全 文 ：Ｒesearch Paper 研究报告
微生物学报 Acta Microbiologica Sinica
54(7) :770 － 777;4 July 2014
ISSN 0001 － 6209;CN 11 － 1995 /Q
http:/ / journals． im． ac． cn /actamicrocn
doi:10. 13343 / j． cnki． wsxb． 2014. 07. 007
基金项目:云南省中青年学术技术带头人后备人才培养项目(2010CI016)
* 通信作者。Tel /Fax:+ 86 0871-65822842;E-mail:22825818@ qq． com
作者简介:王毅(1981 －) ，男，四川省广安市人，博士，助理研究员，从事植物及真菌分子生物学研究。E-mail:dog_608@ hotmail． com
收稿日期:收稿日期:2013-09-27;修回日期:2014-01-15
长松萝中一个聚酮合酶基因簇的克隆和鉴定
王毅1，周旭1，许宰铣2，王娟1*
1云南省林业科学院，国家林业局重点开放性实验室，云南珍稀濒特森林植物繁育和保护重点实验室，云南 昆明 650204
2韩国国立顺天大学韩国地衣研究所，顺天 540742，韩国
摘要:【目的】探索药用地衣长松萝(Usnea longissima Ach)聚酮化合物的生物合成基因簇，克隆聚酮合酶
(PKS)基因并分析其功能。【方法】以长松萝地衣型真菌为材料，通过巢氏 PCＲ 获得聚酮合酶基因片段和
原位杂交筛选基因组文库获得聚酮合酶基因及相邻基因簇。并对获得聚酮合酶进行分子系统进化分析和基
因表达分析。【结果】获得药用地衣长松萝中的编码聚酮合酶基因 UlPKS5 的全长序列以及相邻修饰基因
β-内酰胺酶和脱水酶。聚酮合酶 UlPKS5 含有酮体合成酶(KS) ，酰基转移酶(AT) ，产物模板(PT)以及酰基
载体蛋白(ACP)结构域。分子系统进化分析显示 UlPKS5 属于非还原型聚酮合酶中第五组，与蒽醌类化合
物生物合成相关。通过半定量 ＲT-PCＲ 分析表明山梨醇(10%)和蔗糖(2%和 10%)能够强烈诱导 UlPKS5
基因表达。【结论】聚酮合酶(UlPKS5)及相邻修饰基因 β-内酰胺酶和脱水酶与长松萝中蒽醌类化合物生物
合成相关。
关键词:地衣型真菌，长松萝，聚酮合酶，半定量 PCＲ
中图分类号::Q814 文章编号:0001-6209(2014)07-0770-08
聚酮化合物(polyketides)是一类庞大的次级代
谢家族，拥有 7000 多种不同结构的化合物［1］，目前，
超过 20 种聚酮类化合物已成为商业化的药物［2］。
聚酮化合物是通过聚酮合酶(polyketide synthase，
PKS)催化形成的，其催化过程类似于脂肪酸合酶
(FAS)催化的脂肪酸生物合成，即通过酰基-CoA 活
化的底物之间的重复脱羧缩合而合成［3 － 4］。真菌聚
酮合酶主要属于重复 I 型 PKS。它常包括酮体合成
酶 (keto synthase， KS)、酰 基 转 移 酶 (acyltr
ansferase，AT)、脱水酶(dehydratase，DH)、甲基转
移酶(methyl transferase，MeT)、烯脂酰还原酶(keto
reductase，EＲ)、酮体还原酶(enoyl reductase，KＲ)、
酰基载体蛋白(acyl carier protein，ACP)和环化酶
(cyclase，CYC)等结构域。真菌 I 型 PKS 根据其拥
有的结构域不同可以分为非还原型(non-reducing，
NＲ-PKS) ，部分还原型(partially-reducing，PＲ-PKS)
和 高 度 还 原 型 (highly-reducing PKS， HＲ-
PKS)［1，5 － 6］。对于真菌非还原型 PKS，李嫣然等根
据产物模板结构域(PT domain)生物信息学分析结
果将其为 5 个组。产物模板结构域决定着聚酮化合
物的链长和环化方式，因此也决定了最终化合物的
基本结构。5 组聚酮合酶的功能分别为:第 1 组的
聚酮合酶合成四酮体(tetraketide)骨架后，通过 C2-
C7 环化形成一个芳香环;第 2 组的聚酮合酶合成五
王毅等:长松萝中一个聚酮合酶基因簇的克隆和鉴定． /微生物学报(2014)54(7)
酮体(pentaketide)后，再通过 C2-C7 醇醛缩合和 TE
