病、动脉粥样硬化、高血脂等症 ;同时
具有保肝护肝、抗血栓、抗病毒、抗纤维化、抗肿瘤、止咳去痰 ,阻断艾滋病病毒感染、抗致突变、抗过
敏等多种作用 [3— 5 ]。 因此有较高的食用和医用价值 ,具有广阔的开发应用前景。 掌裂草葡萄
[ ( Ampelopsis aconit ifolia Bge. v ar. palm iloba( Carr. ) ]俗名:乌头叶蛇葡萄 ,是葡萄科蛇葡萄属木质
藤本植物。生于向阳山坡、路边。分布于东北、华北、内蒙古、江苏、甘肃、陕西及四川等省区。根药
用 ,有活血散瘀、消炎止痛的功效 [6 ]。关于掌裂草葡萄中黄酮类化合物的研究尚未见报道。为探索掌
裂草葡萄中总黄酮提取工艺 ,本实验以乙醇为萃取剂 ,以总黄酮提取率为考察指标 ,采用正交设计
法 ,对掌裂草葡萄中总黄酮提取工艺进行了研究。
2　实验部分
2. 1　仪器与试剂
ESJ60-4型电子分析天平 (上海精密科学仪器有限公司 ) ; HH-2型电热恒温水浴锅 (北京科伟
永兴仪器有限公司 ) ; RF-5301PC型荧光分光光度计 (日本岛津公司 )。 101-1型鼓风干燥烘箱 (上海
一恒科学仪器有限公司 ) ; FSJ-114型多功能粉碎机 (广东美的家电有限公司 )。
掌裂草葡萄嫩茎叶:采于陕西省米脂县山区内 6月份植株 (经文献鉴定为原植物 [6 ] ) ,取其嫩茎
叶洗净 ,将供试材料进行去杂处理 ,用水漂洗并沥干水分 ;室温阴干 ,备用。
芦丁标准品 (中国药品生物制品检定所 ,光谱纯 ) ;其余试剂均为分析纯。 实验用水为二次蒸馏
水。
2. 2　实验方法
2. 2. 1　提取工艺操作
取掌裂草葡萄幼嫩干叶 ,用水洗净 , 60± 10℃鼓风干燥 48h,冷却后粉碎 ,过 60目筛 ,称取 30g
干燥的掌裂草葡萄粉末 ,加 150mL石油醚加热回流 30min,弃去石油醚提取液 ,并于温水浴中挥干
残留石油醚 ,真空干燥。准确称取掌裂草葡萄粉 5. 00g,以料液比为 1∶ 15( m∶ V)的 60%乙醇溶液
为溶剂 ,于 60℃回流提取 2. 0h,提取液过滤 ,重复提取 3次 ,合并提取液 ,将提取液减压浓缩 ,真空
干燥 ,得黄色固体 ,准确称取 1. 0000g提取物 ,用 60%的乙醇溶液配制成 250mL样品溶液 ,储存备
用。
2. 2. 2　校准曲线
将芦丁标准品于 120℃下干燥至恒重 ,准确称取 0. 0104g芦丁标准品于小烧杯中 ,用 60%乙醇
溶解 ,转入 100mL容量瓶中 ,用 60%乙醇定容至 100mL,得浓度为 0. 1040mg /mL的芦丁标准溶
液。 参照文献 [7 ]方法 ,准确吸取芦丁标准液 0、 0. 20、 0. 40、 0. 60、 0. 80、 1. 00mL于 10. mL容量瓶
中 ,加入 1mL HAc-NaAc缓冲溶液 ( pH 4. 0) , 5% AlCl3溶液 2. 5mL,用 60%乙醇定容至刻度 ,静置
20min,在激发光谱通带 3nm和发射光谱通带宽为 5. 0nm ,激发波长为λex= 436nm,发射波长
λem= 483nm条件下 ,测定芦丁标准工作液的荧光强度 ,以荧光强度对应的浓度绘制校准曲线 ,并进
行线性回归 ,求得线性回归方程和相关系数分别为: y= 1. 9318x+ 0. 2698, r= 0. 9991(式中:
y—— 荧光强度 , x—— 芦丁溶液浓度 , mg /mL) ,在 1. 68× 10- 9— 3. 86× 10- 5mol /L范围内具有良
好的线性关系。方法的检出限为 1. 30× 10- 9mol /L。
2. 2. 3　样品中总黄酮的测定
准确吸取 0. 10mL样品溶液 ,按 2. 2. 2方法 ,测定样品溶液的荧光强度 ,由线性方程求得总黄
酮含量。
2. 2. 4　正交试验优化提取工艺条件
采用单因素轮换试验 ,考察提取温度、提取时间、溶剂及其浓度、料液比和提取次数对总黄酮提
取率的影响 ,在此基础上 ,确定提取温度 ( A )、提取时间 (B ) 、乙醇体积分数 (C )和料液比 (D )为因
素 ,采用 L 9 ( 34 )正交试验对提取条件进行优化 ,因素水平见表 1。
表 1　L9 ( 34 )正交试验因素水平
水平 因素
A (℃ ) B (h ) C (% ) D ( g /m L)
1 40 2. 0 50 1∶ 10
2 50 2. 5 60 1∶ 15
3 60 3. 0 70 1∶ 20
3　结果与讨论
以总黄酮提取率为考察指标 ,正交试验结果见表 2。由表 2极差值显示 ,各因素对提取率的影
响顺序为: C> A> D> B ,即乙醇体积分数> 提取温度> 料液比> 提取时间 ,其中最佳提取工艺条
件为 A3B1C2D2 ,即提取时间 2. 0h、料液比 1∶ 15( g /mL) 、提取温度 60℃、乙醇体积分数 60% 。准确
称取 6份干燥的掌裂草葡萄各 10g ,按最佳工艺条件平行操作 ,每份重复提取 3次 ,计算总黄酮提