结构域的环化作用形成 2 个芳香环;其余 3 个组都
是合成长链的聚酮类化合物，第 3 组的聚酮合酶通
过 C2-C7 环化生产第 1 个芳香环;第 4 组的聚酮合
酶通过 C4-C9 或 C2-C11 生产芳香环;第 5 组的聚酮
合酶则通过 C6-C11 或 C4-C13 生产芳香环，第 5 组
的聚酮合酶通常合成蒽醌类化合物［7］。对 PKS 基
因座分析发现，真菌中的 PKS基因通常与 PKS 后修
饰过程的编码基因、调节基因及抗性基因成簇存
在［5，8］。
地衣是由真菌和藻类或蓝细菌结合在一起而构
成的共生复合体［9 － 10］。地衣产物具有抗菌、抗肿
瘤、抗病毒、抗辐射、抗氧化等独特的生物活性，在天
然产物药用开发领域具有广阔应用前景［11 － 13］。然
而，由于地衣在自然界中生长缓慢，因此对其次生代
谢产物生物合成进行分析面临巨大困难，同时也很
难获得大量的次生代谢产物［14］，更重要的是在人工
培养条件下获得具有生物活性的地衣产物也是一个
巨大的挑战。因此 Miao等在 2001 年提出利用异源
表达的方式获得地衣产物的设想［15］。地衣次生代
谢产物中大多数独特的化合物如缩酚酸，缩酚酸环
醚，二苯骈呋喃都属于聚酮化合物［16］。因此，成功
分离获得聚酮合酶基因是异源表达获得地衣产物的
第一步。虽然目前已经从地衣或地衣型真菌中分离
得到一些非还原型的聚酮合酶，但是并没有分离得
到非还原型第五组类型的聚酮合酶。
1 材料和方法
1. 1 材料
长松萝(Usnea longissima)地衣型真菌由韩国地
衣资源中心提供。地衣型真菌于 MYA(麦芽糖提取
物 20 g，酵母提取物 2 g，琼脂 8 g，用水定容至 1 L)
培养基上 15℃培养，并定期转接。
1. 2 KS结构域扩增
收集长松萝地衣型真菌菌丝团，采用植物提取
试剂盒提取基因组 DNA。利用在线兼并引物设计
软 件 GeneFisher (http:/ /bibiserv． techfak． uni-
bielefeld． de /genefisher2 /) ，设计获得兼并引物(KS3:
5-GGNKCNTCBYAYMVＲTCNATGAA-3;KS5:5-GGＲ
TGVGGNCCＲATYTCVAYCCA-3) ，以长松萝地衣型
真菌 DNA为模板进行巢式 PCＲ 扩增，将 PCＲ 产物
链接到克隆载体 pEASY-T3 上后，筛选出含有插入
片段的克隆，并对插入片段进行测序。
1. 3 基因组文库筛选
根据获得的 KS 结构域基因片段设计特异引物
( FKS3526: 5-CGCAGAGTCTTAGTGCCCTA-3;
ＲKS3526:5-CACACCACAACCGTTCATAC-3) ，用
DIG-High Prime Laboling Mix 试剂盒制备带有 DIG
标记的探针。并用 CopyControlTM HTP Fosmid 文库
构建试剂盒构建长松萝地衣型真菌基因组文库。将
长松萝地衣型真菌基因组文库克隆转移并固定在尼
龙膜上后，利用 DIG 特异探针在 42℃杂交，最后用
Digoxigenin检测试剂盒检测杂交结果，获得阳性
克隆。
1. 4 DNA测序与分析
阳性克隆被送到测序公司 Genotech Co． Ltd
(Seoul，South Korea)测序。利用 FGENESH软件［17］
分析获得潜在的阅读框后，用 BLAST 软件对其可能
功能进行预测，并用 CDD-Search /PＲS-BLAST 软件
对保守结构域进行分析。最后，将获得的长松萝
PKS与来自 GenBank 里的 31 条真菌非还原型聚酮
合酶进行比对，多序列的比对由 ClusterW 程序完
成。并用 MEGA 4. 0. 2 软件的邻位相连算法
(Neighbor-joining)1000 次自检举(boot straping)绘
制出进化树图像。
1. 5 长松萝地衣型真菌总 ＲNA 的提取与 cDNA
的合成
将收获的地衣型真菌长松萝菌丝团分别接种在
以 MYA为基本培养基含有不同碳氮源添加物的培
养基上。其中，碳源包括:肌糖，甘露醇，山梨醇，蔗
糖，葡萄糖和果糖，按照 2%和 10%(W/V)2 个不同
浓度分别加入基本培养基 MYA 中。氮源包括:谷
氨酸，天冬酰胺，甘氨酸和丙氨酸，按照 0. 2%和 1%
(W/V)两个不同浓度分别加入基本培养基 MYA
中。15℃培养 2 个月后，收获菌丝团。
按照 ＲNeasy Plant Mini Kit (Qiagen)的说明书
分别提取不同培养基上的长松萝地衣型真菌总
ＲNA，并用琼脂糖凝胶电泳检测 ＲNA 质量后，将
ＲNA 保存在 － 80℃超低温冰箱。cDNA 合成参照
Prime Script 1st Stand cDNA Synchesis 试剂盒(宝生
物工程有限公司，大连)的说明书操作，并将 cDNA
保存在 － 20℃ 冰箱。以特异引物(FKS3526 和
ＲKS3526)检测聚酮合酶 UlPKS5 基因表达情况。根
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Yi Wang et al． /Acta Microbiologica Sinica(2014)54(7)
据基因表达实验结果，选择 UlPKS5 表达的 cDNA为
模板，以特异引物(UlPKS5-F0:5-ATGCGCGGGA
GCCGAAATGA-3;UlPKS5-Ｒ0: 5-CTAGCTGTAAT
ATTCTTCCA3-3)扩增获得 UlPKS5 全长 cDNA。
2 结果
2. 1 KS结构域的克隆
利用兼并引物 KS3 和 KS5 获得大约 700 bp 的
扩增片段(图 1) ，将片段回收后连接到 pEASY-T3
载体上后，选取 6 个克隆进行测序。对测序结果分
析后，发现其中克隆 KS3526 含有 KS 结构域基因片
段。根据 KS3526 基因片段序列设计一对新的特异
引物(FKS3526 和 ＲKS3526)。将所得 740 bp 的
DNA序列经 NCBI 中的 blastx 搜索，结果显示该片
段的编码产物与 Talaromyces stipitatus 的聚酮合酶
GenBank accession No． XP_002482968. 1)的相应片
段具有的 66%的相似性。
图 1． 利用兼并引物 KS3 和 KS5 扩增长松萝地衣型
真菌聚酮合酶 KS结构域基因片段
Figure 1． Amplified KS domain fragment of U． longissima with
degenerate primers(KS3 and KS5)． M:DNA marker;KS:
PCＲ product．
2. 2 结构域分析
利用带有 DIG 标记的特异探针筛选基因组文
库，如图所示:蓝色点为阳性克隆，将此克隆命名为
FoKS3526 (图 2)。将 FoKS3526 测序后，利用
FGENESH 软件分析得到 4 个阅读框。利用
BLASTN在线软件分析预测。
4 个基因为:非还原型聚酮合酶(UlPKS5) ，β-内
酰胺酶，脱水酶和一个保守蛋白 UlPKS5 全长
图 2 基因文库筛选结果
Figure 2． Colony hybridization of genome library of U．
longissima．
5698 bp，通过对比 DNA 和 cDNA 序列发现 UlPKS5
含有 4 个内含子(从起始密码子开始依次为:430 －
487、788 － 840、1946 － 2006、4363 － 4431)。5 个外
显子的拼接总长为 5463 bp，可编码 1820 个氨基酸
残基(GenBank登录号为 JX232187)。将 UlPKS5 氨
基酸序列与 NCBI 蛋白数据库比对发现，UlPKS5 构
巢曲霉(Aspergillus nidulans)的聚酮合成酶 AptA
(GenBank 登录号为 XP_657754. 1)具有 70%的相
似性。AptA被 Chiang等研究者通过缺失突变确定
其参与构巢曲霉中 monodictyphenone 和大黄素的生
物合成［18］。将 UlPKS5 与其它聚酮合酶对应的结构
域分析发现 UlPKS5 含有 5 个结构域，其活性位点保
守残基分别为酮体合成酶结构域(DTACSSSL) ，酰
基转移酶结构域(IGHSLGE) ，产物模板结构域
(GHSMNGCGVVTSS) ，酰 基 载 体 蛋 白 结 构 域
(GIDSLMSLV) (图 3)。
2. 3 分子系统进化分析
利用 MEGA自带的 ClusterW程序对 UlPKS5 和
其他 31 条非还原型聚酮合酶的模板产物结构域进
行多序列比对后，利用邻位相连算法绘制出进化树
图像。分析结果显示 UlPKS5 和构巢曲霉 AptA 及
土曲霉聚 ACAS等聚酮合酶形成独立分支，即非还
原型聚酮合酶第五组［7］。(图 4)在第 5 组中的聚酮