取率 (总黄酮提取率= 总黄酮质量浓度×定容体积×提取物质量 /样品质量× 100% )。结果显示 ,在
最佳工艺条件下提取物中总黄酮提取率均高于其他各正交试验值 ,总黄酮平均提取率为 35. 99%。
876 光谱实验室 第 29卷
表 2　正交试验结果
试验号 A
(℃ )
B
( h)
C
(% )
D
( g /mL)
总黄酮提取率 w
(% )
1 40 2. 0 50 1∶ 10 29. 67
2 50 2. 0 60 1∶ 15 33. 91
3 60 2. 0 70 1∶ 20 33. 96
4 50 2. 5 70 1∶ 10 31. 53
5 60 2. 5 50 1∶ 15 32. 86
6 40 2. 5 60 1∶ 20 32. 46
7 60 3. 0 60 1∶ 10 32. 87
8 40 3. 0 70 1∶ 15 32. 08
9 50 3. 0 50 1∶ 20 30. 06
k1 31. 40 32. 51 30. 86 31. 36
k2 31. 83 32. 28 33. 08 32. 95
k3 33. 23 31. 67 32. 52 32. 15
R 1. 83 0. 84 2. 22 1. 59
4　结论
掌裂草葡萄茎叶中含有丰富的黄酮类物质 ,通过石油醚预先处理除去叶绿素和脂溶性物质。总
黄酮的最佳提取工艺条件是:提取温度 60℃ ,乙醇体积分数 60% ,料液比 1∶ 15( g /mL) ,提取时间
2. 0h,重复提取 3次。该方法简单 ,提取得率高。对掌裂草葡萄这种野生植物进行综合开发利用具
有理论指导意义。
参考文献
[1 ]陈科力 ,张秀明 .国产蛇葡萄属药用植物的开发前景 [ J ].中药材 , 1999, 22( 2): 58— 60.
[2 ]何桂霞 ,裴刚 ,周天达等 .显齿蛇葡萄中总黄酮和二氢杨梅素的含量测定 [ J] .中国中药杂志 , 2000, 25( 7): 423— 425.
[3 ]杨振淮 ,郭洁文 ,潘竞锵等 .蛇葡萄属植物抗肿瘤、抗氧化、护肝和调血脂的药理作用研究 [ J].中医研究 , 2004, 17( 4): 57— 58.
[4 ]张琼光 ,丁英平 ,陈科力等 .蛇葡萄属植物药理学研究概况 [ J] .时珍国医国药 , 2005, 16( 2): 151— 152.
[5 ]董倩倩 ,陈立峰 .二氢杨梅素药理研究进展 [ J ].中南药学 , 2005, 3( 5) : 295— 298.
[6 ]中国科学院植物研究所 .中国高等植物图鉴 (补编第二册 ) [M ] .北京:科学出版社 , 1983. 349— 356.
[7 ]张敏 ,曹庸 ,唐纯翼 . Al3+ -芦丁二元络合物荧光光度法测定银杏叶中总黄酮的含量 [ J] .分析科学学报 , 2005, 12( 2): 188— 190.
Optimization of Extracting Technology in Total Fl avonoids
fromAmpelopsis aconit ifolia Bge. var. palmiloba( Carr. )
by Orthogonal Design
DU Fang-Yan　 DENG Bao-Wei　 ZHANG Zhi-Fang　 XIE Chun-Ping
( Energ y and Chemical Research Center of Yulin College, Yulin, Shaanxi 719000,P . R.Ch ina )
Abstract　 The content of total f lav onoids in Ampelopsis aconitifolia Bge. v ar. palmiloba ( Carr. )
w as determined by fluorescence spect ropho tometry wi th rutin as standard sample. The optimal
ex traction technology was optimized by o rthogonal desigh w ith ex t raction rate of to tal f lav onoids as
investigation index. The results show ed that the optimal technolog y was as follow s: herbs plus
15 times of 60% ethanol, under ref lux ex t raction at 60℃ fo r 2. 0h, ex t raction times of 3 and the
ex traction ra te of 35. 99% .
Key words　 Ampelopsis aconiti fol ia Bge. var. palmiloba ( Carr. ) ; To tal Flavonoids; Orthogonal
Design
877第 2期 杜芳艳等:正交设计优选掌裂草葡萄中总黄酮的提取工艺