合酶通过 C6-C11 或 C4-C13 生产芳香环，通常合成
蒽醌类化合物，比如构巢曲霉 AptA 参与了
asperthecin的生物合成［18］，土曲霉 ACAS 参与了多
个蒽醌类化合物的生物合成［19］。
2. 4 不同碳氮源添加物对 UlPKS5 基因表达影响
将长松萝地衣型真菌接种在不同碳氮源添加物
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图 3． UlPKS5 结构域活性位点分析
Figure 3． Alignment of Usnea longissima predicted polyketide synthase(UlPKS5)active regions with five closely related fungal PKSs．
TSTIP:Talaromyces stipitatus PKS (XP_002482968. 1) ，ATEＲＲ:Aspergillus terreusPKS (XP_001217072. 1) ，AFUMI:Aspergillus
fumigatusPKS4 (XP_751377. 1) ，PMAＲN:Penicillium marneffei PKS (XP_002144865. 1)ANIDU:Aspergillus nidulans PKS (XP
_657754. 1)． Amino acid residues conserved among all sequences are marked with an asterisk;variability between two amino acid
residues is marked with a dot． Highlighted regions indicate the catalytic amino acid residue in the active site．
的 MYA培养基上，15℃培养 2 个月后，提取 ＲNA后
反转录成 cDNA，以特异引物检测 UlPKS5 的表达情
况，同时以微管蛋白为阳性对照。ＲT-PCＲ 结果显
示 UlPKS5 基因在基本 MYA 培养基上并不表达，在
MYA中添加有谷氨酸，天冬酰胺，甘氨酸，丙氨酸，
肌糖，甘露醇，葡萄糖，果糖的培养基上有微弱表达。
浓度为 10%山梨醇能够诱导 UlPKS5 强烈表达，而
浓度为 2%和 10%的蔗糖都能够诱导 UlPKS5 强烈
表达(图 5)。
3 讨论
长松萝(U． longissima A ch)为地衣类松萝科
Usneaceae松萝属植物。在亚洲，欧洲和北美地区被
长期作为当地的民族药使用［21 － 22］。目前，已经从长
松萝中提出许多具有抗癌、抗炎症、抗菌等生物活性
的化合物，比如松萝酸 (Usnic acid) ，拉马酸
(Ｒamalic acid ) ，巴 尔 巴 地 衣 酸 (Barbat
icacid)［23 － 25］。如同其他地衣一样，长松萝也是真菌
377
Yi Wang et al． /Acta Microbiologica Sinica(2014)54(7)
图 4． UlPKS5 与其他 31 条非还原型聚酮合酶分子系统进化分析
Figure 4． Phylogenetic analysis of UlPKS5 and other 31 non-reducing polyketide synthase． The alignment was done by using Clustal W and
analyzed with the minimum evolution (ME)method embedded in the MEGA 4. 0. 2 program． A phylogenetic tree with 1000 bootstrap
replicates was generated and the clade number is their bootstrap values． GenBank accession numbers of fungal PKS used in phylogenetic
analysis were marked in brackets Usnea longissima UlPKS5 clade obtained is marked in bold．
和藻类的共生复合体。在野外，长松萝中除了有长
松萝地衣型真菌和藻类，还有一些非地衣型真菌附
着在长松萝地衣体上，比如地衣内生真菌［26］。因此
我们利用藻菌分离技术获得长松萝的地衣型真菌，
并以长松萝地衣型真菌作为研究材料探讨长松萝聚
酮类化合物的生物合成。
本文利用兼并引物扩增获得 KS 结构域基因片
段，通过 DIG标记后筛选基因组文库，从长松萝地衣
型真菌中获得全长的聚酮合酶基因 UlPKS5以及相邻
基因 β-内酰胺酶和脱水酶。结构域分析显示 UlPKS5
含有酮体合成酶(KS) ，酰基转移酶(AT) ，产物模板
(PT)以及酰基载体蛋白结构域(ACP)。通过分子系
统进化分析显示 UlPKS5属于非还原型聚酮合酶中第
五组。第五组的聚酮合酶与蒽醌类化合物合成相
关［7］。通过比较构巢曲霉中 Monodictyphenone 和
Asperthecin生物合成基因簇和土曲霉中 Atrochrysone
生物合成基因簇(图 6) ，我们发现 UlPKS5 与以上 3
种蒽醌类生物合成基因簇都拥有一个含有 KS-AT-
PT-ACP结构域的聚酮合酶基因和一个 β-内酰胺酶
以及其他修饰基因。在类似的基因簇中，聚酮合酶负
责合成聚酮前体，但由于此类聚酮合酶并没有类似于
硫酯酶的结构域，因此聚酮前体产物由 β-内酰胺酶
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王毅等:长松萝中一个聚酮合酶基因簇的克隆和鉴定． /微生物学报(2014)54(7)
图 5． UlPKS5 在不同氮碳源添加物的培养基上基因表达情况
Figure 5． Gene expression of UlPKS5 with different carbon source and amino acid． A:different carbon source，CK:MYA basic medium，2Ino:2%
inositol，10Ino:10% inositol，2Man:2% mannitol，10Man:10% mannitol，2Sor:2% sorbitol，10Sor:10% sorbitol，2Sur:2% sucrose，10Sur:10%
sucrose，2Glu:2% glucose，10Glu:10% glucose，2Fru:2% fructose，10Fru:10% fructose;B:different amino acid，0. 2Gmi:0. 2% glutamine，1Gmi:
1% glutamine，0. 2Asp:0. 2% asparagine，1Asp:1% asparagine，0. 2Gly:0. 2% glycine，1Gly:1% glycine，0. 2Ala:0. 2% alanine，1Ala:1% alanine．
图 6． UlPKS5 基因簇与已知真菌蒽酮类化合物生物合成基因簇比较
Figure 6． UlPKS5 gene cluster was compared with known anthraquinone biosynthesis gene cluster in fungi．
从聚酮合酶上卸载下来［20］。
由于之前文献报道，渗透压和不同碳氮添加物
会影响地衣型真菌的聚酮类次生代谢物的产
生［27 － 28］。因此我们利用 ＲT-PCＲ 检测 UlPKS5 在
不同碳氮源添加物培养基上表达情况，实验结果显
示 UlPKS5 在 MYA 并不表达，在大多数添加物中也
都处于微弱表达的情况，只有在添加山梨醇(10%)
和蔗糖(2%和 10%)的培养基上能够大量表达。这
说明 UlPKS5 的表达受到培养基成分的影响。传统
的地衣化学分析显示蒽醌类化合物并不是长松萝的
主要产物，因此直到 2009 年，冯洁等才第一次从 9
kg的干燥长松萝粗粉中提取得到与大黄素类似的
蒽醌化合物长松萝酮(10 mg)［29］。结合 UlPKS5 表
达实验结果，说明大多数情况长松萝地衣型真菌中
蒽醌类生物合成基因处于弱表达或者沉默的状态。
本实验从长松萝地衣型真菌中获得全长的聚酮
577
Yi Wang et al． /Acta Microbiologica Sinica(2014)54(7)
合酶基因 UlPKS5 以及相邻基因，同时利用 ＲT-PCＲ
检测 UlPKS5 在不同碳氮源添加物的培养基上表达
情况，为进一步探讨长松萝蒽醌类物质生物合成奠
定基础，同时也为异源表达地衣产物提供必要材料。
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Isolation and charcterizaiton of a polyketide synthase gene
cluster from Usnea longissima
Yi Wang1，Xu Zhou1，Jae-Seoun Hur2，Juan Wang1*
1Conservation of Ｒare，Endangered ＆ Endemic Forest Plants，Public Key Laboratory of the State Forestry Administration;
Yunnan Provincial Key Laboratory of Cultivation and Exploitation of Forest Plants;Yunnan Academy of Forestry，Kunming
650204，Yunnan Province，China
2Korean Lichen Ｒesearch Institute，Sunchon National University，Sunchon 540742，Ｒepublic of Korea
Abstract:［Objective］To isolate polyketide synthase (PKS)gene from medicinal Usnea longissima lichen forming fungi，
and identify the function of obtained PKS． ［Methods］We used Usnea． longissima lichen forming fungi to isolate PKS
gene by nested PCＲ using degenerate primers and screening a Fosimid genomic library． MEGA 4. 0. 2 program was used
for phylogenetic analysis and ＲT-PCＲ was used to detect gene expression． ［Ｒesults］ We obtained a gene cluster
including non-reducing PKS (UlPKS5) ，putative β-lactamase and putative dehydratase from Usnea longissima lichen
forming fungi． UlPKS5 contained ketosynthase(KS) ，acyl transferase (AT) ，product template (PT)and acyl carrier
protein (ACP)domain． Phylogenetic analysis shows that UlPKS5 belonged to non-reducing PKS group V，which involved
anthraquinone biosynthesis． ＲT-PCＲ analyses reveal that the expression of UlPKS5 was up-regulated by sucrose (2% and
10%)and sorbitol (10%)． ［Conclusion］PKS(UlPKS5) ，putative β-lactamase and putative dehydratase were related
with anthraquinone biosynthesis in U． longissima．
Keywords:lichen forming fungi，Usnea longissima，polyketide synthase，ＲT-PCＲ
(本文责编:张晓丽)
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* Corresponding author． Tel /Fax:+ 86-871-65822842;E-mail:22825818@ qq． com
Ｒeceived:27 September 2013 /Ｒevised:15 January 2014
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